荧光素FITC标记抗体的方法
异硫氰酸荧光素标记机理
异硫氰酸荧光素标记机理
异硫氰酸荧光素标记是利用化学反应将异硫氰酸荧光素（FITC）标记在目标分子上，用于生物医学和细胞生物学的研究。
FITC是一种荧光染料，可被激发发射绿色荧光，特异性标记分子后，可通过荧光显微镜或流式细胞仪等技术进行检测和定量。
异硫氰酸荧光素标记机理包括两个步骤：活化和标记。
首先，异硫氰酸根离子（NCS）与FITC分子中的胺基发生互反应，生成活化的FITC异硫酰（FITC-O-S-C-NH2），它具有高度反应性和亲水性，易与含有游离胺基、硫氢酰基或巯基的分子反应。
然后，FITC异硫酰与目标分子中含有以上官能团的基团结合，生成FITC标记分子。
异硫氰酸荧光素标记技术具有灵敏、可重复和定量等优点，常用于荧光标记抗体、蛋白质、核酸和细胞等生物大分子以及药物等小分子的研究。
荧光素FITC标记抗体的方法
荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1．Marsshall法(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol／LPBS等。
(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。
f．PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。
FITC标记抗体流程
其中FITC应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长520～530nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。
FITC分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.0～9.5)条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。
抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。
当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。
一,FITC标记抗体流程（1）将待交联的蛋白（浓度≥1mg/ml）对交联反应液透析三次(4 ℃)，至pH＝9.0。
交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。
（2）将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/ml。
每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。
（3）按P:F（蛋白质：FITC）=1mg:150μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 ℃反应8 hr。
（4）加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L， 4 ℃终止反应2 hr。
（5）将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
（6）交联物的鉴定蛋白浓度(mg/ml) = [ A280– 0.31×A495] / 1.4F/P比例: 3.1×A495 / [A280–0.31×A495]，该值应介于2.5 ~ 6.5之间。
（7） FITC交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃暗处保存。
二,免疫荧光组织化学染色方法1.直接法简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。
操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。
荧光素FITC标记抗体方法
荧光素FITC标记抗体的方法当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1．Marsshall法(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或3．0的0．01mol／LPBS等。
(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。
f．PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。
(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。
(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。
(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。
if和ihc法
if和ihc法
IF和IHC法是两种常用的免疫组织化学技术，用于检测组织
或细胞中特定蛋白的表达情况。
IF（Immunofluorescence）法是一种利用荧光染料标记抗体或
抗原的技术。
首先，组织样本或细胞样本被固定并与特异性的抗体结合。
然后，将荧光染料标记的二抗加入样本中，与前一步所结合的抗体结合形成复合物。
最后，通过荧光显微镜观察，根据荧光信号的分布，可以判断特定蛋白在细胞或组织中的表达情况。
相比之下，IHC（Immunohistochemistry）法使用酶或酶标记的二抗，并使用染色剂表现酶的活性，用于显示特定蛋白在组织细胞中的位置和含量。
首先，组织或细胞样本被固定并与特异性的抗体结合。
然后，添加酶标记的二抗，使其与前一步中的抗体结合。
接着，通过染色反应，如使用DAB（二氨基苯）
等染色剂，使标记的抗体和酶形成可见的染色产物。
最后，通过光学显微镜观察，根据颜色的分布和密度，可以判断特定蛋白在样本中的表达情况。
两种方法都可用于定性和定量分析蛋白的表达水平和定位。
选择使用哪种方法取决于研究的具体需求和样本特点。
荧光素标记抗体技术
荧光素标记抗体技术(一)原理目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或罗达明(Lis samine rhodamine B200, RB200)。
在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。
在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。
(二) 操作步骤将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，透析后抗体液移入小烧杯中↓称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO)使终浓度为1mgFITC／1mlDMSOFITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFITC／mgIgG；如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG在10ml小烧杯中先放入抗体↓按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中↓将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h↓用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G25柱↓收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P比值。
第二个荧光素峰为游离荧光素计算:2.87×A495F／P＝────────A280-0.35×A495合适的F／P值为2～4。
(三) 试剂器材1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。
2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。
3. PBS、DMSO4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na2CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。
5. PD10柱(Sephadex G25柱)6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等(四) 注意事项1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。
荧光标记抗体
F/P=
2.87×OD495nm OD280nm－0.35×OD495nm
注意事项
1.影响标记效率的因素有温度、时间、pH、荧光素和蛋白 的量等，需注意控制。 2.荧光素及其标记抗体的操作过程注意避光，搅拌速度应适 当以避免气泡产生。 3.层析柱装柱注意正确操作，使柱体均匀、柱面平整，无气 泡、裂隙。 4.上样和洗脱时应做到“前切”和“后切”。“前切”指柱 顶缓冲液与凝胶平面相切时再加样品；“后切”指样品走至 与凝胶平面相切时再加入洗脱缓冲液。
常用于标记的荧光素： 异硫氰酸荧光黄（FITC） ） 四乙基罗丹明（RB200） ）
（2）标记抗体的纯化
①透析法 ②层析分离法
（3）荧光抗体的鉴定
F/P比率： F/P 将制备的荧光抗体稀释至A280≈1.0 A ≈1.0，分 别测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记 A 荧光素的特异吸收峰。
F/P值 F/P
实验步骤
收集：当黄绿色荧光出现在洗脱液时，用试管收集全 部黄绿色荧光溶液。 黄色荧光溶液洗脱较慢，用蒸馏水洗脱约15分钟，直 至黄色荧光消失，停止洗脱后，将柱内凝胶回收入凝 胶瓶内。
实验步骤
将试管内收集的溶液混匀，作10倍稀释 （0.8ml+7.2ml PB）后在紫外分光光度计分别测 OD495nm和OD280nm值。 计算F/P值，并对该比值作一简单分析。
用Sephadex G-50装25cm层析柱，凝胶沉积约18cm （离管口7 cm，避免凝胶柱干掉），用pH7.0， 0.005M 磷酸缓冲液（PB）平衡洗脱约10分钟，流速 控制为1ml/分钟。 吸取上述标记液上凝胶柱，注意不可使柱面干掉。 用pH7.0，0.005M PB洗脱，流速控制为1ml/分钟。 可看到黄色与黄绿色荧光在凝胶柱分开。
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荧光素FITC标记抗体的方法
当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。
一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下
FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质
常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。
1．Marsshall法
(1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光
素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或
3．0的0．01mol／LPBS等。
(2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为
20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。
②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。
也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。
a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。
b．总蛋白量(AXB)＝Crag。
c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。
d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。
e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。
f．PBS量D-(B+F)=Gml。
注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。
③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，继续避光搅拌12h左右。
结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故需将烧杯和搅拌器一起移人4℃冰箱中。
④透析结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心(2500r／
min)20rain，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中，再置于烧杯中，用pH8．0缓冲盐水透析(0～4~C)过夜。
⑤过柱取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶SephadexG-25或G—50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。
洗脱液：0．01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．2)；过滤量：12ml标记全球蛋白液(过滤前未透析)；收集量：20ml(稀释1．7倍左右)。
2．Chadwick法
(1)试剂和材料抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%碳酸钠水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、离心机及离心管、烧杯（25ml）搅拌器、无菌吸管，无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）透析袋等。
(2)方法及步骤①抗体准备用o～4~C的pH8。
0磷酸盐缓冲盐水将球蛋白溶液稀释至浓度为30～40mg／ml，置入25ml烧杯内，放于冰槽中。
②荧光色素准备按每毫克免疫球蛋白加入荧光素0．01rug计算，称取所需的荧光素，用3％碳酸钠水溶液溶解。
③将准备的抗体与荧光色素溶液等量混合，充分搅匀，在o～4~C 冰箱中结合(最好在磁力搅拌机上持续搅拌)18～24h。
④透析和柱层析方法同Marsshall法。
3．改良法
(1)试剂和材料①0．01mol／L(pH7．2)PBS配法中，校定pH 至7．2。
NaCi 18g、Na2HP04 1．15g，溶于2000ml蒸馏水
②0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液配法取0．5mol／LNazCOs(5．3％)10ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合后，校定pH至9．0。
③3％碳酸钠水溶液配法称L 5g无水碳酸钠充分溶解于50ml
灭菌蒸馏水中即成。
④其他试剂和材料l％叠氮化钠、离心机及离心管、烧杯(25m1)、搅拌器、无菌吸管及毛细滴管、烧杯(500m1)透析袋等。
(2)方法及步骤①取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水(0．15mol／LNaCl)及缓冲液(0．5mol／
LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀释使每毫升内含蛋白质lOmg，缓冲液为总量的10％，降温至4℃。
②加入异硫氰酸盐(FITC)荧光素[蛋白：荧光素＝
(50—80)mg‘lmg]，在0～4℃
下电磁搅拌12～14h。
③然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋白沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵(用Nessler试剂测验，至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止)。
④将制备好的荧光抗体加叠氮化钠o．01％，分装在lml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中(4℃)可以用半年以上，一20~C保存可达2
年以上。
4．透析标记法
此法适用于小量抗体的荧光素标记，标记简便，非特异性染色较少。
(1)试剂和材料试剂和材料同改良法。
(2)方法及步骤①用0．025mol／L碳酸盐缓冲液pH9．0，将欲标记免疫球蛋白稀释成1％浓度，装入透析袋中。
②用同一缓冲液将FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液体积的10倍，将FITC稀释液盛于圆柱形容器内，并使透析袋浸没于FITC液中。
③容器顶端盖紧，底部放搅拌棒，在4~C电磁搅拌下透析标记24h。
取出透析袋中标记液，即刻用SephadexG50凝胶过滤，去除游离荧光素，分装，贮存于4℃中。
FITC
CAS#：3326-32-7
中文名：异硫氰酸荧光素
英文名：Flourescein iso-thiocyanate；FITC
结构式：
分子式：C21H11NO5S
分子量：389.38
性质：
1. 外观：黄色粉末
2. 纯度：≥95% (HPLC)
3. 产品描述：
FITC能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。
通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。
用于医学，农学和畜牧等方面，可对由地细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。
4. FITC标记抗体流程：
（1）将待交联的蛋白（浓度≥1mg/mL）对交联反应液透析三次4 ℃，至pH＝9.0。
交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1 L。
（2）将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL。
每次交联使用的FI TC均应新鲜配制，避光。
（3）按P:F（蛋白质:FITC）=1mg:150μg 的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4 ℃反应8 h。
（4）加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L，4 ℃终止反应2 h。
（5）将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
（6）交联物的鉴定
蛋白浓度(mg/mL) = [ A280–0.31×A495] / 1.4
F/P比例: 3.1×A495/ [A280–0.31×A495]，该值应介于2.5 ~ 6.5之间。
（7）FITC交联的蛋白应置于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1% NaN3、1% BSA，4℃避光保存。
储存条件：4℃避光保存。