第二章 核酸

第二章核酸概论第一节概论一、核酸的发现1868年，瑞士的内科医生Friedrich Miescher从脓细胞核中提取到一种富含磷元素的酸性化合物，将其称为核质(nuclein)；后来他又从鲭鱼精子中分离出类似的物质，此酸性物质即是现在所知的核酸(nucleic acid)。

1944年Oswald Avery,Colin Macleod和Maclyn McCarty发现，一种有夹膜、具致病性的肺炎球菌中提取的核酸DNA(deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸)，可使另一种无夹膜，不具致病性的肺炎球菌的遗传性状发生改变，转变为有夹膜，具致病性的肺炎球菌，且转化率与DNA纯度呈正相关，若将DNA 预先用DNA酶降解，转化就不发生。

该项实验彻底纠正了蛋白质携带遗传信息这一错误认识，确立了核酸是遗传物质的重要地位。

1953年Watson 和Crick创立的DNA双螺旋结构模型，不仅阐明了DNA分子的结构特征，而且提出了DNA作为执行生物遗传功能的分子，从亲代到子代的DNA复制(replication)过程中，遗传信息的传递方式及高度保真性，为遗传学进入分子水平奠定了基础，成为现代分子生物学发展史上最为辉煌的里程碑。

后来的研究又发现了另一类核酸RNA(ribonucleic acid,核糖核酸)，RNA在遗传信息的传递中起着重要的作用。

从此，核酸研究的进展日新月异，如今，由核酸研究而产生的分子生物学及其基因工程技术已渗透到医药学、农业、化工等领域的各个学科，人类对生命本质的认识进入了一个崭新的天地。

二、核酸的种类、分布核酸是生物体内的高分子化合物，包括DNA和RNA两大类。

RNA包括三种：mRNA 、tRNA、rRNA ，二者组成不同。

细胞核、细胞质（线粒体、叶绿体等）。

三、核酸的化学组成组成核酸的元素有C、H、O、N、P等，与蛋白质比较，其组成上有两个特点：一是核酸一般不含元素S，二是核酸中P元素的含量较多并且恒定，约占9～10%。

因此，核酸定量测定的经典方法，是以测定P含量来代表核酸量。

核酸经水解可得到核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本单位。

核酸就是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸。

核苷酸可被水解产生核苷和磷酸，核苷还可再进一步水解，产生戊糖和含氮碱基。

(dAMP、AMP)(dA、A)1.碱基分嘧啶碱基(pyrimidine) 、嘌呤碱基(purine)核苷酸中的碱基均为含氮杂环化合物，它们分别属于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。

核苷酸中的嘌呤碱(purine)主要是鸟嘌呤(guanine,G)和腺嘌呤(adenine,A)；嘧啶碱(pyrimidine)主要是胞嘧啶(cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U)和胸腺嘧啶(thymine,T)。

DNA 和RNA 都含有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)；胸腺嘧啶(T)一般而言只存在于DNA 中，不存在于RNA 中；而尿嘧啶(U)只存在于RNA 中，不存在于DNA 中。

它们的化学结构见下图：DNA 的碱基组成：C 、G 、A 、T ； RNA 的碱基组成：C 、G 、A 、U 。

核酸中五种碱基中的酮基和氨基，均位于碱基环中氮原子的邻位，可以发生酮式－醇式或氨基、亚氨基间的结构互变。

这种互变异构在基因突变和生物进化中具有重要作用。

有些核酸中还含有修饰碱基(modified bases ，或稀有碱基，minor bases)，这些碱基大多是在上述嘌呤或嘧啶碱的不同部位甲基化(methylation)或进行其它的化学修饰而形成的衍生物。

一般这些碱基在核酸中的含量稀少，在各种类型核酸中的分布也不均一。

DNA 中的修饰碱基主要见于噬菌体DNA ，如5-甲基胞嘧啶(m 5C)，5-羟甲基胞嘧啶hm 5C ；RNA 中以tRNA 含修饰碱基最多，如1-甲基腺嘌呤(m 1A)，2,2一二甲基鸟嘌呤(m 22G)和5,6-二氢尿嘧啶(DHU)等。

2.戊糖核酸中的戊糖有核糖(ribose)和脱氧核糖(deoxyribose)两种，分别存在于核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸中。

为了与碱基标号相区别，通常将戊糖的C 原子编号都加上“′”，如C1′表示糖的第一位碳原子。

3.核苷（1）连接方式 戊糖与嘧啶或嘌呤碱以糖苷键连接就称为核苷，通常是戊糖的C1′与嘧啶碱的N 1或嘌呤碱的N 9通过β-糖苷键相连接。

(2)常见核苷及其代号：核苷：嘌呤或嘧啶碱与核糖或脱氧核糖以糖苷键连接的复合物。

简称代号简称代号腺苷 A 脱氧腺苷dA鸟苷G 脱氧鸟苷dG胞苷 C 脱氧胞苷dC尿苷U －－－－脱氧胸苷dT核苷的解离会影响到碱基配对，进而影响复制和翻译，甚至突变。

4.核苷酸和稀有核苷酸核苷中戊糖的羟基与磷酸以磷酸酯键连接而成为核苷酸。

生物体内的核苷酸大多数是核糖或脱氧核糖的C5′上羟基被磷酸酯化，形成5′核苷酸；当然也有一些其他的连接方式。

核苷+磷酸→→→→核苷酸核苷酸的连接――3',5'磷酸二酯键稀有核苷：除表：核酸中的常见8种核苷外，还有一些稀有核苷。

（1）稀有核苷可分为3大类：A.由稀有碱基组成的核苷；B.有2’-O-甲基核糖组成的核苷；C.碱基与戊糖的连接方式与众不同的核苷。

如：假尿苷（Ψ）、二氢尿嘧啶核苷(DHU)、N6,N6-二甲基腺苷（m62A）、2’-O-甲基腺苷(Am)等。

（2）稀有核苷的结合方式A.基团甲基化，如：1-甲基腺苷（m1A）、m2A、N6-甲基腺苷（m6A）。

B.S代基团，如：2-硫代胞苷(S2C)、2-硫代尿苷（S2U）、4-硫代尿苷（S4U）。

C.氢化如：二氢尿苷(DHU)、5-甲基-5,6-二氢尿苷(m5DU)。

-CH3-S +H -OH -CH2OH -COCH3-OCH2COOHm S D O om ac c5.细胞内的游离核苷酸、衍生物及其生物学作用核苷一磷酸可以进一步磷酸化，形成核苷二磷酸和核苷三磷酸。

如腺苷一磷酸（AMP）、腺苷二磷酸（ADP）和腺苷三磷酸（ATP）。

ADP、ATP常参与能量转换，此外GTP CTP UTP也有能量传递的作用，GDP、CDP、UDP参与物质的合成。

ATP在腺苷酸环化酶的作用下可以生成3ˊ,5ˊ-环腺苷酸（cAMP）,同样GTP在鸟苷酸环化酶催化下也可生成3ˊ,5ˊ-环鸟苷酸（cGMP）。

cAMP和cGMP是高能化合物，即它们的3ˊ-磷酰键的水解可释放出很大的能量，但这两个化合物在细胞内含量很少，它们的重要作用不是作为能量的供体，而主要是起着第二信使的作用。

核苷酸或其衍生物——辅酶或辅基的组成成分。

四、核苷酸的理化性质核苷酸中的碱基具有多种理化性质，影响核苷酸和核酸的结构，并进而影响功能碱基的构型与紫外吸收Pu和Py是共轭分子，这对核酸的结构、电子分布、光吸收有重要影响。

它们的大部分键具有双键性质，因此碱基环成为平面结构，随pH值不同有不同的异构形式：生理pH值下，碱基以酮式构型存在。

碱基影响核酸的结构（１）碱基堆积力：（２）碱基配对：第二节DNA的分子结构一、碱基组成C、G、A、T和少量稀有碱基。

二、一级结构核酸是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸(polynucleotide)，DNA 的一级结构即是指四种核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)按照一定的排列顺序，通过磷酸二酯键连接形成的多核苷酸，由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，故又可称为碱基顺序。

核苷酸之间的连接方式是：一个核苷酸的5′位磷酸与下一位核苷酸的3′-OH形成3′，5′磷酸二酯键，构成不分支的线性大分子，其中磷酸基和戊糖基构成DNA链的骨架，可变部分是碱基排列顺序。

核酸是有方向性的分子，即核苷酸的戊糖基的5′位不再与其它核苷酸相连的5′末端，以及核苷酸的戊糖基3′位不再连有其它核苷酸的3′末端，两个末端并不相同，生物学特性也有差异。

寡核苷酸(oligonucleotide)是指二至十个甚至更多个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段。

目前多由仪器自动合成而用作DNA 合成的引物(Primer)、基因探针(probe)等，在现代分子生物学研究中具有广泛的用途。

表示一个核酸分子结构的方法由繁至简有许多种。

由于核酸分子结构除了两端和碱基排列顺序不同外，其它的均相同。

因此，在核酸分子结构的简式表示方法中，仅须注明一个核酸分子的哪一端是5′末端，哪一端是3′末端，末端有无磷酸基，以及核酸分子中的碱基顺序即可。

如未特别注明5′和3′末端，一般约定，碱基序列的书写是由左向右书写，左侧是5′末端，右侧为3′末端。

如pCpCpA或pC-C-A或5'-CCA-3'。

三、一级结构的分析测定方法1.重叠法——最初2.酶法——双脱氧终止法，自动测序的原理Sanger 双脱氧链终止法：DNA 的合成总是从5’端向3’端进行的。

DNA 的合成需要模板以及相应的引导核酸链。

DNA 的合成过程中，在合成的DNA 链的3’末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3’,5’－磷酸二酯键，使DNA 链合成终止，产生短的DNA 链。

具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA 链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA 链。

这四组DNA 链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA 的核苷酸序列。

目前根据该原理能够实现对DNA 的自动测序。

3. DNA 化学降解法Maxam 和Gilbert （1977）：基本步骤为(1)先将DNA 的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P ；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。

第三节DNA的二级结构一、DNA的二级结构双螺旋结构模型(double helix model)1953年，Watson和Crick提出了著名的DNA分子的双螺旋结构模型，揭示了遗传信息是如何储存在DNA分子中，以及遗传性状何以在世代间得以保持。

50年代初，Chargaff应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术，对多种生物DNA作碱基定量分析，发现DNA碱基组成有如下规律：(1)同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同；(2)一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变；(3)几乎所有的DNA，无论种属来源如何，其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔含量相同([A］=［T])，鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同([G］=［C])，总的嘌呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同(［A＋G］=［C]＋［T])。