土壤微生物生态过程与微生物功能基因多样性[1]

土壤微生物生态过程与微生物功能基因多样性3张　晶1,2　张惠文133　李新宇1　苏振成1　张成刚1(1中国科学院沈阳应用生态研究所,沈阳110016;2中国科学院研究生院,北京100039)【摘要】　土壤微生物在陆地生态系统中具有重要的生态功能,包括参与地球化学物质循环、污染物降解、环境剧烈变化的缓冲等.土壤微生物的生态功能与土壤功能联系密切,微生物群落结构与组成变化会直接影响土壤功能的发挥.土壤微生物通过具有生物活性的酶参与一系列的代谢活动,编码酶的功能基因成为微生物功能标记物.近10年中,以功能基因多样性为核心的分子生态学研究迅速发展,为从功能基因角度了解土壤微生物的生态功能提供了一个新的切入点.本文综述了与土壤微生物生态功能相关的功能基因多样性研究进展,并对该领域的发展前景提出展望.关键词　土壤功能　微生物　生态功能　功能基因多样性文章编号　1001-9332(2006)06-1129-04　中图分类号　Q939.96　文献标识码　ASo il m i crob i a l ecolog i ca l process and m i crob i a l functi ona l gene d i versity .ZHANG J ing 1,2,ZHANG Hui 2wen 1,L I Xinyu 1,S U Zhencheng 1,ZHANG Chenggang 1(1Institute of A pplied Ecology,Chinese A cade m y of Sci 2ences,Shenyang 110016,China;2Graduate U niversity of Chinese A cade m y of Sciences,B eijing 100039,China ).2Chin .J.A ppl .Ecol .,2006,17(6):1129～1132.Soil m icr obes in terrestrial ecosyste m carry out a series of i m portant ecol ogical functi ons,such as geo 2chem ical cy 2cling of elements,degradati on of pollutants,and buffering t o the acute changes of envir on ment,etc .Soil m icr obi 2al ecol ogical functi on has a cl ose relati on with s oil functi on,and the changes in the structure and compositi on of s oil m icr obial populati ons can directly affect the realizati on of s oil functi on .Thr ough their p r oduced enzy mes,s oil m icr obes take part in a series of metabolic activities,and the functi onal genes of coded enzy mes are the functi onal markers of m icr obes .I n recent ten years,molecular ecol ogy focusing on the functi onal gene diversity has been de 2vel oped rap idly,which gives us a ne w cut 2in point t o understand s oil m icr obial ecol ogical functi on fr om the point of functi onal gene .This paper revie wed the research advances in the functi onal gene diversity correlated t o s oil m icr obial ecol ogical functi on,with the pers pectives in this field discussed .Key words Soil functi on,M icr oorganis m,Ecol ogical functi on,Functi onal gene diversity .3国家重点基础研究发展规划项目(2004CB418503)和国家自然科学基金资助项目(30440031).33通讯联系人.E 2mail:hui w en -zhang@yahoo 2005-06-16收稿,2006-03-26接受.1　引 言土壤微生物是陆地生态系统不可或缺的分解者,在地球化学物质循环、污染物降解转化和污染环境修复、环境剧烈变化的缓冲等方面发挥着举足轻重的作用,对陆地生态系统的可持续发展具有重要意义.土壤微生物生态功能与土壤质量之间存在着密切的联系,微生物功能多样性变化能直接反映土壤生态系统受到各种干扰因子影响的状况.土壤微生物功能主要指土壤微生物分解功能、营养传递功能及促进(或抑制)植物生长的功能.编码相关酶的功能基因作为土壤微生物功能标记物,成为了解微生物功能多样性信息与土壤功能之间关系的纽带,并成为微生物生态学中微生物多样性研究的又一新的研究领域.随着分子生物学技术的发展,应用先进的分子系统学、微阵列技术[35,36]、功能基因组学技术和原位活性检测技术从宏基因组文库中发掘基因组进化和功能信息,进而探索微生物生态系统结构与土壤功能之间的关系,成为重新评价土壤质量与功能的新切入点.用参与相关土壤微生物生态过程的功能基因多样性(包括丰度和结构)来指示土壤微生物的生态功能更具有现实意义.2　与土壤生物地球化学过程相关的功能基因多样性211　固氮过程微生物固氮作用是增加土壤氮素含量和生物有效性的重要方式,其中微生物固氮酶复合物包括两个保守蛋白:即由nif D 和nifK 基因编码的钼铁蛋白和由nif H 基因编码的铁蛋白.固氮酶编码基因nifH 是基因进化过程中最古老的功能基因,其系统进化关系和16S r DNA 相一致.研究者关注固氮基因多样性,主要考虑究竟是哪些因素影响着固氮基因的转录与表达,进而探究如何提高土壤微生物的固氮效率.研究发现土壤管理制度、植被覆盖和物理化学性质是造成土壤nifH 基因多样性差异的重要因素.其中土壤管理制度是造成差异的主要因素,其次是土壤物理化学性质[28].在土壤管理过程中,肥料施用在不同程度上影响着土壤固氮功能基因nifH 的多样性[15,34].Yeager 等[37]在研究土壤质量从未开垦沙漠荒地到已开垦农田的演替过程中发现,已开垦农田固氮应用生态学报　2006年6月　第17卷　第6期 CH I N ESE JOURNAL OF APP L I E D EC OLOGY,Jun .2006,17(6):1129～1132基因多样性远远少于未开垦沙漠荒地的,这主要归因于氮肥的施用.但土壤固氮基因类型并不随铵肥的施用而发生演替[21],而是随着植物生长季节即温度变化发生演替[2].与此同时,植被类型和覆盖与否也影响着土壤中固氮微生物群落结构.Shaffer等[31]发现林地采伐过程中,植被改变造成土壤中一种独特固氮细菌类群消失,固氮基因多样性的波动,可能是因为植被的去除改变了土壤温度、湿度、养分含量等一系列理化性质,进而影响了土壤中微生物功能群的结构和组成.Yeager等[38]研究野火对混生针叶林土壤固氮基因nif H 多样性时发现,过火林地的微生物生物量呈现下降趋势,但优势固氮菌的序列类型增多,增多的序列与孢子传播的梭菌和杆菌序列类似.此外,植物根际分泌物也是造成土壤固氮微生物nifH基因分布、结构差异的一个重要原因,分泌物糖底物诱导固氮过程发生,同时糖底物浓度和有机酸对固氮微生物种群具有选择性作用[1,5].环境污染和自然灾害也在一定意义上影响固氮菌多样性的分布.Herry等[11]研究镍矿滥采造成的镍元素富集和其他营养元素缺失的极端环境中先锋共生植物的生长对参与氮循环的功能微生物群的影响,发现先锋共生植物改变了nifH基因的多样性分布和结构,这种效应与植物种类和相应的土壤微生物种群相关.由此可见,土壤中固氮基因nifH多样性受到土壤耕作制度、植被类型、土壤物理化学性质等诸多因素的影响,只有综合考虑各个因素的效应才能提高土壤的固氮效率,进而提高土壤中氮肥的生物有效性.212　硝化与反硝化过程作为土壤、沉积物、海洋等环境中氮素循环的重要过程,微生物的硝化与反硝化作用,与固氮作用共同构成全球氮素循环体系.硝化作用包括氨氧化和亚硝酸盐氧化两个过程,其中作为氨氧化过程重要的限速酶,氨单加氧酶成为氨氧化细菌的功能标记物.目前,对硝化作用的研究主要以氨氧化细菌为主要研究对象,探讨不同情况下,氨氧化细菌特定功能的执行过程.Oved等[26]比较研究了污水灌溉和含肥料清水灌溉对土壤微生物氨氧化基因多样性的影响,污灌过程土壤氨氧化基因多样性发生显著的变化,N itroso m onas是污灌土壤的优势类群;而含肥料清水灌溉过程土壤氨氧化基因多样性不发生改变,N itrosospira是含肥料清水灌溉土壤的优势类群.Mendu m等[20]研究了可耕土壤中施用硝酸铵、农家肥加硝酸铵和不加氮肥3种处理对土壤氨氧化基因多样性的影响,其中硝酸铵施加土壤和不加氮肥土壤中不同基因型占优势地位.N icolaisen等[25]研究了高产稻田土壤氨氧化基因多样性,发现土壤不同部分的氨氧化基因多样性没有明显差异,土壤表层比亚表层功能基因多样性丰富.在反硝化作用中,多以编码含铜亚硝酸盐还原酶和含亚铁血红素c和d的亚硝酸盐还原酶的nirK和nirS、一氧化二氮氧化还原酶编码基因nosZ和硝酸盐还原酶编码基因narG作为功能标记基因.Philli ppot等[27]利用RF LP技术研究玉米根际土壤中硝酸盐还原群落的NarG基因多样性,发现裸土和植被覆盖土壤环境序列中的NarG基因与细菌(包括变形菌纲的α、β、γ亚纲)和放线菌有相关性,其中放线菌的NarG基因占有较高的比例,并且在裸土和植被覆盖土壤中硝酸盐还原群落存在转换,即存在根际效应.En wall等[4]以nosZ、narG为功能标记基因利用核糖体基因间隔区分析(R I S A)研究了不同有机和无机肥料的长期施用对土壤反硝化细菌种群的影响,发现肥料的长期作用使土壤反硝化细菌种群发生一定的结构转换,且根际分泌物也对反硝化微生物群落造成一定的影响[24].2,4,62三硝基甲苯(T NT)污染作为广泛而持久的环境问题也影响着土壤的反硝化过程.Siciliano等[33]发现土壤中的反硝化酶对T NT非常敏感,随着T NT浓度的增加,nirK、nirS和nosZ基因型增加,但是硝酸盐(NaR)、亚硝酸盐(N i R)和一氧化二氮(N(2)OR)还原酶活性下降,暗示T NT降低了土壤中的反硝化活动.213　甲烷氧化过程在甲烷氧化菌代谢过程中,几个酶起重要作用,包括粒状甲烷单加氧酶(p MMO)、可溶甲烷单加氧酶(s MMO)、甲醇脱氢酶(MDH),其编码基因分别为pmoA、mxaF和mmoB.不同土地利用方式下土壤中甲烷氧化菌种群结构差异造成了甲烷氧化速率差异,特别是荒地被开垦后,甲烷吸收率降低了60%～90%.Knief等[16,17]通过靶定pmoA基因研究不同土地利用方式下(包括天然林地、再生林地和玉米地)的甲烷氧化基因多样性,发现农田的甲烷氧化速率明显低于天然林地和再生林地,且甲烷氧化基因类型也与后两者有显著的不同,M ethylobacter和M ethylocystis是林地土壤的优势种群.在土壤物质循环中,甲烷是典型的代谢产物之一,其中,土壤微生物介导的甲烷消耗被认为是甲烷氧化的主要途径. Henckel等[9]研究表明由于气候的影响,冬季甲烷氧化基因多样性在土壤亚表层丰富,夏季甲烷氧化基因在整个土层中都可以检测到,但其功能基因多样性无较大波动.Horz等[13]发现降水和气温的双因子联合变化对甲烷氧化基因多样性影响比两者各自单因子要小,土壤中Ⅱ型甲烷氧化菌普遍存在,包括3个新的pmoA进化分支,其中2个进化分支对环境变化反应较小,而另一个进化分支对降雨量增加和温度升高有较强的响应.稻田土壤是产生甲烷气体的重要场所,大约90%的甲烷由于淹水而释放到大气中.Horz等[13]通过靶定pmoA基因的末端限制性片段多态性技术研究了稻田土壤根际甲烷氧化基因多样性,发现包括M ethylo m onas、M ethy2 lobacter和M ethylococcus在内的Ⅰ型甲烷氧化菌和包括M eth2 ylocystis2M ethylosinu在内的Ⅱ型甲烷氧化菌是根际的优势种群.Henckel等[7]利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术研究水稻田土壤甲烷氧化功能基因pmoA和mxaF多样性,发现CH4氧化开始时功能基因类型发生明显的转换,而高浓度CH4刺激了Ⅰ、Ⅱ型甲烷氧化菌功能基因多样性的增加,且稻田排水后,Ⅰ、Ⅱ型甲烷氧化功能基因的垂直分布分别受到不同影响[8].Hoff mann等[12]采用DGGE和RF LP方法调查中国和菲律宾地区不同稻田土壤pmoA基因多样性,分析显示土壤中的I型嗜甲烷菌包括M ethylobacter、M ethylo m i2 crobium、M ethylococcus和M ethylocaldum,Ⅱ型嗜甲烷菌包括0311 应　用　生　态　学　报 17卷M ethylocystis和M ethylosinus.不同的土壤甲烷氧化功能基因多样性有明显的差异.214　二氧化碳固定过程卡尔文循环是二氧化碳固定的最主要路径,在调节大气二氧化碳浓度方面发挥重要作用.二氧化碳固定效率影响着土壤碳库的输入与输出及土壤的相关生态过程.很多研究关注着大气二氧化碳浓度倍增对土壤微生物群落的影响,从功能基因多样性着手研究此过程仅是一个开端.Selesi等[30]把1,52二磷酸核酮糖羧(化)酶I大亚基编码基因cbb L作为固定二氧化碳自养细菌的功能标记物,通过长期的野外实验研究在不同农田管理方式下cbb L基因的类绿和类红系统进化群多样性分布,发现类绿cbb L基因显示出非常低的多样性水平,其序列与维氏硝酸杆菌和硝化细菌相近,而类红cbb L 基因文库在施肥土壤中多样性较高,在不施肥土壤中多样性则较低,他们从类红cbb L基因文库入手得到了杆菌、链霉菌和节杆菌是研究地点的优势类群,从而为进一步研究二氧化碳浓度变化对土壤功能的影响奠定了基础.215　其它过程几丁质作为重要的氮素来源在环境中普遍存在,大部分土壤微生物具有分解几丁质的能力,许多细菌同时具有多个几丁质酶基因(chi),真菌几丁质酶在养分和菌丝细胞壁生长中发挥着双重作用.Metcalfe等[22]利用简并引物和几丁质饵埋片的方法,比较了草地中不同处理之间几丁质分解群落的多样性差异,结果表明,几丁质饵埋片处理地区DNA文库的优势序列是节杆菌的chi基因序列,而未处理地区以链霉菌和寡养食单胞菌chi序列为主.3　与污染过程相关的功能基因多样性311　有机污染物随着异源物质引起水体与土壤污染程度的加剧,人们在关注有毒物质微生物降解过程、代谢途径以及生物修复过程的同时,也越来越关注污染过程对土壤功能的影响.有机污染物(例如石油烃和多环芳烃)污染,特别是持久性有机污染物(P OPs)的生物降解,是世界性的环境问题.土壤微生物在有机污染物生物修复方面具有其独特的优势,它们对该类污染物的降解主要是通过不同的单双加氧酶催化完成1通过单双加氧酶活性研究可以了解微生物群落对石油烃的代谢功能,而对编码降解酶功能基因研究则为评价生物修复的潜能提供了分子诊断的工具.M ilcic2Terzic等[23]和Siciliano 等[32]分别利用编码烷烃单加氧酶、萘双加氧酶、儿茶酚2,32双加氧酶的代谢基因alk B、ndoB、xylE(C230)作为分子探针,监测石油烃污染土壤中土著微生物群落代谢基因的丰度变化,作为细菌降解有机污染物潜能的指示.儿茶酚2,32双加氧酶是芳香族化合物降解中的关键酶,其编码基因是苯、甲苯、乙苯及邻2二甲苯(BTEX)类污染物代谢基因多样性研究的关键基因.Hendrickx[10]通过PCR2DGGE方法评价了BTEX类污染物污染地点的BTEX单加氧酶编码基因t m oA 多样性,发现污染水平决定了t m oA基因多样性.Junca等[14]通过扩增功能DNA限制性片段(AF DRA)和分析单链多态性(PCR2SSCP)指纹图谱认为,功能基因C230多样性的转变与污染物水平及污染时间有关,同时C230基因丰度与土样中BTEX的污染水平有关.漆酶是最广泛存在的真菌胞外酶,参与酚物质代谢和芳族胺氧化,虽然与锰和木质素过氧化酶相比,其氧化还原能力较低,但也能氧化非酚成分,使其完全降解为木质素.Luis 等[18]研究了林地土壤外生菌根真菌和腐生担子菌漆酶的基因多样性,发现土壤中漆酶基因的特定分布,Oh层具有较高的漆酶基因多样性.与菌根真菌相比,腐生真菌在土壤层中分布相对集中,但具有较高的漆酶基因多样性.Lyons等[19]通过分别扩增培养物和环境样品中编码漆酶基因序列,研究了美国东南部沼泽湿地中有木质素降解潜在功能的子囊菌漆酶序列多样性,得到39个独特的序列、13种独特的序列类型及15种独特的漆酶序列类型,并发现两种新的漆酶类型,表明真菌群落的这一功能基因具有高度的序列多样性. 312　重金属污染土壤微生物可以通过不同的机制转化和富集重金属离子,其中重金属抗性基因,例如汞离子还原酶编码基因mer A、镉抗性基因czc和银抗性基因sil一直是研究的焦点,研究者试图从土壤中筛选出重金属抗性菌株,继而得到抗性基因,探索抗性机理,从而从根本上提高对重金属污染土壤的修复效率.D iels等[3]合成镉、钴、锌和汞抗性基因探针利用菌落DNA探针杂交法,从重金属污染土壤中分离筛选细菌中的抗性菌株.筛选到的大部分菌株携带两个大的质粒,且土壤重金属污染程度与重金属抗性基因的出现呈正相关.Hart 等[6]从汞污染土壤中分离出含有汞抗性基因的杆菌,研究其多样性情况发现,不同地点的mer A基因多样性不仅仅简单地与杆菌的进化有关,同时也与杆菌在土壤中的空间分布有关.Rore等[29]指出,重金属的选择性压力导致土壤抗性基因的转移,这种特异性转移在非污染土壤中由于电子竞争等原因而不会发生.4　结 语 土壤微生物功能多样性与土壤功能关系密切,土壤微生物功能多样性是土壤功能的保证,同时也是恢复土壤功能的基础.功能性微生物能够固氮、解磷、解钾,通过繁殖代谢产生多糖等物质,从而改善土壤理化性质,缓解土壤板结,提高土壤保肥保水性能,增强根系吸收能力,提高养分利用率.功能性微生物能够降解污染物,降低污染物在环境中的毒性,从而最大程度减少环境污染的风险.利用功能基因研究土壤微生物功能群多样性,为研究者从分子水平全面评价不同环境因子对土壤微生物功能群多样性的影响,提供了一个新的途径.迄今为止,研究较多的功能基因多与碳、氮、硫等元素的物质循环和污染物降解过程相关,其它生态过程(例如磷循环)还没有相关的功能基因研究结果,能否通过编码某一过13116期 张　晶等:土壤微生物生态过程与微生物功能基因多样性 程代谢酶的功能基因来定性比较微生物功能群多样性仍值得进一步深入探讨.综合运用生物信息学和引物设计软件,靶定编码相应代谢酶的功能基因,设计出新的能够扩增功能基因的引物,可能更深层次地拓展我们对土壤微生物功能群多样性的了解.参考文献1　Burg mann H,Meier S,Bunge M,et al.2005.Effects of model r oot exudates on structure and activity of a s oil diazotr oph community.Environ M icrobiol,7:1711～17242　Desli ppe JR,Egger K N,Henry GHR.2005.I m pacts of war m ing and fertilizati on on nitr ogen2fixing m icr obial communities in the Ca2 nadian high arctic.FE M S M icrobiol Ecol,53:41～503　D iels L,Mergeay M.1990.DNA p r obe2mediated detecti on of re2 sistant bacteria fr om s oils highly polluted by heavy metals.Appl En2 viron M icrobiol,56:1485～14914　Enwall K,Phili ppot 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