酵母双杂交原理

20世纪80年代中、后期，真核转录因子得到大量深入的研究，这类研究促成了酵母双杂交系统的诞生。研究发现，真核转录因子的DNA结合区（BD）和转录结合区(AD)在功能上和实质上都是可分的。BD能把蛋白定位到基因组特定DNA序列上，AD能够使转录装置激活基因转录。1985年研究证明，将2种不同蛋白的BD与AD重组，仍能产生有活性的转录因子。后来，一些研究人员发现AD与BD不必在1条多肽上。当这两个区域单独存在时均没有转录激活功能，但当它们在空间上彼此联系时，则能够激活基因转录。Fields和Song证实利用这一特性建立了酵母双杂交系统。

酵母双杂交的原理：将2个目的蛋白分别与AD和BD融合产生新的融合蛋白，如果这2个目的蛋白能够互相作用，则该相互作用会促使AD和BD互相靠近而产生有活性的转录因子，进而激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录。

Gal4和LexA系统：Gal4和LexA系统均是依赖转录激活报告基因来检测蛋白相互作用的。

Gal4和LexA系统可用于

1、检测2个已知蛋白间的相互作用

2、从表达文库中筛选相互作用蛋白

3、用于鉴定蛋白相互作用区域

造成假阳性的原因有很多，归纳起来主要有以下几点

1、诱饵蛋白本身有激活作用；

2、靶蛋白本身就比较“黏”，不需诱饵蛋白的介导便可与报告基因的上游激活序列有直接作用，进而激活报告基因的转录；或者，靶蛋白同启动子区域上结合的其他蛋白质（而非诱饵蛋白）发生了相互作用，导致转录激活；

3、不在细胞同一时相、同一组织表达的蛋白质，相互之间也可能发生作用，尽管如此，这种相互作用是机械的而不是生理意义上的

4、还有一些假阳性结果产生的途径尚不能解释

假阴性的成因主要有：

1、Gal4和LexA系统要求被测蛋白定位于细胞核，然而有些蛋白却有强疏水结构域，还有些蛋白携带定位于细胞其他细胞器的强信号，这样，涉及后2类蛋白的相

互作用在Gal4和LexA系统中就检测不到

2、Gal4和LexA系统依赖转录激活报告基因而检测蛋白相互作用，而如果蛋白是抑制基因表达的，报告基因就不能被激活转录，双杂交系统就检测不到该蛋白相互作用了。

正是为了解决，Gal4和LexA系统这些固有的问题，以下系统才得以发展：

酵母双杂交系统常用的DNA结合结构域有GAL4和LexA，常用的转录激活结构域有GAL4、VP16或B42。

酵母菌株：为双杂交系统而改造的酵母菌株包含不同拷贝的上游激活序列。菌株L40多用于Lex40系统，该菌株lacZ报告基因（编码B-半乳糖苷酶）上游包括8拷贝的上游激活序列。菌株HF7c一般用于基于GAL4的酵母双杂交分析，在lacZ报告基因的上游只有3拷贝的GAL4上游激活序列。

酵母双杂交系统的报告基因通常由一些营养选择标记（如HIS3基因的转录激活能使酵母在缺乏组氨酸的培养基上生长）或编码酶的基因（MEL1基因的转录激活能使酵母产生a-半乳糖苷酶）组成。

目前, 酵母双杂交系统及其衍生方法广泛用于研究蛋白- 蛋白之间的相互作用、蛋白与其它分子相互作用, 筛选未知蛋白, 研究蛋白的功能等领域。利用它已揭示了大量未知蛋白质的相互作用。现在该系统已经尝试在药物机理研究方面的应用, 且有望用于研究蛋白质多复合

体中各种蛋白质的连锁图谱(P ro tein L inkageM ap ) , 从而研究转录的复合物、病毒等蛋白质复合体的相互作用。虽然该方法存在一些缺点, 如假阳性、假阴性等问题。但是, 双报告基因系统有效地解决了假阳性问题。综上所述, 酵母双杂交系统正在不断地完善和发展, 已经并将继续在蛋白质功能的研究中发挥巨大作用。