改良小鼠酒精性肝损伤模型的建立

【关键词】 肝疾病，酒精性； 胃造口术； 肝损伤； 疾病模型，动物
Modelling the chronic alcoholic liver disease in mouse ZHU Qiang，WANG Ke，QIAN Xiao-feng，RAO Jian-hua，WANG Xue-hao，LI Xiang-cheng，LV Ling△ ，ZHANG Feng* ． * Center of Liver Transplantation， First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China； △ Department of Medicine， University of Southern California，USA Corresponding authors： ZHANG Feng，Email： zhangf@ njmu． edu． cn； LV Ling，Email： lul@ usc． edu
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中华临床医师杂志（ 电子版） 2010 年 9 月第 4 卷第 9 期 Chin J Clinicians（ Electronic Edition） ，September 15，2010，Vol． 4，No． 9
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改良小鼠酒精性肝损伤模型的建立
朱强 王科 钱晓锋 饶建华 王学浩 李相成 吕凌 张峰
中华临床医师杂志（ 电子版） 2010 年 9 月第 4 卷第 9 期 Chin J Clinicians（ Electronic Edition） ，September 15，2010，Vol． 4，No． 9
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肝损伤模型的制作方法非常必要。本文主要介绍了改良后的酒精性肝损伤模型、生化指标及病理学变化 过程。
三、统计学处理 采用 SPSS 10. 5 统计软件进行分析。计量资料以均数 ± 标准差（ x珋± s） 表示，组间比较采用 t 检验，P ＜ 0. 05 为差异具有统计学意义。
结果
1. 一般情况： 生理盐水组皮毛光泽，行动灵便，饮食正常，大便未见异常。ZQ 液注入小鼠后，轻者行走 不便，动作迟钝，重者醉倒嗜睡，约 60 min 开始恢复。4 周、6 周、8 周、12 周末四组小鼠肝重、体重值见表 1。
材料与方法
一、材料 1. 主要试剂： 自制 ZQ 液，主要成分： 60% 的乙醇 18 g·kg － 1 ·d － 1 （ 购自上海振兴化工一厂） ，吡唑 25 mg·kg － 1 ·d － 1 （ 东京化成株式会社） ，橄榄油8 g·kg － 1 ·d － 1 （ 国药集团化学试剂有限公司） 。 2. 实验动物与分组： 健康成年雄性 ICR 小鼠（ 清洁级） 由南京医科大学动物房提供，体重（ 25 ± 2） g。实 验分为四组： A 组，正常对照组（ n = 12） 。B 组，胃造瘘后给予生理盐水（ n = 12） 。C 组，胃造瘘后给予 60% 的乙醇（ 18 g·kg － 1 ·d － 1 ） （ n = 22） 。D 组，胃造瘘后给予自配的 ZQ 液（ n = 22） 。在此期间，小鼠饲养于南 京医科大学清洁级动物实验室内。实验遵守实验室的动物实验相关规定。 二、方法 1. 模型建立： 8 ～ 10 周龄、重 20 ～ 25 g 雄性 ICR 小鼠 70 只，参照 Tsukamoto 等［2］的方法并加以改进。用 2% 戊巴比妥钠 2 ml / kg 腹腔注射，麻醉小鼠。常规剔除上腹部毛发，消毒后沿腹中线做一2 cm 切口，依次切 开皮肤和腹壁。暴露胃左侧壁（ 胃大弯中下 2 /3 处） ，做一约 2 mm 切口。利用临床用输液皮条（ 图 1A） 制成 造瘘管，将预留带有1 mm卡口处（ 图 1B） 埋入并荷包缝合固定（ 图 1C） 。荷包缝合后，将输液皮条经背部导 出，留 4 ～ 6 cm 后固定于皮肤处，并用塞子封闭端口（ 图 1D） 。采用连续缝合关闭腹腔。术后小鼠给予分笼 饲养。D 组小鼠胃造瘘前适应性地给予高脂肪饮食 1 周，从第 2 周开始向导管内注入 ZQ 液。
【摘要】 目的 探索建立简便和稳定的酒精性肝病（ ALD） 的动物模型。方法 利用简易胃造 漏的方法，将实验动物分为四组，A 组为正常小鼠（ n = 12） ； B 组为胃造瘘后给予生理盐水（ n = 12） ； C 组为胃造瘘后给予酒精（ 18 g·kg － 1 ·d － 1 ） （ n = 22） ； D 组小鼠给予自制的 ZQ 液（ n = 22） 。实验动态 观察 12 周，分别在第 4 周、6 周、8 周、12 周测四组小鼠肝重、体重值并检测肝脏 ALT 和 AST 水平，同 时收集肝脏标本经 HE 染色后光镜观察肝组织的结构变化。结果 C 组模型与 A 组和 B 组比较也出 现不同程度的肝脏损害，但损害的程度较 D 组轻。D 组小鼠在 4 周开始出现了肝细胞脂肪变性，8 周 开始出现酒精性肝炎和轻度的肝纤维化，12 周时出现肝脏纤维化的表现。结论 简易胃造瘘法配合 ZQ 液可以建立简便和稳定的酒精性肝损伤模型。
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中华临床医师杂志（ 电子版） 2010 年 9 月第 4 卷第 9 期 Chin J Clinicians（ Electronic Edition） ，September 15，2010，Vol． 4，No． 9
性肝细胞，胞浆内可见 Mallory 小体； 3 期： 在慢性酒精性肝炎病变基础上，发生肝细胞弥漫变性、坏死和胆汁 淤积。酒精性纤维化 1 期： 肝细胞周围纤维化见于 3 带或波及 2 带，少数纤维间隔形成，小叶结构保留； 2 期： 纤维间隔增多，广泛肝细胞周围及静脉周围纤维化，至小叶结构紊乱； 3 期： 早期有时可见广泛的终末静 脉周围纤维化，沿 3 带形成含扩张血窦的血管纤维间隔，将小叶分隔成微小结节。
【Abstract】 Objective To establish a flexible and stable alcoholic liver disease （ ALD） model of mice． Methods Animals were randomly divided into four groups． Group A were normal mice （ n = 12 ） ； Group B were given normal saline after gastrostomy（ n = 12） ； Group C were given alcohol after gastrostomy （ 18 g·kg － 1 ·day － 1 ） （ n = 22） ； Group D were given homemade ZQ fluid（ n = 22） ． The liver ALT and AST levels were dynamically monitored for 12 weeks． The mouse from every group were measured liver weight，body weight and detected levels of ALT and AST at the 4，6，8，12 weeks respectively when the liver were collected at the same time． The pathologic change of hepatic tissue in both groups was observed respectively in light microscope after HE staining． Results Compare to group A and group B，live of group C was damaged obviously，but lighter than that of group D． Four weeks later，group D beginning to emerge fatty degeneration． At 8 weeks group D began to appear in alcoholic hepatitis and mild liver fibrosis，and the liver become fibrosis at 12 weeks． While no pathologic change was found in the control group． Conclusions Simple gastric fistula with ZQ fluid transfusion can establish the flexible and stable model of alcoholic liver injury．
DOI： 10． 3877 / cma． j． issn． 1674-0785． 2010． 09． 012 基金项目： 江苏省医学领军人才基金（ 200707） ； 江苏省卫生厅开放课题（ ZX05-200904） 作者单位： 210029 南京医科大学第一附属医院肝移植中心 卫生部活体肝移植重点实验室（ 朱强、王科、钱晓锋、饶建华、王学浩、李相 成、吕凌、张峰） ； 美国南加州大学医学系（ 吕凌） 通讯作者： 张峰，Email： zhangf@ njmu． edu． cn； 吕凌，Email： lul@ usc． edu
2. 肝脏功能的动态变化： 4 周、6 周、8 周、12 周末四组小鼠的动态肝功指标见表 2。相对于 A 组和 B 组，C 组、D 组的 ALT 和 AST 水平明显增高，且 D 组的水平明显高于 C 组（ P ＜ 0. 05） ，表明 D 组肝脏损伤 明显。
3. 肝脏组织肉眼观察： 正常小鼠 A 组未见黏连，肝脏外观红润，解剖结构清晰。生理盐水 B 组部分肝组 织与胃有黏连，考虑为手术所致，肝脏大体色泽正常，被膜完整光滑。C 组色泽稍暗，与周围器官有黏连。D 组色泽灰暗，颗粒状，油腻，与周围器官黏连严重。
【Key words】 Liver disease，alcoholic； Gastrostomy； Liver injury； Disease models，animal