抗体PE荧光素标记操作流程记录
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项免疫荧光技术是一种常用的免疫学研究方法，可以用于检测和定位抗原或抗体在细胞或组织中的表达和定位。
免疫荧光操作步骤及注意事项如下：步骤1：样品制备1.收集需要检测的细胞或组织样品。
2.如有需要，固定细胞或组织样品以保持其形态和抗原性。
3.如有需要，对组织样品进行切片以便于检测。
步骤2：抗体选择和标记1.根据需要选择合适的一抗和二抗，一抗用于识别目标抗原，二抗用于与一抗结合并携带荧光标记。
2. 选择合适的荧光染料或荧光标记，常用的有荧光素色素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）等。
3.根据供应商指南或经典实验文献中的方法，进行抗体标记。
步骤3：荧光标记试剂的制备1.根据推荐的配方或说明书，在标记试剂的缓冲液中加入合适的荧光染料或荧光标记，并进行充分混匀。
2.如有需要，可以在标记试剂中加入其他辅助试剂以增强染色强度或减少非特异性结合。
步骤4：样品孵育1.将样品均匀分布在载玻片或孵育板上，并使其附着。
2.加入一抗和二抗的混合物，并在暗处孵育一段时间，通常在室温下孵育1-2小时或在4°C下孵育过夜。
3.如果需要，可以在抗体孵育结束后进行染色或共孵育其他标记试剂。
步骤5：洗涤1.在孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤样品，以去除未结合的抗体和其他杂质。
2.洗涤次数根据需要，通常进行3-5次洗涤，每次洗涤时间约5分钟。
步骤6：显微镜观察和成像1.将标本置于显微镜上，并使用荧光显微镜或倒置显微镜观察荧光信号。
2.使用合适的荧光滤光片或滤片盒，选择适当的波长来显现荧光染色。
3.根据需要，使用数字相机或图像分析软件进行图像采集和分析。
注意事项：1.仪器和试剂的准备与操作一定要在无菌和干净的条件下进行，以避免外源性污染或感染的发生。
2.使用抗体和试剂前请仔细阅读供应商提供的说明书，遵守推荐的使用和储存条件。
3.一抗和二抗的选取要慎重，确保其与目标抗原或抗体具有高度特异性。
4.荧光标记试剂的制备要注意在无菌和干净的条件下进行，避免污染或降低荧光标记效果。
细胞免疫荧光标记实验步骤
细胞免疫荧光标记实验步骤细胞免疫荧光标记实验是用来观察和分析细胞中的特定分子或结构的一种常用方法。
下面是一些常见的细胞免疫荧光标记实验步骤：1. 细胞培养准备:- 在无菌条件下准备所需培养基和培养器具。
- 将待标记细胞接种在培养皿中，以适当的细胞密度使其在培养基中生长。
2. 固定细胞:- 将细胞培养皿中的培养基倒掉。
- 用生理盐水或磷酸缓冲液轻轻洗涤细胞，以去除未附着的细胞和培养基残留。
- 加入适当的固定液，例如4%的乙醛，固定细胞并封存其内部结构。
3. 渗透化处理:- 使用适当的渗透剂，如0.1%的Triton X-100，以打破细胞膜，使抗体能够渗透到细胞内部。
- 进行渗透化处理的时间应根据实验要求而定。
4. 抗体标记:- 制备适当的抗体和荧光染料稀释液。
- 将抗体稀释液加入到细胞上，使其与目标分子结合。
- 按照实验要求，在适当的温度和时长下孵育细胞，促使抗体与目标分子充分结合。
5. 洗涤和染色:- 用洗涤缓冲液充分洗涤细胞，以去除未结合的抗体和荧光染料。
- 使用适当的荧光染料对细胞进行染色。
如需防褪色，可以添加适当的抑制剂。
6. 显微镜观察和图像捕获:- 用适当的显微镜观察细胞，并捕获荧光图像。
- 根据需要，使用图像处理软件对图像进行分析和量化。
注意事项：- 实验前确保实验室和设备都是清洁的，并遵守实验安全操作规范。
- 涉及有害物质时，戴好个人防护用品，如实验手套和护目镜。
- 每个实验步骤的时间和条件可能因实验要求而异，需根据具体实验方案进行调整。
这些步骤提供了一般的细胞免疫荧光标记实验的大致流程，但具体实验方法还需根据实验目的和材料的特性进行优化和调整。
参考资料：[1] Smith, C. et al. ___. Cold Spring Harb. Protoc. 7, 1052–1055 (2013).[2] Manders, E. M. M. et al. FISH: ___. Cold Spring Harb. Protoc. 2006, db.rot4111 (2006).。
免疫荧光染色实验记录模板
免疫荧光染色实验记录模板
1. 实验日期和实验者信息，记录实验进行的日期和实验人员的姓名或编号，以便追溯实验操作和结果的责任人。
2. 样本信息，包括样本来源、处理方法、处理时间和处理条件等信息。
确保记录样本的处理过程，以便在实验结果出现问题时进行排查。
3. 抗体信息，记录使用的抗体信息，包括抗体的来源、批号、稀释倍数、存储条件等。
这些信息对实验结果的准确性和可重复性非常重要。
4. 染色条件，记录染色的条件，包括染色液的配制方法、染色时间、温度等。
这些条件对实验结果的准确性和可重复性有重要影响。
5. 显微镜观察，记录观察到的样本荧光信号情况，包括荧光强度、分布情况等。
这些观察结果是实验结果的直接呈现，需要详细记录。
6. 图像记录，如果有条件，最好拍摄实验样本的荧光图像，并记录图像的拍摄条件和处理方法。
图像记录可以作为实验结果的直观呈现。
7. 结果分析，对实验结果进行简要分析和总结，包括样本的阳性率、荧光强度的定量分析等。
这些分析结果可以帮助理解实验结果的意义和可靠性。
以上是免疫荧光染色实验记录模板的基本内容，通过完整记录实验过程和结果，可以提高实验的可重复性和结果的可靠性，为科研工作提供有力支持。
免疫荧光直接标记抗体 使用方法
免疫荧光直接标记抗体使用方法
免疫荧光直接标记抗体是一种常用的实验技术，用于检测细胞
或组织中特定抗原的存在。
下面我将从准备实验所需材料、实验步
骤和注意事项等方面来全面回答你的问题。
首先，进行免疫荧光直接标记抗体实验需要准备一系列材料，
包括目标抗体、荧光染料标记剂、缓冲液、洗涤缓冲液、封闭剂、
载玻片或培养皿、显微镜等。
在实验开始前，需要将所有材料准备
妥当并确保实验环境清洁。
接下来，进行实验步骤。
首先，将目标抗体与荧光染料标记剂
按照厂家提供的建议比例混合，然后在适当的条件下反应一段时间。
接着，将标记后的抗体与待检样本（如细胞或组织切片）接触，让
抗体与目标抗原结合。
随后，用洗涤缓冲液洗涤样本，以去除未结
合的抗体。
最后，加入封闭剂进行封闭处理，然后进行显微镜观察
或其他检测方法，就可以观察到目标抗原的荧光信号了。
在进行免疫荧光直接标记抗体实验时，需要注意一些事项。
首先，要严格按照厂家提供的实验操作手册进行操作，确保实验操作
的准确性和可重复性。
其次，要注意实验中的所有试剂和样本的保
存和处理条件，避免对实验结果产生影响。
另外，在实验过程中要注意个人防护，避免接触有害物质或受到实验操作的伤害。
总的来说，免疫荧光直接标记抗体的使用方法是一个相对复杂的实验技术，需要熟练的操作和严格的实验条件控制。
通过合理的实验设计和操作，可以准确、快速地检测细胞或组织中特定抗原的存在，为科研工作提供重要的帮助。
希望以上回答能够全面地解答你的问题。
流式抗体标记步骤
1)细胞膜荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。
②按照上样管标记分别加入对应的荧光抗体（一般抗体为20ul/100ul血，PE-Cy5和ECD标记抗体一般为10ul/100ul），室温避光反应15min。
③加入2ml溶血剂，避光室温溶血10min~15min，目测血样呈透明的淡红色，1500rmp离心5min，去上清。
④加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤两次。
⑤加入1mlPBS或者生理盐水重悬细胞，准备上样。
注意事项：●加入血样和抗体前，须注意编号和血样及抗体的一致性。
●实验室要注意冬天保温，夏天降温，防止室温过低或过高，影响抗原抗体反应。
●溶血时，溶血剂和血样的比例为50:1，当血样体积发生变化时，注意溶血剂体积的变化。
2)细胞膜kappa/lambda荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。
②加入2ml溶血剂，避光室温溶血10min~15min，目测血样呈透明的淡红色，1500rmp离心5min，去上清。
③加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤三次④沉淀物中按上样管标记分别CD45-PE-CY5和kappa/lambda试剂盒和同型对照，避光反应15~30min⑤加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤两次⑥保留沉淀物种加入1mlPBS或者生理盐水，准备上样。
注意事项：●沉淀物中的液体不能留太多，控制保留液体体积，保证抗体效价●溶血判断请参照细胞膜荧光抗体标记标准操作规程3)细胞内荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。
②按照上样管标记分别加入对应的包膜荧光抗体（一般抗体为20ul/100ul血，PE-Cy5和ECD标记抗体一般为10ul/100ul），室温避光反应10min。
③加入破膜剂试剂盒A液100ul剧烈震荡混匀，避光固定10min④加入约4ml（2/3上样管液体），1500rpm离心5min，去上清⑤沉淀物首先剧烈震荡混匀，然后小心加入破膜剂试剂盒B液100ul，不得震荡和剧烈摇晃，避光反应5min⑥加入上样管所标记对应的胞内荧光抗体，避光反应15min⑦加入约4ml（2/3上样管液体），1500rpm离心5min，去上清⑧重复步骤7两次，加入1mlPBS或者生理盐水，准备上样。
免疫荧光双标操作方法及注意事项
免疫荧光双标操作方法及注意事项一、试剂准备及实验准备1.标记抗体：根据实验需要，准备需要标记的一抗和二抗。
常用的标记物有荧光染料如FITC、TRITC等。
2.细胞或组织标本的固定：将要检测的细胞或组织标本用4%的多聚甲醛（PFA）或其他固定剂进行固定，并进行透明化处理如脱水和透明剂浸泡。
3. 阻断剂和洗涤缓冲液：准备含有蛋白质如BSA、牛血清白蛋白（BSA）和非离子表面活性剂如Tween-20的阻断剂和洗涤缓冲液。
4.标本处理：将固定的标本在洗涤缓冲液中进行多次洗涤，去除多余的固定剂。
5.孵育液：准备含有特定抗体和荧光标记抗体的孵育液，同时加入阻断剂以防止非特异性结合。
6.孵育：将洗涤后的标本用孵育液进行孵育，一般在室温下孵育1-2小时或在4℃下过夜。
二、显微镜观察及图像获取1.滴加反褪色剂：孵育完毕后，用洗涤缓冲液多次洗涤标本，之后加入反褪色剂如DAPI，并在黑暗中孵育15-30分钟。
2.洗涤和封片：用洗涤缓冲液洗涤标本多次，之后将标本转移到玻片上，加入封片剂后盖上盖片。
3.显微镜观察：将玻片放到显微镜上，使用荧光显微镜进行观察。
根据实验需要调整荧光滤镜和荧光强度。
4.图像获取：使用相机或图像分析软件获取荧光图像。
根据需要可以拍摄彩色图像，并使用图像处理软件进行图像调整与分析。
注意事项：1.实验卫生：在实验过程中需要保持实验台面和工作区干净，避免污染。
2.阻断非特异性结合：在孵育液和洗涤缓冲液中加入阻断剂，以防止非特异性结合，提高荧光信号的特异性。
3.控制实验参数：在进行实验时，需要控制实验参数的一致性，例如处理时间、温度、孵育液的浓度等。
4.标本固定：固定标本的时间和浓度需要根据标本类型和目的进行优化，过度固定可能会导致蛋白质的损失，而过轻固定则会导致识别困难。
5.孵育液的选择：根据实验需要选择好的一抗和二抗，合理选择荧光染料和孵育液，以获得明亮而清晰的荧光信号。
6.显微镜观察：根据实验目的和样本特点，选择适当的荧光滤镜和荧光强度，避免背景信号过强或过弱。
[教材]免疫荧光操作步骤及注意事项
![[教材]免疫荧光操作步骤及注意事项](https://img.taocdn.com/s3/m/bfd95ed44128915f804d2b160b4e767f5acf80ab.png)
免疫荧光操作步骤及注意事项一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般 30 min 已足够。
荧光抗体标记_实验报告
一、实验目的1. 掌握荧光抗体标记技术的基本原理和操作步骤。
2. 学会使用荧光显微镜观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。
3. 了解荧光抗体标记技术在生物医学研究中的应用。
二、实验原理荧光抗体标记技术是将荧光素与特异性抗体结合，形成荧光标记抗体。
这种标记抗体仍保持抗体原有的活性，当与相应的抗原发生特异性结合时，荧光标记抗体在荧光显微镜下呈现出明亮的荧光，从而实现对抗原的检测和定位。
三、实验材料1. 实验试剂：FITC标记的抗体、抗原、抗体稀释液、磷酸盐缓冲液（PBS）、甘油、甲醇等。
2. 实验仪器：荧光显微镜、离心机、移液器、吸管、试管、载玻片等。
四、实验步骤1. 标准化抗体将FITC标记的抗体用抗体稀释液稀释至适当浓度。
2. 制备抗原将待检测的抗原用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至适当浓度。
3. 制备细胞悬液将待检测的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，离心弃去上清液，加入适量的磷酸盐缓冲液重悬细胞。
4. 混合抗原与抗体将抗原与抗体按一定比例混合，在室温下孵育一段时间。
5. 洗涤将混合后的溶液在室温下用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次洗涤后离心弃去上清液。
6. 封片将洗涤后的细胞沉淀用甘油封片，封片剂与细胞沉淀的比例为1:1。
7. 荧光显微镜观察将封片置于荧光显微镜下观察，调整显微镜参数，观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。
五、实验结果通过荧光显微镜观察，发现荧光标记的抗体与抗原发生了特异性结合，形成明亮的荧光复合物。
阳性细胞在荧光显微镜下呈现出明显的荧光信号，而阴性细胞则无荧光信号。
六、实验讨论1. 实验过程中，抗体与抗原的孵育时间、洗涤次数和封片剂的选择对实验结果有较大影响。
本实验中，抗体与抗原的孵育时间为30分钟，洗涤次数为3次，封片剂为甘油。
2. 荧光抗体标记技术具有特异性高、灵敏度高、操作简便等优点，广泛应用于生物医学研究、临床诊断等领域。
3. 在实验过程中，应注意以下几点：（1）抗体与抗原的比例要适中，过多或过少都会影响实验结果；（2）孵育时间不宜过长或过短，以免影响抗体与抗原的结合；（3）洗涤时要充分，以去除未结合的抗体和抗原；（4）封片剂的选择要合适，以保证荧光信号的稳定。
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1.目的
规范单克隆抗体标记荧光PE (快速标记法）标准操作程序
2.适用范围
适用于本公司抗体标记荧光PE (快速标记法）操作
3.术语和定义
藻红蛋白，简称“PE”。
相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm。
4.职责和权限
实验员负责实施本规范，主管负责人监督执行。
5.实验试剂.
5.1溶液配制
5.2其他试剂
6.操作流程
6.1抗体活化
将抗体用0.01mol/L PBS稀释为1mg/mL，加入mL 活化液(体积比为抗体溶液：反应活化液=10:1），旋涡振荡器混匀后，室温避光反应10min。
6.2与PE反应形成共轭物
将抗体混合液（步骤6.1）加入mg PE荧光素中（加入量：抗体与荧光素质量比为1:1），在室温条件下避光反应3小时，反应开始时间：至结束时间：；（或2-8度条件下避光过夜）。
6.3荧光淬灭
向共轭物（步骤6.2）中加入mL 淬灭剂（淬灭剂添加量按抗体体积：淬灭剂体积=10:1添加）。
混匀后，室温孵育30分钟，去除游离的荧光素的荧光效应。
淬灭开始时间：至结束时间：。
6.4层析
将共轭物（步骤6.3）层析柱分离，进一步去除游离的荧光素或抗体。
6.5保存
收集得到的标记抗体（步骤6.4），上机测试后根据效价，用Storage Buffer 按比例稀释后，4℃避光保存，有效期一年。