荧光微球标记抗体制备的详细步骤及问题分析
应用荧光微球技术进行免疫检测研究
应用荧光微球技术进行免疫检测研究荧光微球技术（Fluorescent microsphere）是一种新兴的免疫检测技术，通过将荧光染料标记于微米级的聚合物微球表面，实现对多个分子的检测和分析。
该技术具有高灵敏度、高选择性、多重检测和高通量等特点，被广泛应用于生物医学、环境监测和食品安全等领域。
荧光微球技术的原理是在制备微球的过程中加入荧光染料，并使其与聚合物结合。
当荧光微球与目标分子发生特异性反应时，就可以通过荧光信号的变化来检测和定量目标分子的存在。
首先，制备荧光微球。
这一步骤涉及合成聚合物和聚合物化学、微观粒子物理和胶体化学等学科的知识。
荧光染料可以通过共聚合、后修饰等方法与聚合物结合，从而实现微球的荧光标记。
其次，对荧光微球进行功能化修饰。
利用化学交联、共价结合或物理吸附等方法，将具有特异性反应的生物分子（如抗体、DNA探针等）固定在荧光微球表面。
这样做可以使荧光微球对目标分子具有高度的特异性。
然后，进行靶标分析。
将样品中的目标分子与具有特异性的荧光微球共同孵育，目标分子与荧光微球之间发生特异性反应。
通过检测荧光信号的强度或变化来定量目标分子的浓度。
最后，荧光信号的检测和分析。
荧光信号可以通过流式细胞术、荧光显微镜等设备进行定量检测和分析。
这些荧光信号可以通过计算机软件进行处理和解析，得到目标分子的浓度、分布和相关信息。
荧光微球技术可以同时检测多个目标分子，具有高通量的优势。
此外，荧光微球具有高度的稳定性和耐久性，可以重复使用。
因此，它被广泛应用于分子诊断、生物传感器和药物筛选等方面。
总之，荧光微球技术是一种先进的免疫检测技术，具有高灵敏度、高选择性、多重检测和高通量等特点。
通过合理设计和功能化修饰荧光微球，可以实现对多个目标分子的定量检测和分析，为生物医学研究和临床应用提供了新的手段和途径。
荧光微球标记抗体培训
02
活化
活化过程
向离心管中加入一定量的清洗缓冲液，超 声分散，加EDC溶液混匀（超声混匀）后 反应，再加入NHS溶液混匀（超声混匀） 后反应，离心，弃上清液。最后用清洗缓 冲液洗涤微球三次，离心取沉淀进行标记。
活化目的
活化目的：使得荧光微球羧基暴露 出来与抗体氨基结合。
活化原理
活化原理：加入EDC溶液通过与 羧基反应形成O-酰基异硫脲中间 体，该中间体在水溶液中很不稳 定，并易于水解。O-酰基异硫脲 中间体在NHS存在的情况下，可 以转变成氨基反应活性的NHS-活 性酯，这种NHS-活性酯中间体非 常稳定。
荧光微球标记抗体培训
部门：研发部
培训人：×××
步骤
CONTENT
01 清洗 02 活化 03 标记 04 封闭
05 保存
01
清洗
清洗过程
取一定量的荧光微球溶液加入离心管， 离心管中分别加入一定量的清洗缓冲 液，混匀后，离心，弃上清液。再分 别加入清洗缓冲液，超声清洗两次， 离心，弃上清液。
Process
问题
为什么过一段时间才凝集呢？
原因
是因为微球偶联上抗体后，相互之 间由于携带同种电荷的关系，比较 稳定（以胶体的形式存在），只有 当偶尔相互碰撞遇上彼此的反应基
Hale Waihona Puke 团才会结合。解决4.在加入抗体前，向微球中加入少量 的表面活性剂使部分微球被表面活性 剂所覆盖有助于其在蛋白质中抵御电 解质的冲击，需注意的是表活使用量 不可过多，否则会导致微球完全被其 所包被从而降低与抗体的偶联效率。
03
标记
1
标记过程
取沉淀微球，离心管中加一定量 的清洗缓冲液，超声分散，离心 管中加入抗体，混匀，室温反应
荧光微球标记原理
荧光微球标记原理荧光微球标记原理分为三个部分来讲解：荧光微球的制备、荧光微球的特性及应用、荧光微球标记的原理。
一、荧光微球的制备1.1荧光微球的材料荧光微球的制备材料主要包括聚合物、玻璃和金属等材料。
其中，聚合物材料是最常见的，如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚丙烯酸甲酯（PS）、聚乙烯（PE）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯（PP）等。
这些聚合物具有良好的光学性能和化学性能，能够很好地发挥荧光微球的特性。
1.2荧光微球的制备方法荧光微球的制备方法一般包括溶液共聚法、悬浮聚合法、微乳液聚合法、界面反应法、水相乳液聚合法等。
其中，微乳液聚合法是目前应用最广泛的一种方法。
其制备步骤主要包括：乳化剂的选择、乳化剂的添加、搅拌、聚合反应、清洗和干燥等。
1.3荧光微球的表面修饰荧光微球的表面修饰是为了增加其生物相容性、增强其稳定性、改善其荧光性能等目的。
目前常用的表面修饰方法包括物理吸附、共价键结合、表面覆盖等。
二、荧光微球的特性及应用2.1荧光微球的特性荧光微球具有以下特性：①粒径均一，分布范围小；②表面光滑，具有良好的生物相容性；③具有较强的荧光发射能力；④具有较强的化学稳定性和耐热性；⑤具有可控性强，可以根据需要调节其粒径、荧光性能等。
2.2荧光微球的应用荧光微球在生物医学、生物分析、药物传递、检测技术等领域有着广泛的应用。
具体包括：①生物分析领域中的免疫分析、分子诊断等；②生物医学领域中的细胞标记、药物传递等；③检测技术领域中的环境监测、食品安全等。
三、荧光微球标记的原理3.1荧光微球标记的基本原理荧光微球标记是利用荧光微球的良好特性，通过将其与生物分子结合，从而实现对生物分子的检测和分析。
其基本原理包括：①荧光微球的制备；②生物分子选择和结合；③检测和分析等。
3.2荧光微球标记的应用原理荧光微球标记在生物医学、生物分析等领域的应用原理主要包括：①细胞标记：通过将荧光微球与细胞结合，可以实现对细胞的追踪和观察；②分子检测：通过将荧光微球与特定的生物分子结合，可以实现对生物分子的检测和分析；③药物传递：通过将荧光微球作为载体，将药物输送到特定的细胞或组织中，实现药物的靶向输送。
荧光微球标记原理
荧光微球标记原理荧光微球是一种具有荧光性质的微小颗粒，广泛应用于生物医学、环境科学、材料科学等领域。
荧光微球标记技术是利用荧光微球作为标记物，通过其发射的荧光信号来检测和分析生物样品中的分子或细胞。
荧光微球标记原理涉及到荧光的产生机制、微球的制备和标记过程等多个方面，下面将对荧光微球标记原理进行详细介绍。
一、荧光微球的产生机制荧光微球是由具有荧光性质的材料制成的微小颗粒，其荧光产生机制主要与材料的结构和成分有关。
常用的荧光材料包括有机染料、量子点、荧光蛋白等。
这些材料在受到激发光照射后会产生荧光信号，而荧光微球则是将这些荧光材料包裹在微小颗粒中，使其具有荧光性质。
1.有机染料有机染料是一类常见的荧光材料，其分子结构中包含具有共轭结构的芳香环和一定的取代基。
这些结构可以吸收特定波长的光子，激发其内部电子至激发态，然后在辐射过程中释放出荧光信号。
有机染料可以通过合成的方法将其合成为荧光微球的成分之一，从而使微球具有荧光性质。
2.量子点量子点是一种具有特殊结构的半导体纳米颗粒，其具有较窄的光谱特性和较高的荧光量子产率。
量子点的荧光产生机制主要与其尺寸和组成有关，当受到激发光照射后，量子点中的电子-空穴对会重新组合并释放出荧光信号。
量子点可通过化学合成的方法将其包裹在微球中，实现荧光微球的制备。
3.荧光蛋白荧光蛋白是一类具有天然荧光性质的蛋白质，其结构中含有紧密堆积的芳香氨基酸残基，这些残基可以在受到激发光照射后产生荧光信号。
通过基因工程技术可以将荧光蛋白的编码基因导入到细胞或生物体中，从而实现对其进行标记。
此外，荧光蛋白也可以通过特定的方法合成为荧光微球的成分之一。
二、荧光微球的制备荧光微球是由具有荧光性质的材料制成的微小颗粒，其制备包括了材料的选择、颗粒的制备和表面的修饰等步骤。
1.材料的选择制备荧光微球的第一步是选择合适的荧光材料，常用的材料包括有机染料、量子点和荧光蛋白等。
这些材料可以根据实际需要进行选择，以满足标记对象的特定要求。
时间分辨免疫荧光微球
时间分辨免疫荧光微球1. 引言1.1 背景介绍时间分辨免疫荧光微球是一种新型的生物标记技术，可以对免疫学实验数据进行高效、准确的检测分析。
随着生物技术的发展和应用，对于细胞分析和药物筛选等领域的需求日益增加，传统的免疫荧光检测方法已经不能满足科研和临床的需求。
研究人员开始探索新的技术手段来提高实验的灵敏度和准确度。
时间分辨免疫荧光微球具有高灵敏度、高通量和高分辨率的特点，可以同时检测多种生物标记物，实现快速、准确地定量分析。
其原理基于微球上包裹有特定的免疫荧光标记物，当这些微球与待测样品中的靶分子结合时，通过流式细胞仪等仪器可以实时监测免疫反应的强度和时间，从而获得更精确的实验数据。
通过时间分辨免疫荧光微球技术，研究人员可以更加深入地了解细胞内的免疫反应过程，快速筛选药物的活性和副作用，为疾病诊断和治疗提供重要的参考依据。
随着该技术在生命科学领域的不断应用和发展，相信将会有更多的创新和突破出现，为人类健康和生命的发展带来积极的影响。
1.2 研究目的研究目的是通过研究时间分辨免疫荧光微球，深入探究其在生物医学领域中的应用潜力。
通过了解其原理和实验方法，我们的目的是揭示其在疾病诊断、药物递送和细胞标记等方面的优势和局限性，为其未来的应用前景做出预测。
通过这项研究，我们希望能够为生物医学领域的研究和临床实践提供新的技术手段和思路，为推动医疗健康行业的发展做出贡献。
2. 正文2.1 原理介绍时间分辨免疫荧光微球是一种新型的生物分析技术，利用微球作为载体，结合免疫荧光标记技术，实现对不同生物标记物的高灵敏、高特异性检测。
其原理基于时间分辨光谱技术，通过采集微球悬液中的荧光信号，在不同时间点进行检测和分析，从而实现对样品中不同荧光标记物的准确识别和定量测定。
在时间分辨光谱技术中，光谱仪器以一定的时间间隔对样品中的荧光信号进行连续检测，通过对这些时间点上的信号强度和波长进行分析，可以区分出不同的荧光标记物并消除背景信号的干扰。
荧光微球标记原理
荧光微球标记原理一、荧光微球的概念及应用领域荧光微球是一种具有微米级尺寸的颗粒，其内部含有荧光物质，可以发出特定的荧光信号，常用于生物分析和医学诊断等领域。
由于其具有稳定的荧光性能和可调控的粒径大小，荧光微球在生物标记、细胞分选、免疫检测、药物传递等方面具有重要的应用价值。
二、荧光微球的制备方法荧光微球通常采用聚合物或玻璃材料为基材，通过化学合成或物理方法制备得到。
常见的制备方法包括溶胶-凝胶法、浸渗-沉淀法、自组装法、微流控法等。
其中，溶胶-凝胶法是一种较为常见的制备方法，通过将荧光物质溶解于凝胶前体中，然后进行凝胶化反应，最终得到具有荧光性能的微球颗粒。
三、荧光微球的荧光标记原理荧光微球荧光标记原理主要包括荧光物质的选择和激发-发射过程。
荧光物质的选择对荧光微球的荧光性能具有重要影响，常用的荧光物质包括荧光素、罗丹明等。
在激发-发射过程中，荧光微球受到激发光源的激发后，荧光物质会发出特定波长的荧光信号，通过检测荧光信号的强度和波长来实现对微球颗粒的标记和检测。
四、荧光微球在生物标记中的应用荧光微球作为一种具有稳定荧光性能的颗粒材料，广泛应用于生物标记和细胞追踪等领域。
通过将荧光微球与生物分子（如抗体、DNA、RNA等）进行共价结合，可以实现对生物分子的荧光标记和追踪。
这种荧光标记方法不仅可以实现对生物分子的定量检测，还可以实现对细胞的追踪和成像，为细胞生物学研究和药物筛选提供有力支持。
五、荧光微球在免疫检测中的应用荧光微球在免疫检测中的应用也非常广泛，主要应用于免疫分析和诊断领域。
通过将荧光微球与特定抗原或抗体结合，可以实现对特定免疫反应的检测和定量分析。
这种荧光微球基于多参数的免疫检测方法可以同时检测多个生物标志物，提高检测的灵敏度和特异性，为诊断各种疾病提供了新的技术手段。
六、荧光微球在药物传递中的应用荧光微球还常常用于药物传递和靶向释放系统中。
通过将荧光微球与药物载体结合，可以实现对药物的定位输送和靶向释放，改善药物的生物利用度和降低毒副作用。
荧光抗体标记_实验报告
一、实验目的1. 掌握荧光抗体标记技术的基本原理和操作步骤。
2. 学会使用荧光显微镜观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。
3. 了解荧光抗体标记技术在生物医学研究中的应用。
二、实验原理荧光抗体标记技术是将荧光素与特异性抗体结合，形成荧光标记抗体。
这种标记抗体仍保持抗体原有的活性，当与相应的抗原发生特异性结合时，荧光标记抗体在荧光显微镜下呈现出明亮的荧光，从而实现对抗原的检测和定位。
三、实验材料1. 实验试剂：FITC标记的抗体、抗原、抗体稀释液、磷酸盐缓冲液（PBS）、甘油、甲醇等。
2. 实验仪器：荧光显微镜、离心机、移液器、吸管、试管、载玻片等。
四、实验步骤1. 标准化抗体将FITC标记的抗体用抗体稀释液稀释至适当浓度。
2. 制备抗原将待检测的抗原用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至适当浓度。
3. 制备细胞悬液将待检测的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，离心弃去上清液，加入适量的磷酸盐缓冲液重悬细胞。
4. 混合抗原与抗体将抗原与抗体按一定比例混合，在室温下孵育一段时间。
5. 洗涤将混合后的溶液在室温下用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次洗涤后离心弃去上清液。
6. 封片将洗涤后的细胞沉淀用甘油封片，封片剂与细胞沉淀的比例为1:1。
7. 荧光显微镜观察将封片置于荧光显微镜下观察，调整显微镜参数，观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。
五、实验结果通过荧光显微镜观察，发现荧光标记的抗体与抗原发生了特异性结合，形成明亮的荧光复合物。
阳性细胞在荧光显微镜下呈现出明显的荧光信号，而阴性细胞则无荧光信号。
六、实验讨论1. 实验过程中，抗体与抗原的孵育时间、洗涤次数和封片剂的选择对实验结果有较大影响。
本实验中，抗体与抗原的孵育时间为30分钟，洗涤次数为3次，封片剂为甘油。
2. 荧光抗体标记技术具有特异性高、灵敏度高、操作简便等优点，广泛应用于生物医学研究、临床诊断等领域。
3. 在实验过程中，应注意以下几点：（1）抗体与抗原的比例要适中，过多或过少都会影响实验结果；（2）孵育时间不宜过长或过短，以免影响抗体与抗原的结合；（3）洗涤时要充分，以去除未结合的抗体和抗原；（4）封片剂的选择要合适，以保证荧光信号的稳定。
荧光微球制备
荧光微球制备荧光微球是一种具有荧光性质的微米级球形颗粒，广泛应用于荧光探针、生物成像、药物传递等领域。
本文将介绍荧光微球的制备方法及其应用。
一、制备方法荧光微球的制备方法主要有两种：一种是通过聚合物化学反应合成；另一种是通过溶剂乳化法制备。
1.聚合物化学反应合成聚合物化学反应合成是制备荧光微球的常用方法之一。
其原理是通过单体聚合反应合成荧光单体，再将荧光单体与其他单体进行共聚合反应，从而制备荧光微球。
具体步骤如下：a. 合成荧光单体荧光单体的合成需要选择适当的芳香胺或芳香酮作为起始物质，通过酰基化、缩合等反应合成荧光单体。
b. 合成荧光微球在聚合反应中，荧光单体与其他单体进行共聚合反应，得到荧光微球。
2.溶剂乳化法制备溶剂乳化法制备荧光微球的步骤较为简单，主要包括以下几个步骤：a. 制备乳化液将表面活性剂、油相和水相混合，在机械搅拌下制备乳化液。
b. 乳化反应将所需的单体和交联剂加入乳化液中，进行聚合反应。
c. 分离将反应混合物经过离心分离，得到荧光微球。
二、应用荧光微球由于其具有良好的荧光性质，可广泛应用于荧光探针、生物成像、药物传递等领域。
1.荧光探针荧光微球作为一种荧光探针，可用于生物分子检测、细胞成像等领域。
由于荧光微球具有良好的荧光性质，可用于检测分子浓度、酸碱度、温度等参数。
2.生物成像荧光微球可用于生物成像，如体内荧光成像、荧光显微镜成像等。
通过将荧光微球注入生物体内，可实现对生物体内部的成像，具有重要的生物医学应用价值。
3.药物传递荧光微球可用于药物传递，如靶向药物传递、药物缓释等。
通过将药物包裹在荧光微球内部，可实现对药物的靶向传递和缓释，提高药物的有效性和安全性。
荧光微球作为一种具有良好荧光性质的微米级颗粒，其制备方法简单，应用广泛。
在生物医学领域中，荧光微球具有重要的应用价值，有望成为一种重要的生物成像和药物传递材料。
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荧光微球标记抗体方法及问题分析很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。
本人总结了部分胶乳微球标记技术相关主题帖，并加以分类，以便朋友们查阅，希望朋友们继续完善或分享经验。
1. 胶乳大小选择【求助】免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径- 丁香园论坛【求助】乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体- 丁香园论坛2. 胶乳标记方法【交流】蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上- 丁香园论坛（求助）胶乳标记（求助）胶乳标记- 丁香园论坛【求助】抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值- 丁香园论坛3. 胶乳标记过程问题【求助】胶乳偶联出现絮凝胶乳增强免疫比浊试剂稳定性问题- 丁香园论坛【求助】胶乳增强免疫比浊中抗体交联的问题胶乳微球物理吸附反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。
磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2，因此在酸性pH保持稳定。
醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。
羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。
带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。
这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。
疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。
醛基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。
虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。
一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。
反应步骤：1. 用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml；2. 用反应缓冲液系数胶乳微球到1%；3. 将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。
室温搅拌孵育2hr；4. 离心或超滤，除去未结合蛋白；5. 将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。
注意事项：1. 最优蛋白标记量影响因素1）有效比表面积：粒径减小时，比表面积/mg微球值得增加；2）胶体稳定性：蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用；3）免疫反应：最近标记量由免疫反应需要决定。
2. 胶乳微球中加入蛋白后，快速搅拌混合，利于反应均衡。
反应体积是1ml时，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打数次。
如果反应体积较大时，用烧杯，边搅拌边加入蛋白，3. 储存缓冲液和反应缓冲液不同时，抗体有脱落的可能；4. 表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落，所以应避免加入。
微球共价结合抗体方法一、一步法1. 准备50mM pH 6.0的reaction buffer，醋酸或MES buffer更合适2. 用reaction buffer溶解抗体，使其浓度为1mg/mL。
3. 用reaction buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v4. 边搅拌边将一倍体积的抗体溶液加入到10倍体积的微球悬液中，室温下持续搅拌20分钟5. 准备浓度为10mg/ml（52umol/mL）的EDC溶液，用前准备，现配现用。
6. 将计算需求量的EDC溶液加入到上述微球悬液中。
(Note 6).7. 室温下，立即调节pH (Note 7).8. 移除未结合的蛋白，并将包被微球用storage buffer重悬。
(Note 3 and 4)B. 两步法为了避免EDC将相邻微球之间的蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流，两步法偶联抗体更合适。
两步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。
两步法中，蛋白也可以使用更高pH的buffer来溶解，从蛋白的稳定性方面和加速蛋白和活化微球之间的交联速度方便考虑，是非常有利的。
B1 简单一步法：1. 准备50mM pH 6.0的活化buffer，醋酸或MES buffer更合适；用活化buffer 悬浮微球，使其浓度为1% w/v2. 每ml微球悬液加入20mg的EDC，室温孵育20分钟，然后再次加入20mg/mL的EDC，继续室温孵育20分钟。
(Note 7).3. 离心或超滤，用等体积的包被缓冲液清洗两次微球，最后悬浮在包被缓冲液中。
(Note 3).4. 用包被缓冲液溶解抗体到1mg/mL，包被缓冲液pH7~9，浓度为50mM~100mM。
(Note 1)5. 将抗体快速加入的搅拌中的微球悬液中，持续搅拌，室温孵育2~5小时。
(Note 2).6. 每ml反应溶液中加入2.5ul的乙醇胺，持续搅拌并室温孵育10分钟。
(Note 9).7. 离心或超滤，用储存缓冲液悬浮，重复两次，移除未结合的抗体和乙醇胺。
(Note 3 and 4)B2. NHS中间活化酯两步法在此方法中，在EDAC存在下，NHS通过与微球上的羧基反应形成中间活化酯。
活化酯比EDC更稳定，不易水解。
1. 每ml反应混合物加入以下成分：加入DIW，定容最终体积为1ml；0.1ml 10X的MES buffer，ph6.0~6.5（10X的buffer通常用0.5M）；0.1ml 10%的微球(终浓度为1%)；0.23ml NHS水溶液（50mg/mL）; 11.5mg一定体积的19.2mg/ml(100mM)的EDAC水溶液；2. 室温下搅拌反应15~30min；（Note7）3. 清洗：MES buffer或DIW清洗两次；（Note3）；4. 用DIW冲悬浮微球到浓度为1%；5. 同时，用包被buffer溶解稀释抗体。
buffer一般为ph7~9，50mM~100mM。
最终的蛋白浓度1mg/mL;6. 清洗完微球后，立即加入一定体积的抗体溶液。
（Note 2）。
（注意：此处给出的例子，微球浓度和蛋白浓度和buffer分别为0.5%（w/v），0.5mg/mL，25~50mM）;7. 室温下搅拌孵育2hr；8. 每ml反应液中加入2.5ml 乙醇胺，室温搅拌孵育10~30min；9. 清洗：storage buffer清洗两次。
（Note 3/4）NOTES:1. reaction buffer的组成根据蛋白种类的不同而改变，常用buffer有醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液。
蛋白在等电点附近更易于吸附到微球上，因为在等电点附近，蛋白表面会有更多的疏水位点暴露出来。
在这种情况下，抗体也更紧密，因此需要更多的抗体用于标记到微球上。
然而，最终reaction buffer的选择，需要考虑最终抗体微球复合物的生物活性，因此，几个不同浓度的抗体和不同pH的反应buffer应该进行优化选择。
起始实验，反应buffer的离子强度应该在25~50mM。
2. 蛋白溶液应该在快速的搅拌下，快速加入到微球悬液中。
小体积的话，可以进行斡旋混合。
当大体积时，应该在烧瓶或烧杯里搅拌剧烈些，蛋白溶液快速加入到漩涡中间。
3. 移除未结合的化合物或蛋白，如果颗粒直径大于0.2um，可以通过离心的方法，微球可以重新悬浮，然后搅拌，接着温和的超声分散。
离心力不宜过大，这样会导致微球不易分散。
也可以用超滤或透析来纯化。
当用超滤时，滤膜孔径应该足够大，使得游离的蛋白能自由的通过滤膜。
用于清洗微球的buffer应该和storage buffer一样。
用于清洗的buffer的任何缓冲液成分及pH的改变，都会引起蛋白的脱落。
4. 微球包被抗体后，加入表面活性剂或者去污活性成分，可能会导致抗体脱落。
如果是共价结合到微球上，共价结合的抗体就不会有脱落现象发生。
封闭蛋白，像BSA，casein 或gelatin可以用来封阻任何空余的疏水性位点，防止微球发生非特异性凝集。
但是表面活性剂可以将那些共价结合不牢固的抗体洗脱下来。
5. 此试剂和水反应，因此，溶解后应立刻使用掉。
6. EDC的用量，根据微球表面羧基浓度来计算。
根据计算所需量，每mol的羧基应该再多加2~3mol的EDC。
但是，根据功能性检测结果，还需要进一步的优化。
7. 此步骤，微球的凝集经常能观察到。
因为接下来的步骤中，EDC会将相邻两个微球上的抗体连接起来从而引起微球凝集或者中和微球表面的羧基或者两者情况都发生。
调节pH到6.5或超过6.5，优化共价反应，对微球的分散有帮助。
如果反应结束后微球凝集现象仍然发生，用新鲜的buffer清洗除去多余的EDC和游离的蛋白，一般会使得凝集颗粒再分散。
如果在最终的产品中凝集依然发生，尝试稀释微球，一开始可以稀释到原来的50%浓度。
如果稀释后凝集依然发生，可以尝试在所有reaction buffer中加入Tween20或T ergitol NP9等非离子型表面活性剂。
这些表面活性剂不会干扰颗粒的活性或共价结合，但是需要注意的是，要确保在这种去污剂存在下微球共价结合的抗体的稳定。
9. 加入乙醇胺，可以和加入蛋白反应后多余的羧基位基团反应。
胶乳标记过程中常见问题集1）问题：蛋白无法吸附到微球上。
解决方法：加入更多的蛋白；去除微球中的表面活性剂，释放其占据的蛋白结合位点；引入中间物，将微球与蛋白相连；改变缓冲液。
2）问题：标记时加入了大量的蛋白，但是仍然无活性。
解决方法：改变蛋白加入量，从而改变蛋白与微球结合的空间构象；使用表位稀释物，占据微球上的部分蛋白结合位点，防止蛋白靠的太近。
3）问题：清洗去除未吸附蛋白后，微球聚集。
解决方法：增加蛋白标记量或封闭剂的用量，防止有空余位点；4）问题：标记后开始活性很好，储存一段时间后，活性降低。
解决方法：降低储存温度到2~8度；降低储存液中的封闭剂浓度，防止抗体被替换；确认储存液中无能与抗体竞争的杂质，防止长时间取代抗体。
5）PS微球与蛋白（抗体）交联后，当时没发现有凝集，但隔夜后发现有凝集是偶联效率低的原因。
当体系蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交联后还空出许多反应基团时，由于这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应，结果是把球又拉在一起了，所以有聚集。
可以加一些blocker agents 解决,常见的是BSA，另外，也可提高微球的交联率。
但为什么是过一段时间后才出现凝集呢，这是因为微球偶联上蛋白后，相互之间由于携带同种电荷的关系，比较稳定（所以能以胶体样存在），只有当偶尔相互碰撞，遇上彼此的反应基团时才能结合。
6）抗体偶联至羧基PS球，即时检测效果很好，但置于37度2天后，抗体活性似乎下降很大。
可能共价结合未成功，如果是这样，那么最主要的原因是EDAC质量差或过期了。
EDAC 长期放在空气中会吸潮，水汽会降低EDAC活性。
另一个可能原因是凝集。
观察胶乳是否有凝集产生。
还有，交联蛋白前有没有清洗？我们提供的胶乳缓冲液中含有表面活性剂，可能干扰抗体的结合。