WesternBlot基本原理过程及注意事项
蛋白印迹——western-blot-实验流程及注意事项
蛋白印迹——Western blot实验流程及注意事项各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。
此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。
Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。
这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。
特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。
印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。
一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。
WesternBlot（步骤简略,但注意事项经验总结基本原理很全面）
Western Blot（步骤简略，但注意事项、经验总结、基本原理很全面）1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL 调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用T ris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH 太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gT ris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。
Western Blot实验方法原理步骤及注意事项
Western Blot实验方法原理步骤及注意事项4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H2021.0 μl。
二、蛋白样品制备1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
）（6）于4℃下12000 rpm离心5 min。
（提前开离心机预冷）（7）将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。
2. 组织中总蛋白的提取（1）将少量组织块置于1～2 ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
（2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。
然后置于冰上。
（3）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
Western blot 实验步骤及其注意事项
Western blot 实验步骤及其注意事项注意事项：western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态，空间结构改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。
这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶标记亲和素进行western blot。
实验中取胶和膜需带手套。
Western可以参考如下步骤进行操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
如果使用碧云天生产的Western及IP 细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。
该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE 的配方。
(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
1. 引言1.1 概述Western blot技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于检测、定量和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达和相互作用。
它具有高灵敏度、高特异性和较为准确的测量能力，因此在医学科研领域中得到广泛应用。
1.2 文章结构本文将详细介绍Western blot技术的原理、方法、注意事项以及在医学科研中的应用。
首先，我们将阐述免疫检测原理、蛋白质分离与转移原理以及免疫染色与检测原理，帮助读者全面了解该技术的基本原理。
其次，我们将描述样品制备与电泳条件设置、蛋白质转移与固定方法以及免疫染色及可视化方法，为读者提供详细的实验步骤。
随后，我们将介绍实验室操作要求及安全措施、样品处理和保存注意事项以及技术参数调整和结果解读注意事项，以保证实验的准确性和可重复性。
最后，在医学科研领域中的应用方面，我们将以蛋白质表达水平检测、蛋白质亚细胞定位分析以及蛋白质相互作用和功能分析为例，展示Western blot技术在疾病诊断和药物研发等方面的重要应用。
1.3 目的本文的目的是为读者提供对Western blot技术全面了解，并指导其在医学科研中正确应用该技术。
通过详细介绍该技术的原理、方法和注意事项，读者将能够准确地进行实验操作并正确解读结果，同时也能够认识到其在医学科研中的重要性和广泛应用价值。
2. Western blot技术原理2.1 免疫检测原理Western blot技术是一种常用于检测特定蛋白质的免疫学方法。
它基于抗原与抗体的特异性结合关系，通过将蛋白质溶液经过电泳分离、转移到固体载体上，并使用特异性抗体识别目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质的定性和定量检测。
在Western blot中，首先需要将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。
然后，通过将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶或其他固体载体上，在固相载体上形成一个被称为“Western blotting”的蛋白质模式。
Western Blot 实验技术操作及注意事项,实验准备,样品制备,实验技巧
常用的转移膜主要有PVDF膜( Polyvinylidene-
Fluoride)和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白质的结
合能力高,灵敏度高,不易破碎,同时也适用于再次标记
(PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中以增加膜的亲水性)。
✓其他注意事项
而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。
1. 从负极（黑板）到正极（透明板）方向依次：纤维垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤
✓膜标记正反面 转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用
有色分子量 Marker或转膜后在膜上稍微剪断一个角(可 自由决定剪断方向),会有利于判断膜的方向。 ✓其他注意事项 1. 封闭时间不宜过长，封闭时间过长会抑制抗原抗体
反应及标记抗体的酶活性。 2. 注意避免让膜变干。
4.一抗反应
✓一抗的选择 抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别
1 × TBST缓冲液配制：TBS粉末，溶于2L蒸馏水中，再加入2mL TWEEN - 20。
9. Western Blot实用小技巧
9. Western Blot实用小技巧
谢谢大家
组织取绿豆粒大小（30~50 mg ）组织，加入预冷的RIPA裂解液，按照质量 体积比1：10 比例加入RIPA 裂解液（PMSF和PIC 1:100 v/v ）。然后予以组织匀 浆机处理，全程在冰上操作。匀浆结束后，将所有样本静置于冰上30 min，
上述裂解液离心，4 ℃ 12 000 rpm 离心 20 min 收集上清（即蛋白原液），避 免吸到沉淀。吸取10uL蛋白用于定量，剩余蛋白加入5 x loading buffer 进行充分 混匀（5 loading buffer和蛋白组织液比1:4），在98 ℃条件下加热10 min，然后进 行分装后保存于-20 ℃冰箱中。
westernblot实验步骤
westernblot实验步骤Western blot实验是一种常用的免疫学检测方法，适用于分析特定蛋白质的存在量、大小和结构等。
下面将介绍Western blot实验的主要步骤，以及注意事项。
1. SDS-PAGE凝胶电泳Western blot实验首先需要进行SDS-PAGE凝胶电泳。
SDS-PAGE （Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种分离蛋白质的方法，可以根据蛋白质的大小将其分离离子定位在凝胶中相应的位置。
在SDS-PAGE中，蛋白质会被特定化学物质SDS （十二烷基硫酸钠）包裹，其带负电荷的端口相互排斥，并使蛋白质在电场中沿着凝胶运行，根据大小排序在不同位置。
2.转移蛋白质到膜上SDS-PAGE电泳完毕后，需要将蛋白质迁移到聚丙烯腈或硝酸纤维素膜上。
转移可以采用湿式或半干燥式方法，膜的种类和转移缓冲液的浓度、pH值等因素都会影响转移效果。
3.蛋白质与抗体结合膜上的蛋白质需要与浓度足够的抗体进行结合，使其出现颜色。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体，通常由动物免疫学制备而成。
在结合抗体之前，膜需要被阻断，以避免非特异性的背景信号。
4.识别蛋白质识别特定蛋白质需要使用标记有酶、荧光体或放射同位素等的二抗或底物。
蛋白质与特定抗体形成复合物后，可以使用二抗结合在蛋白质与一抗之间。
底物是标记于蛋白质特定抗体上的酶，在底物的作用下，可生成可见信号，如液态手套（ECL）。
注意事项：1.蛋白质的提取和纯化，提取方式会影响到实验结果，选择适当的提取方法是十分重要的。
2.涉及到蛋白质电泳和转移过程，准确控制电泳时间和电压，转移条件、时间以及温度都会影响转移效果和转移后的后续步骤。
3.在结合抗体前，必须阻断膜上的未被结合的蛋白质，减小背景信号。
通常使用酵素或乳清蛋白等物质进行阻断，以避免非特异性结合。
4.选择合适的底物，控制反应条件，避免过度堆积或实验时间不够导致底物显色偏低。
western blot技术的原理方法注意事项
western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术，其基本原理是蛋白质的印迹技术，即把蛋白质从复杂的样品中分离出来，并转移到固相支持物上，再与特异性抗体结合，通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。
二、方法1.样品处理：首先，需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。
根据样品性质，可以采用不同的提取方法，如细胞裂解液、组织匀浆液等。
2.凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中，通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。
3.免疫反应：将膜上的蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.显色反应：通过化学反应，使抗原-抗体复合物显色，便于观察和拍照。
5.电子显微镜观察：对于较小的样品，可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。
三、注意事项1.样品处理：提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度，避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。
2.凝胶电泳：分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行，以确保蛋白质能够完全分离。
同时，应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数，避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。
3.免疫反应：应注意抗体滴度的选择，确保抗体能够充分识别目标蛋白质。
同时，应避免使用过期或质量不佳的抗体。
4.显色反应：应注意显色试剂盒的质量和操作步骤，确保显色反应充分且颜色易于观察。
同时，应注意显色颜色的稳定性，避免因颜色不稳定影响结果判断。
5.电子显微镜观察：应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护，确保电子显微镜能够正确成像。
同时，应注意样品的制备和处理，确保样品能够被电子显微镜准确观察。
6.实验条件：实验过程中应注意调整实验条件，如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等，以确保实验结果的准确性和可靠性。
7.重复性：在进行Westernblot实验时，应注意重复性实验的开展，以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。
总之，Westernblot技术虽然复杂，但只要掌握了其原理和方法，并注意以上注意事项，就能够获得准确可靠的结果。
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W e s t e r n B l o t基本原理、过程及注意事项
原理
是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
主要有三个过程：蛋白质电泳、转膜、检测。
样品的准备
样品种类主要有培养的细胞、组织（需磨碎）、特殊细胞（切割下来的肿瘤细胞）等。
1、裂解液主要有RIPA和三去污两种，RIPA适用于细胞质中蛋白检测，而三去污适用于总
蛋白。
三去污又分为离子型和非离子型。
离子型的裂解能力较强如SDS等，非离子型的包括NP-40、Tritonx-100。
2、裂解液的成分，
3、样品缓冲液samplebuffer
备注：
1、样品应保持低温，且实验过程应低温操作，此举为了抑制酶的活性。
裂解完后样品液
会显得粘稠是长结构DNA所致，故需要匀浆，打断DNA。
一般不用超声，因为容易引起蛋白不可逆的变性。
2、用2X样品缓冲液与样品1：1混匀。
4度保存。
3、样品混合液加样前需要100℃或沸水浴加热3-5分钟并迅速插入冰中，以充分变性蛋
白。
配胶：
胶的主要成分为丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
4、分离胶的配方：以20ml的8﹪分离胶为例：
5、浓缩胶配方：6ml为例
备注：
1、制胶是避免产生气泡，空气会影响胶的聚合，在蛋白质表观分子量分析时影响大。
2、因为有SDS，每次混匀时不应剧烈以免产生过多气泡。
3、蛋白容易与SDS脱离而失去负电荷,因此胶中加入SDS为了给蛋白持续的负电荷。
4、垫条清洗干净，与制胶板压紧，避免漏胶。
5、制胶时，加水应缓慢不要破坏胶面，其作用：可以平衡胶面，赶气泡等。
胶固定后用
滤纸吸除干净，有水跑胶时条带会歪。
6、先插梳子再灌浓缩胶。
溴酚蓝快跑出胶时停止。
转膜
根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Westernblot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC)和PVDF膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲
和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。
因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC膜。
大于20kD的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。
PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。
但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡湿透。
装配转移根据三明治原则：海绵→层滤纸→胶→膜→层滤纸→海绵。
膜应先浸入纯甲醇湿透。
每层放好后，加紧夹板。
切记：
将转移槽置于冰浴中，放入“三明治”（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，250mA，2h。
注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。
转膜结束后，切断电源，取出蛋白膜。
备注：
1、整个过程保持膜的湿润不能干掉。
干会产生气泡。
转膜时气泡处蛋白会跑向旁边。
2、膜入甲醇时斜而慢，避免产生气泡。
3、转膜缓冲液一般不加SDS，但大槽时因导电性差需加少量，加甲醇用于维持膜与水的相亲
性。
4、由于甲醇易挥发，加入15﹪-20﹪甲醇时应带盖混匀。
5、三明治插到槽中时，槽中需要有液体。
6、电流不能过高，高电流易产热，过热会使条带扩散。
封闭
1．用25mlTBS洗膜5min，室温，摇动。
2．置膜于25ml封闭缓冲液中1h,室温，摇动。
备注：
1、封闭缓冲液可用0.5%牛血清白蛋白，但价贵。
常用5%脱脂奶粉。
2、封闭的作用是结合膜上其他的活性位点，防止抗体与之结合。
3、一般室温轻摇1-2h，也可以4度过夜，或者37度0.5h（一般背景会高）。
免疫杂交与显色
1．15mlTBS/T洗3次（5min/T）。
2．加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。
3．15mlTBS/T洗3次（5min/T）。
4．加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。
5．15mlTBS/T洗3次（5min/T）。
6．15mlTBS洗1次。
7．蛋白检测(显色法或发光法)。
备注：
1、稀释的抗体可用5%的牛奶增加蛋白浓度。