细胞的冻存和复苏

细胞的冻存和复苏

一、原理

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

二、操作步骤

（一）冻存

1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。

2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。

3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。

5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。

7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。

注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）复苏

1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。

2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。

3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。

4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。

5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。

6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。

三、试剂和器材

器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等

试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）

附：冻存液配制：

培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。

细胞的传代培养

一、原理

细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

二、材料和试剂

1、细胞：贴壁细胞株

2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清）

3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

三、操作步骤

1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。

2、加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。

3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。

观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。

4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。附：消化液配制方法：

称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2 、Mg2 的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。

胰酶溶液中也可加入EDTA，使最终浓度达0.02％。

细胞培养技术

细胞培养的一般过程

一、准备工作

准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器

的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。

二、取材

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。

理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。

由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。

三、培养

将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。

正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。

一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。

培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。

四、冻存及复苏

为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。

复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。

冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

培养细胞的细胞生物学

一、体内、外细胞的差异和分化

1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细

胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。

虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并未失去研究的意义。且不论其有许多性状仍与体内相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cyto－genetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭／开启引起的现象，这并非是绝对缺陷。恰恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。

2、分化；体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。

二、体外培养细胞的分型

（一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能接体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。

2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。

3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。

4、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。

（二）悬浮型；见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。

三、培养细胞的生长和增殖过程

体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。另外，很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存也不是无限的，存在着一个发展过程。所有这一切，使组织细胞在培养中有着一系列与体内不同的生存特点。

（一）培养细胞生命期（Life Span of Culture Cells）

所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。组织和细胞在培养中生命期如何？这要看细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况。人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维待一年左右的生存时间，最后衰老凋亡（Apoptosis）。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；如培养的为其它细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。对此以后将详述。

正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段：

1．原代培养（Primary Culture）期：

也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。

2．传代期：

初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。

3．衰退期：

此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。在早期文献中无限细胞系也称已建立细胞系（Established Cell Line），现已不用。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。

（二）组织培养细胞一代生存期

所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。

所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增〔Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：

1．潜伏期（Latent Phase）：

细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养细胞贴附慢，可长达10～24小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，10～30分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素（Fibronectin），又称LETS（Larger External Transformation Substance），细胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也参

与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面（如CSP），有的则来自培养基中的血清（LETS）。近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。

细胞贴附于支持物后，除先经过前述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。初代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。

2．指数增生期（Logarithmic growth Phase）：

这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.1%～0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%。pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（Piled up）。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念，不应混淆。

3．停滞期（Stagnate Phase）：

细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传1～2两代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。结果反而耽误了时间，这是在实验中应特别注意的。

建立细胞系或细胞株

各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定的和生物性状清楚的细胞群。因此凡符合上述情况的细胞群也可给以相应的名称，即文献中常称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。已鉴定的细胞可用于各种实验研究和生产生物制品。当前世界上已建的各种细胞系（株）已难胜数，我国也建有百种以上，并在不断增长中。

一、体外培养细胞的种类和命名

体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。

（一）初代培养

初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。

（二）细胞系

初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。

由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。

（三）克隆细胞株

从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）

（四）二倍体细胞

细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有8～10代，人胚神经胶质细胞15～30代；如从老龄个体取可传50则细胞生存期更短。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2～5代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。

（五）遗传缺陷细胞

从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。

（六）肿瘤细胞系或株

这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。

对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解，今别举以下几种代表性的细胞名称供参考：

HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）

CHO：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）

宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立

NIH3T3：美国国立卫生研究所（National Institute of Health）建立；每3天传代，每次接种3×105细胞／毫升。

二、建立细胞系（或株）的要求

关于什么样的体外培养细胞群，可被确认为是已被鉴定的细胞（Certified Cells），国际上也尚无统一的规定，一般依具体情况而定。在只用作初代培养细胞，只要供体性别、年龄等均一，取材部位及组织种类等条件稳定，做鉴定的项目无需很多，有几项能说明细胞的相关性状的即可。如能长期保存并可供其它研究室使用，特别是做反复传代的细胞，习惯上有以下一些要求，并在刊物上报道时应加以说明。

（－）组织来源

应说明细胞供体所属物种，来自人体，动物或其它；供体的年龄、性别、取材的器官或组织；如系肿瘤组织，应说明临床病理诊断，组织来源，以及病例号等。

（二）细胞生物学检测

应了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞的一般形态、特异结构、细胞生长曲线和分裂指数、倍增时间、接种率；特异性，如为腺细胞有否特殊产物包括分泌蛋白或激素等；如为肿瘤细胞，应力求证明细胞确系来源于原肿瘤组织而非其它，并仍保持性性，为此需做软琼脂培养、异体动物接种致瘤性和对正常组织浸润力等实验。

（三）培养条件和方法

各种细胞都有自己比较适应的生存环境，因此应指明使用的培养基、血清种类、用量以及细胞生存的适宜pH等。

三、已建立细胞系或株的鉴定、管理和使用

近些年，当一个细胞系或细胞林建成后，我国常通过组织专家开鉴定会的形式予以鉴定，从学术角度考虑，此举实非必要。按国际惯例，只要研究认真负责地把有关资料在杂志或刊物上报道，详细介绍上述各项目即可。

以前因未建立统一的细胞库时，对已建立的细胞系（株）多由作者单位自行保管，有浪费人力、交流使用不便、细胞易污染和丢失等弊病。我国已初建成小规模贮存细胞机构，待获进一步发展，这对我国细胞培养必将有更大促进作用。

国际上美、英和日本等国已建有细胞库；美国已有美国标准细胞库或细胞银行（ATCC）和人遗传突变细胞库（HGMR）、细胞衰老细胞库（CAR）等，其中ATCC不仅是美国也世界最大的细胞库。ATCC下属有一组协作实验室和一个由众多专家组成的咨询委员会。ATCC 也是美国国立癌症研究所（NCI）和美国卫生研究所中（NIH）的资源库，尤与NCI有密切的关系。ATCC也是世界卫生组织WHO的国际培养细胞文献中心。ATCC现液氮冻存有3200个已经过鉴定的细胞系（1992），其中包括来自正常人和各种疾病患者的皮肤成纤维细胞系；和来自不同物种的近75个杂交瘤细胞株。ATCC接纳来自世界各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世界各国的研究者或实验室免费提供研究用细胞（做盈利性研究时收费。）ATCC接纳入库细胞时，必须符合其入库标准，ATCC入库细胞要求检测项目如下：培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等

冻存液：培养基和防冻液名称

细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性

培养液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量

细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性

核型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无

无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等

物种检测：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测

免疫检测：一两种血清学检测

细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名

以上为ATCC入库基本要求，杂交瘤入库标准尚有所不同，详细情况请参阅ATCC的“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”

细胞的原代培养

一、原理

将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。

二、仪器、材料及试剂

仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）

材料：胎鼠或新生鼠

试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒

三、操作步骤

（一）胰酶消化法

1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。

2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。

4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。

8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9、加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。

上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。

（二）组织块直接培养法

自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。

四、注意事项

1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。

2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。

3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。

五、无菌操作的几个注意事项

1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。

2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。

6、吸溶液的吸管等不能混用。

附：Hank’s液配方：

KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4?H2O 0.06g，加H2O至1000ml

注：Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。

细胞周期的测定

一、原理

细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。

单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等，这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。

BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如

果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。

二、仪器、用品与试剂

1、仪器、用品：同常规细胞培养

2、试剂：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

三、操作步骤

1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使最终浓度为10μg/ml。

2、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

4、常规染色体制片（见第三部分：染色体技术）。

5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。

6、弃去2×SSC液，流水冲洗。

7、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。

8、镜检100个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

9、计算：

细胞周期（Tc）=48/{（M1 2M2 3M3 4M4）/100}（小时）

附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十双蒸水10ml 4℃下避光保存。

（2）2×SSC配制: NaCl 1.75克，柠檬酸三钠?2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。

流式细胞仪检测细胞凋亡

细胞凋亡的检测方法众多，流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。因此，具有其它方法无可比拟的优越性。下面我们就简单明了地介绍流式在检测凋亡方面的应用。

下面是一幅凋亡过程图。在凋亡诱导剂的作用下，首先是细胞色素C和apa f－1形成复合体，线粒体的功能发生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰丝氨酸外翻，这时细胞的形态已经发生了改变，可以看到细胞变小，胞核皱缩；最后是细胞内DNA断裂，形成凋亡小体。

（图1）

在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的流式细胞仪的检测方法，可以采用以下检测方法：

1、线粒体功能

2、DNA Cycle

3、Caspases

4、Annexin V Assay

5、DNA Fragmentation Assays

基本上涵盖了细胞凋亡的各个期，对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。

线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。其检测主要采用阳离子型荧光染料。原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。可以在荧光显微镜下，或流式检测。采用488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。整个实验过程操作简单，只需要30min就可以见到结果。

Caspase家族可以检测的分子非常多，也有不少商业的试剂盒可以应用。即使没有相应的试剂盒，只要有相应抗体基本上是可以检测的，具体的方法是参照细胞内蛋白检测的步骤。

在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。Annexin－V是一种35－36 KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。细胞凋亡时，可以和外翻的PS结合，从而可以检测凋亡的细胞。发生死亡的细胞其细胞膜上的PS也外翻，因而也会阳性。因此，常用的凋亡试剂盒除了采用Annexin－V标记之外，还会加一种DNA染料，常用的有PI和7－AAD，由于死亡的细胞膜通透性增高，染料可以进入细胞内和DNA结合，从而可以发荧光，区分出死细胞。

下图给出的是在使用FAS单抗诱导前后的检测结果，横坐标是Annexin-V FITC, 纵坐标是PI，左上、右上、左下、右下四个象限中右上象限代表死亡的细胞，左下象限是存活的细胞，右下象限是凋亡的细胞。

在采用Annixin V方法检测凋亡细胞时，要特别强调一点：该方法适用于悬浮生长的细胞，如：淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁生长的细胞，由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤，会造成较高的假阳性，从而影响检测结果。尽管目前，包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞。我不推荐用该方法检测。因为其重复性较差，且需要操作时非常小心。

（图2）

DNA周期检测原本是用来反应细胞各个期，即细胞增殖状况的。利用细胞内DNA能够和荧光染料，如PI结合的特性。细胞各个时期由于其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同，流式检测的荧光轻度也不一样。G2－M期DNA含量是G0－G1的两倍，而S期介于两者之间。

但是由于发现凋亡的细胞DNA含量较少，因而可以在细胞G0－G1期前面有一个亚二倍体峰，从而认为是凋亡细胞。但是由于死亡的细胞本身其DNA含量也是减少的，因而非常难于区分凋亡和死亡的细胞。在90年代，该方法曾经风靡一时，现在看来，那时的实验结果

需要推敲。尽管，经典的流式检测资料给出的图是认为凋亡的细胞是紧挨着G0－G1期峰的一个峰，死亡的细胞峰离G0－G1期峰较远，但是这种典型的结果似乎很难获得。有其它的替代方法，完全可以不用这种方法。

下图横轴代表PI的荧光强度，纵轴代表细胞数目，各个期根据荧光强度可以简单的进行区分。

（图3）

晚期凋亡的细胞由于DNA的断裂，因而可以出现DNA ladder，从而也就有了经典的检测方法TUNEl。流式也能进行Tunel检测，其检测原理与经典Tunel原理基本一致。以BD公司的为例，其利用TdT能将荧光素标记的dUTP标记到断裂的DNA末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。但是由于在细胞内标记，细胞需要进行固定处理，操作类似免疫组织化学法，容易造成假阳性。建议采用原装大厂的试剂盒，并且严格的设立对照。经过预实验方法稳定后再进行大规模实验。标本处理后，均可以用荧光纤维镜进行观察，拍照。流式检测后，可以进行精确的计算凋亡百分比。这一点，经典TUNEl是做不到的。

（图4）