厌氧菌的采集、送检、培养、分离鉴定及注意事项

厌氧菌在有氧的情况下不能生长。

要培养厌氧菌，必须创造一个
环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。

如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。

常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。

1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。

2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。

塑料袋透明而不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。

放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。

先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。

如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育（较为推荐）。

3.厌氧手套箱：是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。

它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。

箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。

欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。

箱内保
持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。

该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。

金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。

4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。

5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物，消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。

我没见过。

6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。

焦性末食子酸与碱反应后耗氧。

该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。

如有梭状芽孢杆菌。

7.疱肉培养基：本身就是一个不需特殊设备的厌氧培养法。

疱肉和肉汤装入大试管，液面封凡士林，造成无氧环境。

厌氧菌标本采集与送检必须注意两点：标本绝对不能被正常菌群所污染;应尽量避免接触空气。

1. 采集：
采集标本须注意：不被正常菌群污染，并尽量避免接触空气。

采集深部组织标本时，需用碘酒消毒皮肤用注射器抽取，穿刺针头应准确插入病变部位深部，抽取数毫升即可，抽出后可排出一滴标本于酒精棉球上。

若病灶处标本量较少，则可先用注射器吸取1ml还原性溶液或还原性肉汤，然后再抽取标本。

在紧急情况下，可用棉拭取材，并用适合的培养基转送。

用于厌氧菌培养的标本不同于一般的细菌培养，多采用特殊的采集方法，如针筒抽取等，应严格无菌操作，严禁接触空气。

2.送检方法与处理
标本送到实验室后，应在20～30min内处理完毕，最迟不超过2 h，以防止标本中兼性厌氧菌过度繁殖而抑制厌氧菌的生长。

如不能及时接种，可将标本置室温保存(一般认为，冷藏对某些厌氧菌有害，而且在低温时氧的溶解度较高)。

1)针筒运送：一般用无菌针筒抽取标本后，排尽空气，针头插入无菌橡皮塞，以隔绝空气，立即送检。

这种方法多用于液体标本的运送，如血液、脓液、胸腹水、关节液等医.
2)无菌小瓶运送：一般采用无菌的青霉素小瓶，瓶内加一定量的培养基和少量氧化还原指示剂，用橡皮盖加铝盖固定密封，排除瓶内空气，充以C02气体。

同时先观察瓶内氧化还原指示剂的颜色，以判断瓶内是否为无氧环境，如合格将用无菌注射器将液体标本注入瓶中即可。

3)棉拭子运送一般不采用棉拭子运送，如果使用该方法，一定使用特制运送培养基，确保无氧环境，确保不被污染，确保快速送检。

4)厌氧罐或厌氧袋运送将厌氧罐或厌氧袋内装入可有效消耗氧
气的物质，确保无氧环境。

该方法一般用于运送较大的组织块或床边接种的培养皿等。

厌氧菌广泛存在于外界环境和人体的口腔、肠道和女性生殖道等部位，常引起内源性感染。

据文献报道，约60 % 的临床感染有厌氧菌参与，且大多数是与需氧菌混合感染，故开展厌氧菌的检验对感染的诊断、治疗都有重要意义。

一、厌氧菌样品的采集
标本避免正常菌群污染和氧接触，采用下列方法：
(1) 脓胸及未破溃的脓肿：皮肤消毒后，以无菌注射器抽取(排尽空针及针头内的气体) ，将针头插入无菌橡皮塞内送检。

(2) 肺分泌物和痰标本：用支气刷采取或环甲膜穿刺术。

(3) 尿液标本：用无菌注射器从耻骨上缘行膀脱穿刺术抽取。

(4) 血液标本：可用两端接有无菌针头的塑料袋或橡皮导管，将一端针头刺入静脉，待血液流出后将另一端针头立即插入培养瓶内(瓶内负压) ，使血液直接流入培养瓶内。

(5) 窦道、深部脓肿等的标本:可用特别采样器采取。

二、涂片与染色
标本涂片、革兰染色、镜检，观察细菌的形态和染色性，并估计标本中大致的含菌量，可用"少量” " + "、" ++ "、" + ++"、" + +++ "表示。

镜检不仅能反映各种厌氧菌的特殊形态，同时也能为鉴定厌氧菌提供参考和依据。

如脆弱拟杆菌菌体细长，两端尖：韦荣球菌是极小的革兰阴性球菌。

厌氧菌芽胞的位置、形态、大小对鉴定很有意义，必要时作芽胞形成试验。

例如，芽胞在菌体极端且大于菌体呈鼓槌状，是破伤风梭菌的特征。

根据厌氧菌的特殊形态，可初步确定有无厌氧菌感染，及时向临床医师发出一级报告，建议采用哪类药物。

三、标本接种
一般标本接种3 个血琼脂平板，分别放置于有氧、无氧和含5 % ~ l0 % CO2 的环境中培养。

如果只要求检出厌氧菌，只需接种l 个厌氧血琼脂平板，也可增加1 个相应的选择厌氧血琼脂平板。

为便于在混合培养中及早发现厌氧菌，一般将标本分3 段划线接种，在第1 和第2 段交界处贴1 张甲硝哗(5 mg/片)纸片，若出现隐约抑菌圈，则提示有厌氧菌生长。

不同厌氧菌的生长速度和菌落形态各异，色素也有不同，荧光产生与否也有助于鉴定，根据上述特征，可初步推测厌氧菌的种类：
1.革兰阴性杆菌
(1)在BBE 琼脂平板上有灰黑色、直径> lmm 的菌落，菌落周围有黑色的晕，可初步鉴定为脆弱拟杆菌。

(2) 在卡那万古溶血琼脂平板上，有棕色或黑色菌落，或用伍德灯照射有砖红色荧光者，为产黑素普雷沃菌。

(3)菌落沉入琼脂内，使培养基表面留有小坑者，可能是解脲拟杆菌和纤细拟杆菌。

(4) 菌落表面有小斑点，或如面包屑，结合涂片所见，可初步鉴定为具核梭杆菌。

2. 革兰阴性球菌菌体很小，排列成双、短链或小堆，菌落小，不透明，可能是小韦荣球菌。

3. 革兰阳性球菌排列成长短不等的链，可能是消化链球菌。

4. 苹兰阳性无芽胞杆菌
(1)菌落呈臼齿形、粗糙，结核脓样分泌物中有硫黄样颗粒，可能是放线菌。

(2) 菌体呈X 、Y 、V 排列，菌落小，灰白，不透明，可能是丙酸杆菌。

5 .革兰阳性芽胞杆菌只要见有芽胞，即可鉴定为梭菌属。

菌落有双环溶血，卵黄平皿上卵磷脂酶试验和Nagler 试验阳性，涂片染色为革兰阳性短粗杆菌，有芽胞，有荚膜，可鉴定为产气荚膜梭菌。

四、耐氧试验
当厌氧平板上有细菌生长时，为了确定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。

从每个琼脂平板上挑取4~5 个性状不同的菌落，每个菌落分别转种于2 块需氧血琼脂平板和1 块厌氧血琼脂平板(每个琼脂
平板可划4~6 区，每区种一个可疑菌落) ，然后将平板分别放置在需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。

凡在厌氧环境生长，而在需氧和二氧化碳环境中不生长的细菌为专性厌氧菌;在需氧和厌氧环境中均能生长者为兼性厌氧菌;在需氧
和二氧化碳环境中生长，而在厌氧环境中不生长者为专性需氧菌;在需氧、厌氧环境中均不生长或生长不佳，而在二氧化碳环境中生长良好的细菌为需二氧化碳菌。

五、鉴定试验
可依据厌氧菌的菌体染色形态、菌落特性以及对某些抗生素的敏感性作出初步鉴定。

最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等检查。

生化试验主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂酶试验、明胶液化试验及胆汁肉汤生长试验和硫化氢试验等。

目前用于厌氧菌快速鉴定有胞外酶试验， 4 h 即可观察结果;自动微生物鉴定系统，如VITEK-ANI 、MicroSc an- ANI 等也可鉴定厌氧细菌。

在进行厌氧菌分离鉴定的过程中，需注意下列事项:
①厌氧菌标本在采集和运输的过程中必须与空气隔绝(厌氧菌
暴露于空气中时间太长可死亡) ，务必在30 min 内完成，同时应避免正常菌群的污染。

②培养基要新鲜配制，若储存太久，有氧气溶解在表面或有过氧化物在培养基中，不利于厌氧菌生长。

③若菌落太小，需用放大镜观察菌落。

④作耐氧试验，要求从每个琼脂平板上挑取4 ~ 5 个性状不同的菌落，分别接种需氧和厌氧血琼脂平板，置于需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。

⑤如作胞外酶鉴定，一定要有足够的菌液浓度。