细菌内毒素检查法

细菌内毒素检查法

1 目的

该SOP用来判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。

2适用范围

该SOP适用于《中国兽药典》要求检查该项的药品和适合《中国兽药典》要求的其它品种的药品的细菌内毒素检查。

3职责

进行该项检验的检验员应该按该SOP进行检验，检测室主任负责监督该SOP的正确执行。

4检验

4.1 技术依据及原理

本法系用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应即内毒素在二价阳离子的参与下，作用于鲎血凝集酶系统而发生的一系列酶联反应，最后形成凝胶，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。

4.1.1 鲎试剂灵敏度复核试验项的目的不仅是考查鲎试剂和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确和实验条件是否符合规定。因此要求每个实验室在将一批新的鲎试剂用于干扰试验或供试品细菌内毒素检查前应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

4.1.2 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。

4.1.3检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。

4.2注意事项

4.2.1实验前，须用肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒

4.2.2实验时，须戴工作帽和口罩。尤其在配制洗液和洗涤玻璃器皿时一定要戴手套、工作帽和口罩。

4.2.3试验应在洁净室或洁净工作台内进行。

4.2.4用移液管或刻度吸管等吸取样品时，须使用洗耳球，勿用嘴吸、吹，防止唾液溅入。也可使用加样器等其它方法。

4.2.5 注意所用鲎试剂的批号、有效期、规格、灵敏度等。

4.2.6进行干扰实验时，标准对照和供试品阳性对照（含供试品的内毒素溶液）应同时进行。

4.2.7在进行灵敏度复核、干扰试验和供试品内毒素检查时，各个实验所要求的对照应同时进行，并在有效的条件下才能进行计算和判断。

4.3材料、仪器、试剂的准备及基本要求

4.3.1天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。

4.3.2电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。

4.3.3恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37℃±1℃保持一小时。

4.3.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。

4.3.5 旋涡混合器

4.3.6 鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。

4.3.7细菌内毒素国家标准品（NSE），细菌内毒素工作标准品（WSE）。

4.3.8 细菌内毒素检查用水（BET水）系指与灵敏度为0.03Eu/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37℃±1℃条件下不产生凝集反应的灭菌注射用水。

4.3.9实验用具移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（10³75mm）、三角瓶、小试管（16³100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮。所用玻璃器皿须经250℃干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。

4.3.10 试剂 75%乙醇、纯化水、铬酸洗液。

4.4 检验步骤

4.4.1试验准备

4.4.1.1洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。

4.4.1.2玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜纯化水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。

4.4.1.3 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始记时，须干烤至少1小时。达到规定时间后，关断电源。待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可在两周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。

4.4.2鲎试剂灵敏度复核

4.4.2.1内毒素标准溶液的制备

4.4.2.1.1 取NSE或WSE一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。

4.4.2.1.2按标准品使用说明书用移液管加入规定量的BET水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒（详细过程请参见使用说明书）。若为NSE，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装并保存。

例如使用NSE（内毒素含量为9000EU/支）时的方法如下：

复溶：准确吸取BET水1ml加入NSE的安瓿内，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器混合15分钟，即为9000EU/ml内毒标标准溶液。

稀释：取0.3ml内毒素标准溶液加上2.7mlBET水即为1→10稀释液，得到900EU/ml 内毒素标准液。

取0.3ml1→10稀释液，加上2.7mlBET水即为1→100稀释液，得到90EU/ml内毒素标准溶液。

往后依次类推，也可写成下列格式：

0.3ml 0.3ml 0.3ml 0.3ml 1ml 1ml

9000EU/ml →900EU/ml →90EU/ml → 9EU/ml → 1EU/ml→0.5EU/ml→

2.7ml 2.7ml 2.7ml 2.4ml 1ml 1ml

1ml 1ml 1ml

0.25EU/ml → 0.125EU/ml → 0.0625EU/ml → 0.03125EU/ml

1ml 1ml 1ml

在上述稀释过程中，每稀释一步，均须在旋涡混合器上混合30秒钟。

4.4.2.2待复核鲎试剂的准备

4.4.2.2.1 在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，