细胞因子

按照产生CK的细胞种类进行分类：
淋巴因子（lymphokine）主要由淋巴细胞产 生；如IL-2、 IL-3、 IL-4 单核因子（monokine）主要由单核-巨噬细胞 产生；如TNF-γ、G-CSF和M-CSF 其它 主要由血管内皮细胞、上皮细胞、成纤 维细胞等产生；如EPO、SCF等
stem cell factor（SCF）干细胞因子
该过程通常十分短暂，且Ck的mRNA极易降解， 故CK合成具有自限性。
(作用方面特性)
4 高效性 10-12mol/L
5 主要以自分泌（autocrine）、旁分泌（paracrine）
形式发挥效应 某些细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α）也可以内分泌 （endocrine）形式作用于远端靶细胞,介导全身性 反应。 某些ck还可以通过细胞内分泌（intracrine），直接与 细胞内受体结合。

基因位于9号染色体


分子量19KD
166个氨基酸残基组成
白色薄壳状疏松体
等电点4.0-6.5
最大吸收峰波长278±3nm
由含有高效表达人IFNα1b基因的大肠杆菌,经发酵、 分离、纯化后制得。
稳定性及保存

耐酸（pH=2下稳定）
热稳定性较好


对各种蛋白酶敏感
2-8 ℃避光保存和运输
针剂 溶液剂(滴眼液) 针剂 栓剂
IFN-α2b
IFN-γ
针剂
针剂
IFN-α1b

人体白细胞重组干扰素 IFNα1b：世界上第一 个采用中国人干扰素基因克隆和表达的 IFNα1b型干扰素。

商品名为赛若金。深圳科兴生物制品有限公司 生产，有300万U/支和500万U/支两种剂量
特点及理化性质
原理：用干扰素样品处理易感细胞，使细胞建立抗病
毒状态，然后用适当的定量病毒攻击细胞，通过病毒 复制的量或病毒引起的细胞病变程度可判断样品中干
扰素的生物活性。
常用细胞株
WISH（人羊膜细胞 ）、MDBK（牛肾细胞 ）、L929 （小鼠肺纤维瘤） 、Hep2/c（人喉癌细胞）
要求：易培养,对病毒敏感性高,易于诱导抗病毒状态,
细胞因子
（cytokines）
第一节 细胞因子概述
一、概念
细胞因子(cytokine，CK)是由细胞（免疫细胞、
非免疫细胞）经刺激而合成、分泌的具有广泛生物
活性的小分子蛋白质的统称。

免疫细胞：单核－吞噬细胞、T细胞、B细
胞和NK细胞

非免疫细胞：血管内皮细胞、表皮细胞、
成纤维细胞、上皮细胞也可以产生细胞因 子
干扰素
名称
IFN-α IFN-β
氨基酸数
166 166
受体
CD118 CD118
产生细胞
白细胞 成纤维细胞
功能
抗病毒，抗肿瘤，促进 MHC I类分子的表达 抗病毒，抗肿瘤，促进 MHCI类分子的表达
IFN-
143
CD119
激活巨噬细胞，促进 T细胞、NK细胞 MHCⅡ分子表达和抗原提 呈，抑制Th2细胞
目前已发现200余种人类CK
二、细胞因子的共同特性
1 多数为低分子量的多肽或糖蛋白
（1）分子量 8～80 KD, <200 aa （2）组成
单体
大多数，如IL（interleukin）-2、IFN-α
二聚体 同二聚体：IFN(interferon)- 、 IL-10 异二聚体：IL-12(35KD/40KD)； 三聚体 TNF(tumor necrosis factor) (3)多数为单拷贝的基因(IFN-α除外)
6 多效性和重叠性

一种ck可以作用不同类型的靶细胞，产生多种生物效应 IFN-α除具有抗病毒作用外，还可以抑制成纤维细胞、上
皮细胞、内皮细胞的增殖；另外还可以活化NK细胞。

几种不同的ck可作用于同一类靶细胞，产生相同或者相似的生
物学效应。
IL-4、IL-5、IL-6等均可促进B细胞增殖和分化。
二 干扰素的生物学特性
广谱性
种属特异性 差异性 相对稳定性 相对安全性
IFN的相对稳定性

IFN-α、IFN-β对pH和温度比较稳定
pH=2的溶液中或60℃放置1h均不失活

IFN-γ对pH和温度的稳定性较差
pH<5时不稳定 60℃放置1h失活
IFN的毒副作用
流感样综合征 造血系统改变 消化系统反应 皮肤反应 内分泌系统的影响
其活性发挥受细胞基因组的调节和控制。
一、分型 (根据其来源、结构及生物学性质) 1. I型（抗病毒干扰素） IFN-α、IFN-β （1）分类 IFN-α 白细胞（主要为单核吞噬细胞）产生 分子量19KD 多基因产物 IFN-β 成纤维细胞及白细胞以外的细胞产生 分子量20KD 单基因产物 （2）主要诱生剂：病毒，polyI-C (人工合成双链RNA)
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STAT与另外一种DNA结合蛋白形成复合体， 进入细胞核，与IFN激活基因的增强子区 段相结合，去除抗病毒蛋白基因的转录抑
制，相关蛋白得以转录和翻译，从而使靶
细胞处于抗病毒状态。
干扰素效应分子
PKR
Pathways for IFN mediated antiviral action
五 干扰素（抗病毒）生物活性的研究方法
抗原提呈？
抗原提呈：是指抗原提呈细胞(antigen-presenting cell， APC)摄取抗原并将其处理成免疫原性多肽，以
抗原肽-MHC分子复合物的形式表达于APC表面，供T细
胞识别，从而产生免疫应答的过程。
2. Ⅱ型干扰素 （1）主要起免疫调节作用
1）活化巨噬细胞；
2）促进表达MHC-Ⅱ类分子，提高抗原递呈能力； 3）促进MHC-Ⅰ类分子表达和增强CTL细胞的杀伤活性; 4) 增强NK细胞的杀伤活性； 5）促进B细胞分化、增殖； （2）抗病毒和抗肿瘤作用(与Ⅰ型干扰素类似)。
STAT：信号转导
子和转录激活子
干扰素诱导JAK-STAT复合体 核内转移及调节基因转录机制

IFN与受体结合后引起受体分子的二聚化

与受体偶联的JAK激酶通过交互的Tyr磷酸 化作用而活化

活化的JAK激酶催化受体Tyr残基磷酸化， 并形成STAT分子的“停泊位点”

STAT在JAK激酶的作用下实现其C端Tyr残 基的磷酸化，并形成同/异聚合体，并离 开受体
对人体无害
常用病毒
滤泡口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV） 鼠脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis, EMCV） 要求:尽可能对人体无害，对靶细胞感染性强，能引起明 显的细胞病变。 常用体系 WISH－VSV体系
What’s the meaning of the cell line?
dsRNA诱生剂 代谢物诱生剂
其它
无菌接取血液置肝素管中 低速离心弃血浆，并补入细胞培养液
IFN-α 的 诱 生
加入少量IFN-α37℃温浴，以启动诱导
加入病毒，温浴37℃ 离心弃上清液
加入细胞培养液37℃培养18-24h
离心，取上清液 上清液中加入6mol/LHCl，调pH到2.0
4 ℃酸化处理
趋化因子 生长因子
colony stimulating factor，CSF
chemokines growth factor，GF ---六大类（按功能分类）
转化生长因子－β家族

转化生长因子β1、转化生长因子β2、转
化生长因子β3 骨形成蛋白，生长分化因子 激活素与抑制素

其它：Nodal蛋白
（4） 稳定性
对酸不稳定，在pH值2.0时极易破坏
干扰素的型别
同一型IFN按照氨基酸序列和组成差异可分为不同的亚型
23种α：如IFN-α1、 IFN-α2、 IFN-α3
1种β: IFN- β ; 1种γ: IFN- γ
同一亚型又因氨基酸的差异而分为多个亚亚型
如：IFN-α1 有： IFN-α1a、 IFN-α1b IFN-α2有：IFN-α2a、IFN-α2b、IFN-α2c
lymphocyte)细胞提呈抗原，从而实现对病毒感染细胞和肿
瘤等靶细胞的杀伤。 （2）免疫调节： 与Ⅱ型干扰素类似。
静止的CTL被靶细胞表面抗原肽-MHCI类分子复合物所活化后，就
活化为抗原特异性CTL效应细胞，发挥特异性杀伤靶细胞的功能。
主要机制有： 分泌穿孔素，穿入靶细胞膜，改变细胞渗透压，导致细胞溶解 分泌多种颗粒酶，介导靶细胞凋亡 分泌淋巴毒素，直接杀伤靶细胞
用6mol/LNaOH调pH到7.2-7.4 离心去沉淀，得粗制干扰素
七 干扰素类药物

按制作方法不同，可分为利用基因工程生产的重组
干扰素和自然干扰素两大类。

自然干扰素 类人体淋巴母细胞多亚型天然干扰素
（IFN-N1），葛兰素威康公司（英国）生产，商品 名为惠福仁。
典型临床药物
IFN-α1b IFN-α2a
肾脏损害
三、主要生物学活性
1. Ⅰ型干扰素
（1）抗病毒和抗肿瘤
1）诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白，干扰病毒复制； 2）增强NK细胞对病毒感染细胞和肿瘤细胞的杀伤； 3）促进细胞表面MHC（major histocopatibility complex）-Ⅰ类分子表达，有助于向CTL(cytotoxic T
摘自Microbiology and Immunology on-line
四 干扰素的作用分子机制
IFN与IFN受体结合 IFN信号传导途径，以激活细胞核内IFN相关基因 效应蛋白的产生
IFN的信号转导途径
JAK（Janus protein tyrosine kinase）-STAT（signal transducer and activator of transcription）信号通路为IFN 诱导基因表达的主要信号通路
核苷酸序列
氨基酸序列 (189,23个信号肽)
IFN-α2a

基因位于9号染色体


165个氨基酸
分子量19.2±1.92KD
等电点5.5-6.8
最大吸收峰波长278nm±3nm 白色薄壳状疏松体 由含有高效表达的人IFNα1b基因的大肠杆菌、酿酒 酵母,经发发酵、分离、纯化后制得。
CK的产生、生物学作用、受体表
达、相互调节等均具有网络性。
9 CK与激素、神经肽和神经递质共 同组成细胞间信号分子系统
三、
白细胞介素 干扰素 肿瘤坏死因子
细胞因子的种类
interleukins，ILs interferon，IFN tumor necrosis factor，TNF
集落刺激因子
How to subculture the cell line?
微孔板法测定IFN抑制细胞病变的活性
接种对数生长期细胞于细胞培养板
倍比稀释样品（干扰素） 弃培养液,加入待测样品,使细胞建立抗病毒状态 加入病毒液,培养24-48h 中性红染色,550nm测定OD值
六 干扰素的诱生 病毒诱生剂
（3）受体 IFN-α、IFN-β的受体为同一种分子，
该基因位于21号染色体，几乎能够在所
有有核细胞表面。
（4）稳定性
对酸稳定，在pH2.0时不被破坏
2.
II型（免疫干扰素） T细胞
IFN-
（1）主要细胞来源
分子量18kD 单基因产物 （2）主要诱生剂
抗原或有丝分裂原
(3)受体 基因位于6号染色体;表达在多数有核细胞表面
2 多细胞来源性
一种CK可由不同类型的细胞产生 如IL-1可由单核-吞噬细胞、内皮细胞、B细胞、成 纤维细胞、表皮细胞合成和分泌 一种细胞可产生多种CK 活化的T细胞可产生IL2～6、IL9、10、14；IFN-γ
3 短暂的自限性分泌
Ck一般无前体状态的储存 当CK产生细胞受到刺激后，启动CK基因转录，
如何获得各种蛋白的核酸和 蛋白序列？
138
29 二硫键
1
98 二硫键
IFN-α2a
165个氨基酸
即：肥大细胞生长因子mast cell growth factor/ MGF

促进IL-3依赖的早期造血前体细胞的增殖和分化 促进肥大细胞增殖 促进黑素母细胞的增殖
第二节
干扰素(IFN)
干扰素（interferon, IFN）
干扰素：是由多种细胞（如单核细胞、淋巴细胞） 产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作 用的可溶性糖蛋白。
Swiss小鼠胚胎成纤维细胞
7 拮抗性和协同性

不同的CK对同一靶细胞功能的影响可相互拮抗. 例如IFN-γ可活化巨噬细胞，而IL-4则抑制巨噬细胞功能。

协同性：一种CK可强化另一CK的功能. 例如，低浓度IFN-γ或TNF单独应用均不能激活巨噬细胞，但 联合使用则有显著激活作用。
8
网络效应