流式细胞学技术抗体的各种荧光标记颜色及波长及所占用通道
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析-精选文档
间。
组织富含内源性的生物素与过氧化物酶， 建议使用相关试剂进行封闭。
发生抗原异位。 蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。
3.显色强度弱
一抗浓度过低或孵育时间过短，建议增加 一抗浓度或延长孵育时间。
4.无染色
组织中无目的抗原的表达。 一抗种属来源与二抗不匹配，建议实验前 确认一抗的种属来源。 显色物质与HRP系统不匹配，建议实验前 确认显色体系。
一抗孵育
荧光二抗孵育 流式细胞仪分析
流式细胞术常见结果分析
直方图：单参数分析
人外周全血细胞双参数散点图
散点图：多参数分析
UL 0.70 UR 24.2
LL 52.80
LR 22.3
常用细胞表型及意义：
（Cluster of Differentiation, CD）
CD3 总T细胞 CD4 T辅助/诱导细胞亚群 CD8 T抑制/细胞毒细胞亚群 CD19 B细胞抗原
3. BCIP/NBT显色法
产品描述：BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷 酸/氮蓝四唑）是一种冷藏稳定的、单一组 分溶液，用于免疫组化、原位杂交、
western blot、northern blot和southern blot， 特异性地与碱性磷酸酶（AP）反应生成紫色
4. BCIP/INT显色法
2. 组织芯片应用领域
组织芯片的应用领域包括与生命科学相关的 基础研究、临床研究、应用研究和新药开发 等。 免疫组化染色（IHC）； 原位杂交（ISH）； 荧光原位杂交（FISH）； 原位末端标记分析（TUNEL）； 原位PCR 以及激光捕获显微分离系统辅 助的cDNA杂交。
3. Abgent 现有组织切片/芯片产品
免疫荧光常见问题分析
流式常用荧光染料概要
如何选择流式细胞仪测定常用的荧光染料
流式细胞仪测定常用的荧光染料有很多种,我们如何来选择流式细胞仪测定的常用荧光染料呢？
首先要考虑，他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也不同,选择荧光染料时，必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长做为重点考虑。
发射光波长，如：氩离子气体激光管,它的发射光波488nm；
氦氖离子气体激光管发射光波长633nm；
488nm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）；
PE（藻红蛋白）
PI（碘化丙啶）
CY5（化青素）
preCP(叶绿素蛋白)
ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。
激发光和发射光波长，如下：
流式细胞仪中常用的荧光染料光学特征以及需要的激光器
流式•细胞仪交流论坛：/forum-181-1.ht ml
荧光染料谱。
BrilliantViolet多色流式介绍
496
515/30
Brilliant Violet BUV661
Bright
348
355
661
670/25
Brilliant VioletBUV737
Bright
348
355
737
740/35
Brilliant Violet BUV805
Dim
348
355
805
820/60
三、BD HorizonTM Brilliant Blue 515 （BB515）
5）BV 染料和 BD FACS Buffer 很好的兼容性保证能用于各种流式实验，无毒，适合做流式分选及活细胞成像
二、BUV家族BD Horizon Brilliant UltraViolet (BUV Family)
1、家族成员BUV395 BUV496 BUV737 BUV805荧光素图谱
2、各BUV荧光素信息详细介绍
3、BV421明星product介绍
BD Horizon BV421 的亮度相当于 PE 或 比 PE 还要亮，比 Pacific Blue 亮 10 倍
更亮，更好的分辨率，弱表达抗原的第一选择，让 Pacific Blue 通道变得wonderful
BV421染色案例数据
4、Brilliant Violettm 染料标记流式抗体优势
710/50
Qdot705, eFluor700NC
Brilliant Violettm786
Bright
407
405
786
780/60
Qdot800
Brilliant Violet tm450
Dim
404
带您认识流式细胞术中的各种图
带您认识流式细胞术中的各种图流式图有很多种，最常用的是流式直方图和流式散点图，还有流式等高线图。
流式直方图只能显示一个通道的信息，流式散点图和流式等高线图可以同时显示2个通道的信息。
流式通道流式通道主要可以分为散射光通道和荧光通道：散射光通道有两个，包括FSC通道和SSC通道，一般所有的流式细胞仪均有这2个散射光通道；不同型号的流式细胞仪其荧光通道的多少差异较大，有的甚至没有光通道。
FSC，即前向角散射，它的值代表细胞的大小。
细胞体积越大，其FSC值就越大。
所以可以利用细胞的FSC值初步比较细胞的大小，利用FSC值对细胞进行分群和分类。
SSC，即侧向角散射，它的值代表细胞的颗粒度（granularity）。
细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC 值就越大。
所以可以利用细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，利用SSC值对细胞进行分群和分类。
一般在硏究细胞样品时，首先关注的就是样品中细胞的FSC-SSC 散点图，x轴代表FSC值，y轴代表SSC值，将细胞都显示于该散点图中，可以初步根据细胞的大小和颗粒度对细胞进行分群和分类。
样品细胞不需要标记任何荧光素偶联抗体，直接上样分析就可以得到样品细胞的FSC值和SSC值，其值代表的是细胞的大小和颗粒度这两个基本的物理特征，所以样品的FSC-SSC散点图又称为样品细胞的“物理图”。
荧光通道表示的不是细胞特有的物理特征，而是其化学特征。
如需要检测样品中是否有细胞表达某一CD分子，则需要标记荧光素偶联的该CD分子的抗体，表达有该CD分子的细胞就会结合荧光素偶联抗的该CD分子的抗体，表达有该CD分子的细胞就会结合荧光素偶联抗体，其中的荧光素被相应的激光激发后产生荧光，该荧光信号通过光路系统被相应的荧光通道接收，就能得到该样品中是否有细胞表达该CD分子，以及有多少比例的细胞表达该CD分子等信息。
荧光通道接收到的信号越强，表示细胞上结合的荧光素越多，那么细胞表面表达的该CD分子就越多，因此可根据荧光信号的强弱判断细胞表达该CD 分子的相对数量。
流式细胞仪测定常用的荧光染料
流式细胞仪测定常用的荧光染料
流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm）。
488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE （藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。
他们的激发光和发射光波长分别是：
激发光波长（ηm）发射光峰值（ηm）
FITC 488 525（绿）
PE 488 575（橙红）
PI 488 630（橙红）
ECD 488 610（红）
CY5 488 675（深红）
PreCP 488 675（深红。
流式细胞术详解
流式细胞术详解一. 流式细胞术概述流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。
它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA 含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。
在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D 公司)。
流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。
BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D•公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。
EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,•多用于科学研究。
二.流式细胞仪主要技术指标1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。
2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。
4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
流式细胞仪试剂介绍
如何读懂荧光标记的单克隆抗体
Mouse anti-Human CD3-FITC Clone:UCHT1 Isotype:IgG1 Mouse Mouse: 抗体来源----小鼠 Anti-Human: 检测对象为人类细胞 CD3-FITC: 检测CD3的抗原, 该抗体为FITC荧光素标记 UCHT1: 抗体的Clone 株 IgG1 Mouse: 为抗体的免疫球蛋白亚型,所以选用的阴
CD3 ECD CD3 PC5
CD3 PC7
Performance
Vendor ‘X’
Vendor ‘Y’
Clear Resolution of Cellular Sub-sets
Performance Matters: Impact Of Photo-degradation
Control, t0
Finished Tandem Dye Three Lot Comparison of PC7
250
Performance
Fluorescence Intensity
200
150
Lot # 3021-101 Lot # 1828-47 Lot # 1828-95
100
50
0 550 600
Emission Wavelength (nm)
性对照应为Mouse IgG1-FITC
如何看懂试剂的说明
临床试剂
RD1=PE
标 记 的 荧 光 素
试 剂 包 装 规 格 大 小
如何看懂试剂的说明
科研试剂
科研试剂，以mg/g表示试剂包装大小，需 要做滴度实验，摸索最佳实验所需试剂量
如何看懂试剂的说明－试剂的货号识别
6开头的试剂为美国库尔 特生产
流式抗体标记步骤
1)细胞膜荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。
②按照上样管标记分别加入对应的荧光抗体（一般抗体为20ul/100ul血，PE-Cy5和ECD标记抗体一般为10ul/100ul），室温避光反应15min。
③加入2ml溶血剂，避光室温溶血10min~15min，目测血样呈透明的淡红色，1500rmp离心5min，去上清。
④加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤两次。
⑤加入1mlPBS或者生理盐水重悬细胞，准备上样。
注意事项：●加入血样和抗体前，须注意编号和血样及抗体的一致性。
●实验室要注意冬天保温，夏天降温，防止室温过低或过高，影响抗原抗体反应。
●溶血时，溶血剂和血样的比例为50:1，当血样体积发生变化时，注意溶血剂体积的变化。
2)细胞膜kappa/lambda荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。
②加入2ml溶血剂，避光室温溶血10min~15min，目测血样呈透明的淡红色，1500rmp离心5min，去上清。
③加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤三次④沉淀物中按上样管标记分别CD45-PE-CY5和kappa/lambda试剂盒和同型对照，避光反应15~30min⑤加入2mlPBS或生理盐水离心留沉淀物，洗涤两次⑥保留沉淀物种加入1mlPBS或者生理盐水，准备上样。
注意事项：●沉淀物中的液体不能留太多，控制保留液体体积，保证抗体效价●溶血判断请参照细胞膜荧光抗体标记标准操作规程3)细胞内荧光抗体标记标准操作规程①取上样管标记病人编号和所标记的所有抗体名称和荧光素，按标号加入100ul血样。
②按照上样管标记分别加入对应的包膜荧光抗体（一般抗体为20ul/100ul血，PE-Cy5和ECD标记抗体一般为10ul/100ul），室温避光反应10min。
③加入破膜剂试剂盒A液100ul剧烈震荡混匀，避光固定10min④加入约4ml（2/3上样管液体），1500rpm离心5min，去上清⑤沉淀物首先剧烈震荡混匀，然后小心加入破膜剂试剂盒B液100ul，不得震荡和剧烈摇晃，避光反应5min⑥加入上样管所标记对应的胞内荧光抗体，避光反应15min⑦加入约4ml（2/3上样管液体），1500rpm离心5min，去上清⑧重复步骤7两次，加入1mlPBS或者生理盐水，准备上样。
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645 649 650 650 696 650 650
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PerCP/Cy5.5 PerCP/Cy5.5
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FL-3 FL-2
Channel 5 Channel 5
® ® ®
377 401 410 458 400 400 495 493
360, 405, 407 360, 405, 407 360, 405, 407 405, 407, 457 405, 407 360, 405, 407 488 488
420 421 455 489 550 551 519 525
Fluorochromes for Flow Cytometry and Microscopy
Excitation Laser Lines (nm) BD BD BD BD FAC- BD FACSVanFACFACFACSCanto™ SCalibur™ tage™SE Scan™ SCanto™ II Beckman Coulter® EPICS® XL™/ XL-MCL™ Beckman CYTOPEIA Dako CyAn™ Coulter® FC Dako MoFlo® Guava EasyCyte iCyt Reflection® inFlux™ ADP 500 Amnis ImageStream®
575 FL-2 566 670 675 690 690 613 774 FL-2 FL-3 FL-3 FL-3 FL-3 FL-2 FL-3 FL-3 FL-2 FL-2 FL-3 FL-3 FL-3 FL-3 PerCP/Cy5.5 PerCP/Cy5.5 PE PE/Cy7 PE/Cy7 PE PE PE/Cy5 PE/Cy5 PerCP/ Cy5.5 PerCP/ Cy5.5 PE PE PE PE PE/Cy5 PE/Cy5 PerCP/Cy5.5 PerCP/Cy5.5 PE PE/Cy7 PE PE PE/Cy5 PE/Cy5 PerCP/ Cy5.5 PerCP/ Cy5.5 PE PE/Cy7 FL-2 FL-2 FL-4 FL-4 FL-4 FL-4 FL-3 FL-2 FL-2 FL-4 FL-4 FL-4 FL-4 FL-3 FL-5 FL-4 FL-4 FL-6 FL-6 FL-6 FL-6 FL-5 PE PE PE/Cy5 PE/Cy5 PE/Cy5 PE/Cy5 PE/Texas Red PE/Cy7 FL-3 FL-5 PM-4 FL-4 FL-2 FL-2 FL-4 PM-1 PM-1 PM-2 PM-2 PM-2 PM-2 PE PE PE-Cy5 PE-Cy5 PE-Cy5.5 PE-Cy5.5 PE-TR PE-Cy7 FL-3 FL-2 FL-2 FL-3 FL-3 FL-3 FL-3 Channel 4 Channel 4 Channel 6 Channel 6 Channel 6 Channel 6 Channel 5
FL-1 FL-1 FL-1 FL-1 FL-2 FL-2 FL-3 FL-3
DAPI DAPI DAPI DAPI Pac. Orange Pac. Orange FITC FITC
FL-6 FL-6 FL-6 FL-6 FL-7 FL-7 FL-1 FL-1 PM-3 PM-3
DAPI/PacBlue DAPI/PacBlue DAPI/PacBlue DAPI/PacBlue Pac. Orange Pac. Orange FITC FITC FL-1 FL-1
305, 540
325, 360, 488
620
FL-3
Trademarks: BD FACScan™ , BD FACSCaliber™, BD FACSVantage™ SE, BD FACSCanto™, BD™ LSRII, BD FACSAria™ are trademarks of Becton, Dickinson and Company. Coulter® EPICS® XL™/XL-MCL™ are registered trademarks of Beckman Coulter, Inc. inFlux™ is a trademark of Cytopeia, Inc. iCyt Reflection® is a registered trademark of iCyt Mission Technology, Inc. CyAn™ ADP and MoFlo™ are trademarks of Dako Denmark A/S. C6™ is a trademark of Accuri. Image Stream® is a registered trademark of Amnis Corporation. Cascade Blue®, Alexa Fluor® , Texas Red® are registered trademarks of Molecular Probes, Inc. Pacific Blue™ is a trademark of Molecular Probes, Inc. * These fluorochromes can be used as single color configurations or multi-colored configurations depending on instruments, available lasers and filters, and appropriate color compensation settings. ** These instruments are provided as general information. User must check instrument capability and choose appropriate setting.
359
325, 360, 405, 407 488
461
DAPI PerCP/ Cy5.5 PerCP/ Cy5.5
DAPI
DAPI PerCP/ Cy5.5 PerCP/
DAPI/PacBlue
Channel 2
DAPI 7-AAD (7aminoactinomycin D) PI (Propidium Iodide)
Channel 2 Channel 2 Channel 2 Channel 2
Cascade Blue® Alexa Fluor® 405 Pacific Blue™ AmCyan Cascade Yellow™ Pacific Orange™
Channel 3 Channel 3
Alexa Fluor® 488 FITC (fluorescein) PE (RPhycoerythrin) Cy3 PE/Cy5 PerCP PE/Cy5.5 PerCP-Cy5.5 PE/Texas Red® PE/Cy7 APC (allophycocyanin) Cy5 Alexa Fluor® 647 APC/Cy5.5 Alexa Fluor® 700 APC/Cy7 APC/Alexa Fluor® 750 Viability Probe
Fluorochrome
Excitation Max (nm)
Emission Max (nm)
BD™
LSR II
BD FACSAria™
Accuri C6™ Flow Cytometer
Fluorochrome
Cascade Blue® Alexa Fluor® 405 Pacific Blue™ AmCyan Cascade Yellow™ Pacific Orange™ Alexa Fluor 488 FITC (fluorescein) PE (RPhycoerythrin) Cy3 PE/Cy5 PerCP PE/Cy5.5 PerCP-Cy5.5 PE/Texas Red® PE/Cy7 APC (allophycocyanin) Cy5 Alexa Fluor 647 APC/Cy5.5 Alexa Fluor 700 APC/Cy7 APC/Alexa Fluor® 750 Viability Probe DAPI 7-AAD (7aminoactinomycin D) PI (Propidium Iodide)