普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤
PCR包括哪些步骤和方法及步骤的实验过程及原理
PCR包括哪些步骤和方法及步骤的实验过程及原理PCR简介聚合酶链式反应（PCR）是一种常用的分子生物学技术，可以在体外扩增目标DNA 序列。
它通过不断的循环反应，迅速大量复制目标DNA，从而能够快速获取足够的起始模板用于后续的实验。
PCR具有高效、敏感、特异性强等优点，在基因工程、医学诊断和犯罪鉴定等领域得到广泛应用。
PCR步骤和方法PCR主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
这三个步骤通过循环反应，反复进行以达到目标DNA扩增的目的。
1.变性（Denaturation）：在高温条件下（通常为94-98°C），双链DNA被迅速分离成两条单链DNA。
这被认为是PCR反应的起始步骤，使得目标DNA的两个互补链分开，为后续的PCR步骤提供单链DNA模板。
2.退火（Annealing）：降温至50-65°C的退火温度，引入特异性引物（primers），使其与目标DNA序列上的两个互补区域发生配对。
引物是短寡核苷酸序列，用于定位目标序列的起始和终止位置。
3.延伸（Extension）：在60-75°C条件下，DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等）以引物为起点，沿模板链的互补链合成新的DNA链。
延伸速率通常为60-100 bp/分钟。
以上三个步骤完成后，产生的DNA分子会成为下一轮PCR反应的起始模板。
每个PCR循环通常需要几十秒到几分钟的时间。
PCR的方法可以进一步分为常规PCR、荧光定量PCR（qPCR）和逆转录PCR（RT-PCR）等。
PCR实验过程以下是PCR在实验室内的基本步骤：1.提取DNA：从待检测的样品（如血液、组织等）中提取目标DNA。
这一步需要遵循相应的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
2.准备反应体系：将PCR反应所需的各种试剂按比例加入反应管中。
通常，反应体系包括目标DNA、引物、核苷酸、DNA聚合酶、缓冲液和Mg2+等。
3.PCR反应：将反应管置于PCR仪中，按照设定的PCR程序进行反应。
pcr原理,反应体系和基本过程
PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学和遗传学研究的技术，用于扩增DNA 序列。
PCR基于DNA的复制原理，在体外模拟DNA的自然复制过程，通过酶和适当的反应体系，使特定DNA序列在反应中进行指数级扩增。
以下是PCR的基本原理、反应体系和过程：原理：PCR反应基于DNA的双链结构。
通过加热将DNA双链分离为两条单链，然后通过引物（primer）与目标DNA序列的特定区域结合，然后在适当的温度下，DNA聚合酶（DNA polymerase）催化合成新的DNA链，形成两条新的双链DNA。
这个过程包括三个基本步骤：变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Extension）。
反应体系：PCR反应通常包含以下组分：模板DNA：要扩增的DNA样本。
引物（primer）：短的DNA序列，与目标DNA序列的两端相互补，作为起始合成新DNA链的起点。
DNA聚合酶：如Taq聚合酶，用于合成新的DNA链。
dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）：包括A、T、C和G四种碱基的单元，供DNA聚合酶使用。
缓冲液：维持反应体系的pH和离子浓度，提供适宜的环境供DNA聚合酶催化反应。
基本过程：PCR反应通常涉及以下的循环步骤，每个循环依次进行变性、退火和延伸：变性（Denaturation）：将PCR反应管中的混合物加热至94-98摄氏度，使DNA双链解离为两条单链。
退火（Annealing）：将反应温度降低至45-68摄氏度，使引物与目标DNA序列的特定区域结合。
延伸（Extension）：将温度提高至72摄氏度，DNA聚合酶催化新的DNA链的合成。
DNA 聚合酶使用dNTPs作为碱基单元，延伸引物，合成新的DNA链。
这个循环步骤会重复多次（通常为20-40次），每次循环都会使目标DNA序列扩增约一倍，最终产生大量目标序列的DNA。
通过PCR，可以在短时间内从少量的起始DNA模板扩增出大量的目标DNA序列，为分子生物学、基因组学研究以及遗传疾病诊断等提供了强大的工具。
PCR的原理和操作步骤有哪些方法进行分析
PCR的原理和操作步骤有哪些方法进行分析PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种基因分析技术，通过扩增DNA片段以实现基因检测和分析。
它广泛应用于医学、农业、环境科学等领域。
本文将介绍PCR的原理和操作步骤。
原理PCR的原理基于DNA的复制机制，通过不断复制目标DNA片段，使其数量呈指数增长。
这种复制过程需要酶的介入，主要涉及三个步骤：变性、退火和延伸。
1.变性（Denaturation）：将DNA双链分离为两条单链。
这一步需要高温（通常是94-98°C），以破坏氢键使双链解开。
这样，我们可以得到两条单链DNA。
2.退火（Annealing）：将引物（primers）与目标DNA序列互补配对。
引物是短的DNA片段，可以选择性地结合目标序列。
这一步发生在较低的温度下（通常在50-65°C），以保证引物与目标DNA序列结合。
3.延伸（Extension）：通过DNA聚合酶的作用在引物的两侧合成新的DNA链。
DNA聚合酶以引物为起始点，向着DNA链的3’端合成新的DNA链。
这一步需要较高的温度（通常在72°C），以确保DNA聚合酶的最佳活性。
通过这三个步骤的循环重复，可以在短时间内扩增目标DNA片段。
操作步骤PCR的操作步骤主要包括制备反应体系、设置PCR程序和结果分析。
1.制备反应体系：PCR反应体系由DNA样本、引物、酶和缓冲液等组成。
首先，将目标DNA片段、引物和其他所需试剂按照一定比例加入试管中。
然后，将反应体系混匀。
2.设置PCR程序：PCR反应需要一定的温度和时间调控。
通常需要设置反应的温度曲线和时间参数。
这些参数包括变性温度、退火温度、延伸温度和循环次数等。
通过合理设置PCR程序，可以确保反应的特异性和高效性。
3.结果分析：PCR反应完成后，可以通过凝胶电泳等技术来分析PCR产物。
凝胶电泳可以根据PCR产物的大小来判断是否扩增成功。
PCR技术的原理与应用ppt课件
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
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锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
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Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
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2.PCR技术的主要类型及其应用
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锚定PCR原理示意图
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标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤普通PCR1概述聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。
可看作生物体外的特殊DNA复制。
DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。
现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。
它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。
PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。
他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。
而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。
Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。
此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。
随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。
Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
2 PCR原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
pcr技术的原理和步骤
PCR技术的原理和步骤一、引言PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，它在许多领域中具有广泛的应用。
PCR技术的核心原理是通过体外复制DNA，使得我们能够从微量DNA样本中扩增出足够的DNA量进行后续分析。
本文将详细介绍PCR技术的原理和步骤。
二、PCR技术的原理PCR技术的原理主要基于DNA的复制与扩增过程，它包含以下三个重要步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性PCR反应开始时，DNA模板被加热到95°C，使其两个DNA链分离。
这一步骤被称为变性，它破坏了氢键，使DNA双链变为单链。
变性是PCR技术的起始步骤，确保反应中的DNA单链能够被其他反应物所利用。
2. 退火在变性之后，温度降至50-60°C，引物加入PCR反应体系中与单链DNA互补配对。
引物是短的寡聚核苷酸序列，其中一个与DNA模板的一个单链区段互补，另一个与DNA模板的相对应的区段互补。
引物在退火温度下与DNA单链形成氢键，稳定地结合在DNA模板上。
3. 延伸在退火的温度下，酶聚合酶（Taq polymerase）被加入反应中，它能以引物为起始点，在DNA模板上合成互补链。
Taq polymerase是从一种热水生产的细菌中分离得到的，它能耐受高温，因此可以在PCR反应过程中保持活性。
Taq polymerase能够扩增DNA，其DNA合成速度约为每分钟1000个核苷酸。
PCR技术涉及多个步骤，包括DNA提取、反应体系的准备、PCR反应的设置和PCR产物的分析。
1. DNA提取PCR反应需要DNA作为模板。
DNA可以从多种样本中提取，如血液、组织、细胞培养物等。
DNA提取的方法有多种，包括使用商业DNA提取试剂盒或自行制备DNA提取试剂。
2. 反应体系的准备PCR反应体系通常包括DNA模板、引物、聚合酶、缓冲液和二硫苏糖醇（DMSO）等。
引物的浓度通常为0.2-0.5 μM，聚合酶的浓度为1-2.5 U/μL。
PCR及原位PCR 的原理和方法PCR的基本原理
• ___有别于原位PCR， 以mRNA为起始物， 而原位PCR以DNA 为起
始物。 • ___有别于液相反转录PCR， 原位反转录PCR反应过程在组织切 片上进行，标记用DNA酶处理，以破坏组织细胞中的DNA，确 保PCR扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA， 残留在细胞中 DNA就不会被扩增。 • ___原位反转录PCR更适宜检测细胞内低拷贝基因检出。
• 细胞---将细胞孵育在含60ug/ml蛋白酶K的PBS中55 C 2小时，
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然后加热到960C 2分钟以使蛋白酶K失活。 • 组织切片---孵育在含有1 ng/1ml pre-digested promase 50mM Tris HCl pH7.5, EDTA. 370C 20-60 min。
原位基因扩增
•
原位基因扩增可通过特异的引物和热稳定DNA聚合酶增加靶 核酸的拷贝数达检出水平
扩增产物的检测
• 扩增产物的可视化可通过以下两条途径进行：直接和间接
直接法原位PCR Direct in situ PCR
• 应用的引物和三磷酸核苷酸分别标以放射性同位素(如 S等)， 非放射
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性同位素（如生物素和地高辛）进行PCR原位扩增，扩增的产物经放 射自显影，免疫组化和亲和组织化学方法进行检测，不需原位杂交检 测特异性扩增产物的一种检测技术。
PCR在体外进行的三个基本步骤 组成PCR的循环反应 0 • 第一步：变性 Denaturation 94 C 30s将所要扩增的基因片段加热， 使双链DNA解离成单链DNA。
• 第二步：复性 Annealing （退火） 55 C 30s当温度下降时，化学方法
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合成的寡核苷酸引物即与所要扩增基因两侧的DNA相结合。
PCR反应基本原理和反应过程
PCR反应基本原理和反应过程什么是PCR？聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是⼀种分⼦⽣物学技术，⽤于体外扩增特定的DNA⽚段。
PCR技术发展简史image.pngPCR之⽗ Kary MullisPCR反应基本原理和反应过程基本原理：反应过程：变性——将被复制的DNA⽚段在⾼于其Tm的条件下（94~95℃）加热，使DNA双螺旋结构的氢键断裂⼆解螺旋，形成两条单链分⼦作为扩增反应的模板，以便与引物结合。
退⽕——将反应体系的温度降⾄寡核苷酸（引物）的熔点温度以下（40~70℃），以便使引物能与模板DNA序列互补结合，形成杂交链。
延伸——将反应体系的温度升⾄72℃左右，此时反应体系按照模板链的序列以碱基互补配对原则以此把dNTP加⾄引物的3’端，在Taq DNA聚合酶的存在下，杂交链不断延伸，直⾄形成新的DNA双链。
PCR反应体系:反应体系为100µL的PCR反应，其反应混合物为：模板DNA 0.1～2µg前后引物各20pmol；20mmol/L Tris-HCl缓冲液 (pH 8.3)；1.5mmol/L 氯化镁；0.05% Tween 20；100mg/L灭菌的明胶或⽆核酸酶的⽜⾎清蛋⽩；1000µmol/L的四种dNTP；25mmol/L KCl；2U的Taq DNA酶。
PCR由变性-退⽕-延伸三个基本反应步骤构成1、模板DNA的变性：模板DNA经加热⾄93℃左右⼀定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2、模板DNA与引物的退⽕（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降⾄55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。
此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。
该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA⽚段长度。
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普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤普通PCR1概述聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。
可看作生物体外的特殊DNA复制。
DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。
现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。
它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。
PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。
他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。
而现今所发展出来的PCR 则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。
Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。
此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。
随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。
Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
2 PCR原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
3 PCR反应体系与反应条件3.1标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物200μl引物10～100μl模板DNA 0.1～2μgTaq DNA聚合酶 2.5 μlMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水100 μl3.2 PCR反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)。
［PCR步骤］标准的PCR过程分为三步：1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。
现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
4 PCR反应特点4.1特异性强PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。
引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。
聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。
再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
4.2 灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。
能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
4.3简便、快速PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。
扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
4.4 对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
5 PCR常见问题5.1假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
5.2 假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。
需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
5.3 出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：必要时重新设计引物。
减低酶量或调换另一来源的酶。
降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
5.4出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
适当降低Mg2+浓度。
增加模板量，减少循环次数。
原位PCR在科学研究中，每一项新技术的创立都会带来一系列新的研究成果问世，从而推动着各学科的发展。
纵观形态研究领域，50年代电子显微镜引入形态学观察领域，带来了从细胞水平到亚细胞水平的深入研究；60-70年代，免疫组织化学与免疫细胞化学技术的广泛应用，又将观察的水平由亚细胞结构推向了蛋白质分子水平，使细胞内众多的活性物质得以进行细胞或亚细胞水平的定位，对医学生物学的发展无疑产生了深刻的影响。
70年代，分子生物学技术在形态学中的广泛应用，随着原位杂交技术的出现，使组织细胞内特定的DNA或RNA序列能够被定位，将蛋白质水平又提高到基因水平即核酸分子的观察和定位，从而使人类对许多生命现象在基因水平上的认识得以深化；80年代，分子生物学领域中一项具有强大生命力的技术PCR——多聚酶链反应技术问世了，很快地就被引入形态学观察的领域，使细胞内低拷贝或单拷贝的特定DNA或RNA得以进行定位及观察。
这一技术的问世，必将带来更多的研究成果，使形态学的研究又向前迈出一大步。