一株自养硝化细菌培养条件的优化
硝化细菌的作用是什么如何培养
硝化细菌的作用是什么如何培养(1)利用旧滤材或滤砂移植硝化细菌饲养过观赏鱼的旧水族箱中滤材或底砂上都附着大量的硝化细菌，若能将旧滤材或滤砂移入新设立的水族箱引入菌种，可大大促进硝化细菌繁殖的速度，至少节约一半的培养时间。
(2)利用污染源刺激硝化细菌的繁殖在引入菌种后，要配合过滤、充气促进水流循环，并在水族箱中放入4～5个新鲜的去壳蛤蜊或虾，利用肉质腐烂生成的毒素作为硝化细菌的营养，刺激菌种大量繁殖。
还可以购买一些小型易养的实验鱼，放入几条，利用它们的排泄废物、食物碎屑提供有机物废料，促进硝化细菌的繁殖。
(3)添加人造硝化细菌目前市售的人造硝化细菌，有液态、粉末状、干燥孢子化等不同类型，可以满足观赏鱼爱好者迫切尽快饲养的要求。
培养生物过滤系统的要点~在进行水族箱生物过滤系统培养时，要掌握以下几个要点：(1)不宜频繁换水大量的换水，容易破坏水族箱中硝化细菌的繁殖，使附着于底砂滤材中的硝化细菌随换水大量散失，同时水质的频繁改变也无法维持硝化细菌繁殖的适宜ph值，因此换水不必过勤，1～2个月换20％的水即可。
(2)正确清洗滤材经过长期饲养，过滤系统的滤材上会附着大量硝化细菌，但同时也会积累许多杂质污物，需定期清洗。
清洗时，用原水族箱的海水将滤材轻轻挤压揉搓，千万不能用自来水冲洗或使用洗涤剂等化学物质。
(3)渐次追加观赏鱼刚设立的新缸要逐渐增加观赏鱼数量，不可一次放入过多，以免大量的残饵和排泄物产生的毒素超过硝化细菌氧化分解的能力，造成水质污染和观赏鱼死亡。
(4)慎用治疗药物观赏鱼生病需要治疗时，最好能隔离治疗。
因为预防和治疗鱼病的消毒剂、抗生素等药物，不同程度地对硝化细菌的活力有所影响。
即使在原缸中治疗，治疗完毕后，也要及时利用活性炭吸附残留药物或进行换水，以降低药物浓度，并重新添加人工硝化细菌，维持硝化细菌群落的稳定。
硝化细菌的作用是什么如何培养 [篇2]近年来，硝化细菌已逐渐成为水产养殖界的热门话题，它在水产养殖中的重要性开始引起广泛的注意。
一株亚硝化细菌的分离鉴定及其发酵工艺优化
一株亚硝化细菌的分离鉴定及其发酵工艺优化赵彭年;杨德玉;王加友;丁一凡;安鹏;王远【摘要】亚硝化细菌(又称氨氧化菌)在自然界中分布广泛,其在土壤、淡水及海洋中均有分布.亚硝化细菌在污水氨氮降解过程中具有重要作用,然而亚硝化细菌的高密度发酵较为困难,使其在实际应用中受到限制.基于此,将海洋污泥在揺瓶中富集培养,利用硅胶平板和水洗琼脂平板分离获得1株亚硝化细菌,经鉴定为亚硝化单胞菌菌属(Nitrosomonas sp.),并通过揺瓶培养确定了此菌株的最优培养条件:最适温度为30℃,最适pH为8.0,最适溶解氧浓度≥1.8 mg/L.经正交试验确定培养基组分的最佳组合及浓度:0.5％NaHCO3,0.8％(NH4)2SO4,0.1％KH2PO4,0.01％FeSO4.最后,在最优培养条件下利用10 L发酵罐进行高密度发酵,并于发酵过程中进行了2次发酵液置换,当发酵75 h时,发酵液的亚硝化速率达到236 mg(N-NO-2)/L·h,与未进行发酵液置换的发酵批次相比,亚硝化速率提高了2倍.研究表明,置换发酵液极大地提高了发酵效率,对后续工业化生产起到了重要的指导作用.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2019(009)001【总页数】9页(P69-77)【关键词】亚硝化细菌;亚硝化速率;零级反应;培养条件;发酵液置换【作者】赵彭年;杨德玉;王加友;丁一凡;安鹏;王远【作者单位】沈阳化工研究院有限公司生物与医药研究所,沈阳110021;沈阳化工研究院有限公司生物与医药研究所,沈阳110021;沈阳化工研究院有限公司生物与医药研究所,沈阳110021;沈阳化工研究院有限公司生物与医药研究所,沈阳110021;沈阳化工研究院有限公司生物与医药研究所,沈阳110021;沈阳化工研究院有限公司生物与医药研究所,沈阳110021【正文语种】中文亚硝化细菌(又称氨氧化菌)在自然界中分布十分普遍，其在土壤、淡水及海洋中都有存在。
两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究
两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究一、本文概述本文旨在探讨两株异养硝化-好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定及其特性研究。
异养硝化-好氧反硝化细菌是一类特殊的微生物，能够在好氧条件下进行硝化和反硝化过程，对于氮循环和环境保护具有重要意义。
本文首先通过分离和筛选方法，从自然环境中获取两株具有异养硝化-好氧反硝化功能的细菌，并对其进行初步的生理生化特性分析。
接着，采用分子生物学手段对这两株细菌进行鉴定，明确其分类地位和系统发育关系。
在此基础上，进一步深入研究这两株细菌的生长特性、硝化反硝化性能、以及环境因子对其生长和代谢的影响。
本文的研究结果不仅有助于深入了解异养硝化-好氧反硝化细菌的生物学特性和生态学功能，同时也为该类微生物在环境修复、污水处理等领域的应用提供理论支撑和实践指导。
二、材料与方法为了分离和筛选异养硝化—好氧反硝化细菌，我们从多个不同的生态环境中采集了土壤和水样，包括污水处理厂、河流、湖泊以及农田土壤等。
为了培养和筛选目标细菌，我们使用了多种培养基，包括常规的好氧反硝化培养基和异养硝化培养基。
这些培养基根据细菌的生长特性和需求进行了优化。
实验过程中使用了多种分子生物学试剂，如PCR引物、DNA提取试剂盒等。
同时，还使用了多种仪器，如PCR仪、凝胶电泳仪、微生物培养箱等。
采用稀释涂布法将采集的样品接种到含有相应培养基的平板上，通过观察菌落的形态、大小和颜色等特征，初步筛选出具有异养硝化—好氧反硝化能力的细菌。
通过形态学观察、生理生化特性分析以及分子生物学方法（如16S rDNA序列分析）对筛选出的细菌进行鉴定。
对筛选和鉴定出的细菌进行详细的特性研究，包括生长曲线测定、异养硝化速率测定、好氧反硝化速率测定等。
还研究了环境因子（如温度、pH、碳源和氮源等）对细菌生长和硝化反硝化活性的影响。
实验数据采用统计学方法进行分析，以揭示细菌的生长规律和硝化反硝化特性。
还通过图表等形式直观地展示了实验结果。
低温海水硝化细菌富集培养过程及影响因素
低温海水硝化细菌富集培养过程及影响因素硝化细菌为化能自养，生长缓慢，对环境因素变化敏感[1-2]。
其中温度对硝化细菌的活性影响较为明显，多数硝化细菌的适宜温度为28 ℃左右，当温度低于15 ℃时硝化作用急剧下降甚至停止。
在冬季海水养殖中，多数硝化细菌无法耐受其低溫环境，活性被极大抑制，对养殖状况不利。
自然界中耐低温的硝化细菌数量和种类较少，因此低温海水环境中硝化细菌的驯化和富集培养显得尤为重要。
目前，对于硝化细菌的富集培养、分离纯化与筛选方面的特性研究与应用较为广泛[5-6]，其中也不乏对低温环境硝化细菌富集、筛选与多样性方面的研究[7-9]，然而目前大多是针对淡水低温环境硝化细菌的富集培养，对海水低温条件下的应用实践（如工厂化冷水鱼养殖系统）可能效果甚微。
因此，本研究构建一种低温海水型硝化细菌富集培养方法，研究了低温海水环境中不同条件对硝化细菌活性的影响，确定其适宜的生长环境，同时探究了无机氮盐去除率与底物浓度的关系，为低温海水硝化细菌富集培养条件的优化提供理论依据。
1 材料与方法1.1 试验材料试验用海沙取自冬季青岛某海水浴场3～5 cm浅层海沙；氨氧化细菌（AOB）培养液由氯化铵（AR）、碳酸氢钠（AR）、人工海水配制而成；亚硝酸盐氧化细菌（NOB）培养液由亚硝酸钠（AR）、碳酸氢钠（AR）、人工海水配制而成。
1.2 试验方法1.2.1 富集培养方法培养装置见图1。
海沙经适当处理后分别加入2个烧杯，烧杯有效体积为5 L，两烧杯内加入海沙体积各1 L。
分别向烧杯中加入事先配好的人工海水各4 L，盐度为30‰。
将烧杯置于水箱，水缸液面略低于烧杯液面，烧杯中配备搅拌和曝气装置。
使用冷水循环机将水温控制在11～14 ℃，使用搅拌器进行充分混合，控制溶解氧含量在4.0～4.5 mg/L。
定期加入碳酸氢钠溶液以调节pH。
初期分别向AOB和NOB烧杯中加入氯化铵和亚硝酸钠，使培养基中氨氮和亚硝酸盐氮浓度达到10 mg/L。
一株耐高温亚硝酸盐型反硝化细菌的鉴定及脱氮特性
一株耐高温亚硝酸盐型反硝化细菌的鉴定及脱氮特性李誉琦; 马佩钰; 刘涵; 王灵芝; 高仁玲; 李慧娟【期刊名称】《《生物技术通报》》【年(卷),期】2019(035)009【总页数】8页(P194-201)【关键词】芽孢杆菌; 亚硝酸盐; 反硝化细菌; 高温【作者】李誉琦; 马佩钰; 刘涵; 王灵芝; 高仁玲; 李慧娟【作者单位】山东科技大学化学与环境工程学院青岛266590; 北京中医药大学生命科学学院北京102488【正文语种】中文亚硝酸盐是生态系统中氮循环的成分之一，也是微生物硝化作用和反硝化作用的中间产物。
高浓度的亚硝酸盐对水生生物、哺乳动物及人类具有多种毒害效应［1-2]，降低及控制亚硝酸盐含量是水处理工艺中的重要步骤。
与物理法和化学法脱氮方式相比，生物法去除亚硝酸盐氮因具有高效、安全、成本低、无二次污染等优点，成为最常用的技术。
反硝化细菌是去除环境中对生物有毒害作用亚硝酸盐的重要菌群，通过好氧或厌氧反硝化过程将硝酸盐或亚硝酸盐转化成一氧化二氮或氮气，从根本上解决水体中亚硝酸盐污染的问题［3-4]。
好氧反硝化菌主要分离自活性污泥、废水、废水处理系统、土壤、海底沉积物等环境中［5]，涵盖的种属类型多，有假单胞菌属（Pseudomonas）［6]、不动杆菌属（Acinetobacter）［7]、芽孢杆菌属（Bacillus）［8]、肠杆菌属（Enterobacter）［3]、海杆菌属（Marinobacter）［9]和苍白杆菌属（Ochrobactrum）［10]等。
反硝化细菌多在25-37℃范围内有较高的反硝化能力，而低温或高温均会影响菌株的生长和酶的活性。
超过40℃，细菌的硝化和反硝化过程受到强烈抑制［3]。
生产实际中，很多工业废水的温度都达到45℃以上，利用常规反硝化细菌处理，需将废水进行冷却处理。
若直接用高温反硝化细菌处理高温废水，不仅省去高温废水冷却处理环节，减少设备投资，也提高了水处理效率。
硝化细菌
硝化使用
硝化使用
硝化细菌制剂是一种用于控制养殖池水自生氨浓度的处理剂，不仅使用相当方便，而且能发挥立竿见影的效 果，故越来越受鱼友的欢迎。使用时可直接将该剂散布于池中，不久即能发挥除氨的功效。
市售硝化细菌制剂可分为活菌及休眠菌两种，渔友可依自己的需要选购使用。前者是利用细菌的活体制成， 在显微镜的观察下，可看到它们的活动情形。后者是利用休眠菌制成，在显微镜的观察中，则无法看到它们具有 活动能力。
悬浮物
鱼友中不少人去买硝化细菌，按照说明每星期按时添加，这样做对吗？可我要告诉大家的是，你们的做法没 错，可你们对硝化细菌的认识产生的错误。菌液为澄清无味或者澄清有味则可能为硝化细菌；如果菌液呈现红色 或者紫色并有尿骚味，则为光合细菌；
提高含量
提高含量
在养殖池中存在的有毒物质主要是氨及亚硝酸，这两种有毒的物质可由硝化细菌所消耗，并生成无毒性的硝 酸盐，硝酸盐又是藻类的最佳氮肥，能被藻类所吸收及同化。因此，在养殖池中绝对不可缺少硝化细菌，如果硝 化细菌缺乏，水中的氨含量将急速增加，使池水内的鱼虾有致死的危险。许多人通常不了解这个问题的重要性， 以致于常遭遇到养殖失败的命运。这说明如果您不去了解这个问题的症结所在，并谋求改善的话，即使是有经验 的业者，都可能会败在硝化细菌不足的危害之下。
2NH3+3O2→2HNO2+2H2O+158kcal(660kJ)。
硝酸细菌（又称亚硝酸氧化菌），将亚硝酸氧化成硝酸。反应式：
HNO2 + 1/2 O2= HNO3, -⊿G= 18 kcal。
这两类菌能分别从以上氧化过程中获得生长所需要的能量，但其能量利用率不高，故生长较缓慢，其平均代 时（即细菌繁殖一代所需要的时间）在10小时以上。硝化细菌在自然界氮素循环中具有重要作用。这两类菌通常 生活在一起，避免了亚硝酸盐在土壤中的积累，有利于机体正常生长。土壤中的氨或铵盐必需在以上两类细菌的 共同作用下才能转变为硝酸盐，从而增加植物可利用的氮素营养。时至今日，人们尚未发现一种硝化细菌能够直 接把氨转变成硝酸，所以说，硝化作用必须通过这两类菌的共同作用才能完成。（2015年圣诞节前人类已经成功 分离出了可以直接将氨氮转化为硝氮的细菌，称为短程硝化细菌，结束了发现硝化细菌后100年来对氮素转化的 教条式认知，特此批注。）我们知道，亚硝酸对于人体来说是有害的，这是因为亚硝酸与一些金属离子结合以后 可以形成亚硝酸盐，而亚硝酸盐又可以和胺类物质结合，形成具有强烈致癌作用的亚硝胺。然而，土壤中的亚硝 酸转变成硝酸后，很容易形成硝酸盐，从而成为可以被植物吸收利用的营养物质。
异养硝化细菌及其在水环境处理上的应用
异养硝化细菌及其在水环境处理上的应用摘要：通过与传统自养硝化作用的比较，异养消化细菌不仅是客观存在的过程，而且某些特殊的异氧菌，可以同步进行异养硝化和好氧反硝化，在水环境处理上具有重要的理论意义和应用价值。
本文通过介绍异养型硝化细菌的分布类型、特点，影响异养硝化菌生长硝化的关键因素，进而来分析异养硝化细菌在水环境上的应用。
关键词：异养硝化细菌水环境应用Nitrifying bacteria and the applications in water environment processingAbstract：Compared with the traditional autotrophic nitrification，heterotrophic nitrification is the process existed objectively，and some special kinds of heterotrophic nitrifiers can carry out heterotrophic nitrification and aerobic denitrification simultaneously，providing theoretic meaning as well as application value to the nitrogen removal in wastewater treatment．The paper describes heterotrophic nitrification bacterial distribution types,characteristics, and the key factors that affect the growth of heterotrophic nitrification bacterium. Then to analyze the application of the nitrifying bacteria in the water environment .Keywords：Heterotrophic nitrification bacterium water environment application随着工农业生产的迅速发展，城市人口的大量增加，水体遭受氮污染的问题日益严重,并引起人们的密切关注。
一株异养硝化细菌的筛选及其脱氮性能的研究
圈１菌株ＣＰｚ＿５６的扫描电镜照片（８０。。ｘ）
ｓｃ删ａｇ ｅ１％ｔｒｏｎｍｉｃ州ｏｐｅ ＦｉｇＩ Ｔｈｅ
ｐｉｃｔｕ∞ｏｆ ｓｔｒａｉｎＣＰＺ ５６（８０００×１
２ ２菌株ｃＰｚ ５６菌株的在异养硝化培养基中的生长曲线
对曲株ｃＩ’ｚ＾６的生长曲线进｛，捌定．其结粟幽２所小。由菌株细胞＿Ｋ密度Ｄ位的变化ｒ４ 向：，ｃ蹦５ｓ茁朴扛Ｏ～１０ ０，埘为透府明，』２小时开始避Ａ对教生Ｋ捌．２６小Ⅳｔ丛剑最人牛Ｋ 带，２历苗株进入稳定牛臣蝌。
近年来，有关异养型硝化微生物的报道较多，目前已报道的异养型硝化微生物有：第一 类：Ａｌｃａｌ ｉｇｅｎｅｓ属；第二类Ｎｉ ｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属；第三类包括Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ属、Ａｒｔｈｔｏｂａｃｔｅｒ属、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属和Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属。Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｚｏｏｇｌｏｅｏｉｄｅｓ具有异养硝化脱氮 功能在国际上鲜为报道。
’基金项目项目：“十一五”国家科技支撑计划项日（２００６ＢＡＤｌ７８０９） 作者简介：陈咄蜘Ｉ（１９８３’），女。硕上研究生，主要研究方向为环境微生物修复技术研究．Ｅ－－ａａｉｌ：ｃｈｅｎｐｅｉｚｈｅｎｃｐｚｏｓｉｎ＆ｃｏｌ通
讯联系人，王立刚，Ｅｌｉｌ：ｗｌｇ俄ｒ，ａａｓ．ｎｅｔ．ｃｎ
６８
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
中国农学会高新技术农业应用专业委员会２００９年学术研讨会论文集
摘要：通过极限稀释筛选的方法。从畜禽养殖废水样品中筛选到Ｉ株同时具有异养硝化 功能的细菌ＣＰＺ－５６。该菌株革兰氏染色呈阴性，杆状。菌落颜色为白色，菌体形态为杆状， 有鞭毛。经形态、生理生化特性，１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析，初步鉴定该菌为Ｓｈｉｎｅｌ］ａ ｚｏｏｇｌｏｅｏｉｄｅｓ。对该菌进行异养硝化功能进行研究，结果表明，氨氮初始浓度为５０ｍｇ／Ｌ， 菌株经过２８小时能将培养基中的氨氮全部去除，且总氮最大去除率达到６４％。此高效脱氮 降解菌对畜禽废水中氮的去处具有较好的应用前景。
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一株自养硝化细菌培养条件的优化摘要：针对前期筛选的自养硝化杆菌（Nitrobacter）菌株y3-2，以实时荧光定量核酸扩增检测系统（qPCR）测定的菌液终浓度为指标，设计单因素试验和正交试验对其培养基和培养条件进行优化。
结果表明，优化的硝化杆菌y3-2的培养基中CaCO3、Na2CO3、NaNO2浓度分别为0.5、1.0、0.5 g/L。
最佳培养条件为培养温度28 ℃、pH 8.0、摇床转速200 r/min。
优化后硝化杆菌y3-2的发酵周期由优化前的7 d缩短至4 d，菌液终浓度达到4.31×109 CFU/mL。
关键词：硝化杆菌（Nitrobacter）；培养基；培养条件；优化氮素是水体污染源的主要成分之一，水体的脱氮技术已经成为人们关注与研究的热点[1]。
与传统的物理化学脱氮工艺相比，生物脱氮具有成本低、效率高、无二次污染等优势。
现今采用最多的生物脱氮工艺为硝化—反硝化工艺，其中的硝化工艺由硝化细菌（Nitrifying bacteria）完成[2]。
硝化细菌分为自养型硝化细菌和异养型硝化细菌2类，异养型硝化细菌仅占很少一部分，自养型硝化细菌是生物脱氮过程中起硝化作用的主要菌群，其硝化速率直接影响污水处理系统的硝化效果和生物脱氮效率[3]。
硝化过程通常由氨氧化细菌（Ammonia-oxidizing Bacteria，AOB）先将氨氮转化为亚硝酸盐，然后由亚硝酸氧化细菌（Nitrite-oxidizing Bacteria，NOB）将亚硝酸盐转化为硝酸盐[4]。
与自养型AOB 一样，自养型NOB具有生长速度慢、自然条件下数量低等特点，这一方面使NOB 的研究较为困难，另一方面也制约了其工业化生产和应用。
因此，研究加快NOB 生长速度的培养方法显得尤为重要[5，6]。
本研究以一株亚硝酸氧化细菌y3-2[7]为出发菌株，对其培养基和培养条件进行了优化，并采用实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-time quantitative PCR detecting system，qPCR）计数的方法对其菌液浓度进行计数，以期获得能快速培养硝化杆菌y3-2的方法。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种试验用菌种硝化杆菌y3-2由农业微生物学国家重点实验室发酵工程分室分离纯化保藏，经16 S rDNA鉴定为硝化杆菌属（Nitrobacter）细菌。
1.1.2 优化前培养基及培养条件优化前初始培养基：MgSO4·7H2O 0.12 g/L、NaH2PO4·2H2O 1.16 g/L、K2HPO4·3H2O 0.33 g/L、MnSO4·H2O 0.007 6 g/L、（NH4）6Mo7O24·4H2O 50 μg/L、无水NaCO3 0.5 g/L、NaNO2 1.0 g/L、pH 7.5，121 ℃、30 min灭菌。
优化前的培养条件为250 mL三角瓶加入50 mL培养基，200 r/min、30 ℃恒温培养。
1.1.3 试剂亚硝酸盐和硝酸盐定性检测试剂[8]：Griess试剂、盐酸溶液、氨基磺酸铵溶液、二苯胺—硫酸试剂，细菌基因组DNA提取试剂盒和Real MasterMix（SYBR Green）试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，硝化杆菌qPCR 标准样品为农业微生物学国家重点实验室发酵工程分室自制。
1.2 方法1.2.1 培养基的优化1）单因素试验。
设计单因素试验分别考察培养基中CaCO3、Na2CO3和NaNO2浓度对试验菌株生长的影响。
①CaCO3浓度。
Na2CO3浓度1.5 g/L，NaNO2浓度0.5 g/L，CaCO3浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、5.0 g/L。
②Na2CO3浓度。
CaCO3浓度0.5 g/L，NaNO2浓度0.5 g/L，Na2CO3浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/L。
③NaNO2浓度。
CaCO3浓度0.5 g/L，Na2CO3浓度1.5 g/L，NaNO2浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L。
每个单因素试验设置3个平行，每天定性检测NO2-、NO3-含量，观察NO3-生成情况，记录NO2-完全硝化所需时间，并对细菌进行计数。
2）正交试验。
设置三因素三水平正交试验考察CaCO3、Na2CO3和NaNO2浓度对细菌生长的影响，每个试验设置2次重复。
1.2.2 培养条件的优化采用优化后的培养基培养菌株，设置单因素试验考察培养温度、pH和转速对菌株生长的影响。
①温度。
将种龄为48 h的新鲜菌液以5%的接种量接种到装有50 mL培养基的250 mL三角瓶中（后面摇瓶试验接种方法一致），分别在15、20、25、28、30、35 ℃下恒温培养，pH控制在7.0～7.5，转速设为200 r/min，记录NO2-完全硝化所需时间及菌落数；选择适宜的温度范围进行正交试验。
②pH。
培养基pH控制为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，培养温度为28 ℃，转速设为200 r/min。
记录NO2-完全硝化所需时间及菌落数。
③转速。
将活化后的菌种接种到三角瓶中，28 ℃恒温培养，pH 8.0，转速分别为50、100、150、200、250 r/min，记录NO2-完全硝化时间及最终菌落数。
每个单因素试验设置3组平行。
1.2.3 分析方法亚硝酸盐定性检测使用Griess试剂法；硝酸盐定性检测使用二苯胺-硫酸试剂法[8]；菌液浓度定量分析：首先提取收集菌液的基因组DNA，然后使用Real-time PCR定量计数方法进行计数[9]，qPCR反应体系总体积为20 μL，含有Real Master Mix/20×SYBR solution 9 μL、FGPS872（5′-TTTTTTGAGATTTGCTAG-3′）1 μL（终浓度100 nmol/L）、FGPS1269（5′-CTAAAACTCAAAGGAATTGA-3′）1 μL（终浓度100 nmol/L），DNA模板1 μL，超纯水8 μL。
Real-time PCR反应程序为：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性20 s，50 ℃退火20 s，68 ℃延伸40 s，共循环40次；最后一步设置自动制作溶解曲线。
通过计算机对样品PCR结果和标准样品PCR结果进行对比分析，计算出扩增基因片段的拷贝数，从而推算出样品中的菌体含量。
2 结果与分析2.1 培养基的优化结果2.1.1 不同CaCO3浓度对y3-2生长及硝化作用的影响近年来多项研究表明NOB具有附着生长的特点，有研究者通过此特点对NOB进行固定化，从而提高NOB的硝化效率[10]，本研究以CaCO3为添加物，提供y3-2生长的附着位点，考察其对y3-2生长的促进作用，结果如图1所示。
由图1可以看出，CaCO3对y3-2的生长具有明显的促进作用，其浓度为0.5 g/L时促进作用最佳，菌液终浓度达8.0×108 CFU/mL，而未添加CaCO3的对照组菌液浓度不足 1.0×108 CFU/mL。
此外，CaCO3添加浓度为0.5 g/L时，硝化速度也明显加快，NO2-完全硝化仅需5 d，而对照组需要9 d。
2.1.2 不同Na2CO3浓度对y3-2生长及硝化作用的影响Na2CO3浓度对y3-2生长和硝化作用的影响结果如图2所示。
由图2可知，Na2CO3浓度为1.0～3.0 g/L 时NOB具有良好的生长势，其中1.0 g/L试验组细菌生长情况最好，菌液终浓度最高，且完全硝化NO2-仅需5 d；当Na2CO3浓度小于1.0 g/L时，y3-2生长速度很慢，原因是过低的碳源浓度使y3-2生长不充分，生物量较低。
在氮源浓度一定的情况下，碳源浓度过高致使培养液中碳氮比（C/N）过高，会导致细菌对氮源的代谢利用发生异常，从而细菌繁殖缓慢，因此Na2CO3浓度高于3.0 g/L 时菌液中终浓度较低，NO2-完全转化所需时间也延长。
2.1.3 不同NaNO2浓度对y3-2生长的影响NO2-是NOB生长与繁殖过程中唯一的氮源，它是控制NOB生长的重要因素，不同NO2-浓度对y3-2生长的影响结果如图3所示。
由图3可知，NaNO2浓度为0.5～4.0 g/L时对NOB生长有明显的促进作用，0.5 g/L时y3-2生长速率最快，NaNO2为4.0 g/L时菌液终浓度最大，约为2.0×109 CFU/mL；但随着NaNO2浓度进一步升高，y3-2的生长被抑制，且完全硝化NO2-的时间也逐渐延长。
这是因为NO2-浓度过低使细菌缺乏充分的底物来进行繁殖，而浓度过高时会对y3p 2.2 培养条件优化的结果2.2.1 温度对y3-2生长和硝化作用的影响有文献报道NOB在15～30 ℃具有较好的生长状态和硝化活性[11]。
y3-2在不同培养温度下的生长及硝化NO2-的情况见图4。
从图4可以看出，菌液终浓度随培养温度的升高呈先升高后降低的变化趋势，28 ℃时y3-2的菌液终浓度最高，此时完全硝化0.5 g/L NaNO2所需时间为4 d。
2.2.2 pH对y3-2生长和硝化作用的影响pH不同会导致菌株酶活力的变化，从而使菌体生长和代谢能力发生改变[12]，传统研究认为pH在 6.5～8.0适宜NOB生长，在pH 8.0～8.5范围内NOB硝化效率最高[13]。
pH对y3-2生长和硝化作用的影响见图5。
从图5可以看出，pH为8.0时菌液浓度可达1.68×109 CFU/mL，明显高于其他处理，说明y3-2的最适培养pH为8.0，此时完全硝化0.5 g/L NaNO2所需时间为4 d。
2.2.3 摇床转速对y3-2生长和硝化作用的影响NOB是好氧性细菌，溶氧量对其生长有着重要的影响，一般而言溶氧需控制在2 mg/L以上[14]。
在一定温度下溶氧是装液比（培养基装液量/三角瓶体积）和摇瓶转速的函数，如果装液比固定则转速将直接影响培养基中的溶氧量。
y3-2在不同转速下的生长情况见图6，从图6可以看出，菌液终浓度随着转速的加快先快速升高，当转速达到200 r/min 及以上时菌液终浓度随转速加快而升高的趋势变得平缓，说明转速达到200 r/min 时溶液中的溶氧量已达到细菌最快生长所需的条件，再增大转速也无益于提高细胞浓度，反而消耗过多的能源，增大培养成本。
3 小结与讨论本研究针对一株硝化杆菌y3-2进行了培养基和培养条件的优化，优化后培养液中的菌液终浓度达到了4.31×109 CFU/mL，并且培养时间从初始的7 d缩短至4 d，减少了接近一半的培养周期，为亚硝酸氧化细菌的工业化生产奠定了一定的基础。