紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选
紫外诱变技术实验报告
一、实验目的1. 掌握紫外诱变技术的原理和方法。
2. 了解紫外诱变在微生物育种中的应用。
3. 通过实验，筛选出具有较高产酶能力的突变菌株。
二、实验原理紫外诱变技术是利用紫外线照射微生物，使微生物DNA发生突变，从而获得具有优良性状的菌株。
紫外线照射能导致DNA分子中碱基对的改变、缺失或插入，进而影响基因的表达，产生新的遗传性状。
三、实验材料1. 菌种：产淀粉酶枯草芽孢杆菌。
2. 器材：紫外线照射装置、超净工作台、电磁力搅拌器、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球。
3. 培养基和试剂：无菌水、75%酒精、0.5％碘液、碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL、可溶性淀粉2g、牛肉膏1g。
四、实验方法1. 菌种活化：将产淀粉酶枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养24小时，得到活化菌种。
2. 菌悬液制备：将活化菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180r/min 振荡培养3小时，制成菌悬液。
3. 紫外诱变：将菌悬液置于紫外照射装置下，距离20~30cm，照射时间分别为1、2、3分钟，设置对照组（未照射）。
4. 细菌复苏：将照射后的菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37℃培养24小时，观察菌落生长情况。
5. 初筛：挑选生长速度较快、菌落形态异常的菌落，进行进一步的淀粉酶活性测定。
6. 淀粉酶活性测定：将挑选的突变菌株接种于可溶性淀粉培养基中，37℃培养24小时，用碘液检测淀粉酶活性。
7. 验证与保存：对具有较高淀粉酶活性的突变菌株进行验证，并保存于甘油管中。
五、实验结果1. 紫外线照射时间对菌落生长的影响：照射1分钟时，菌落生长速度明显降低；照射2分钟时，菌落生长速度有所下降；照射3分钟时，菌落生长速度明显下降。
2. 淀粉酶活性测定结果：经过筛选，发现突变菌株A的淀粉酶活性最高，为对照组的1.5倍。
紫外诱变复合重金属离子抗性突变选育霉酚酸高产菌株
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维普资讯
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中 国抗 生 素 杂 志 ２ ０ 年 ９月第 ３ ０７ ２卷 第 ９期
文 章 编 号 ： ０ １８ ８ （ ０ ７ ０ — ５ ６ ０ １ ０—６ ９ ２ ０ ） ９０３ ２
紫 外诱 变 复合重 金 属 离子 抗性 突变 选 育霉 酚 酸高产 菌 株
ＡＢＳ ＴＲＡＣＴ
Ａ ｍｙ ｏ ｅ ｏｉ ａ ｉ （ ＰＡ ） ｐ ｏ ｃ ｎ ｓ ｒ ｉ ｎ ｃｌｉ ｃ ｐｈ ｎ ｌ ｃｄ Ｍ ｃ ｒ ｄｕ ｉ ｇ ｔ ａ ｎ Ｐｅ ｉ ｉｌｕｍ ｂ ｅ ｃ ｍｐａ ｔ ｒ ｖｉｏ ｃ ｕｍ ＃ １ ２１ ３ ｗａ ｓ
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紫外线对枯草芽孢杆菌生产菌株的诱变与筛选
紫外线对枯草芽孢杆菌生产菌株的诱变与筛选马加强;吴明;马礼鹏;刘博【摘要】枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种革兰氏阳性菌，具有种类多、分泌蛋白能力强、安全性好等优点，是一种重要工业酶和工业制剂的菌种，被广泛应用于医药、食品、农业、饲料、造纸和纺织等多种领域。
为了进一步提高枯草芽孢杆菌的发酵能力，采用紫外线照射的方法诱导筛选高产菌株。
对通过紫外线诱导提高枯草芽孢杆菌产淀粉酶、蛋白酶、α－乙酰乳酸脱羧酶（α－acetolactate decarboxy－lase，简称α－ALDC）、3－羟基丁酮（Acetoin）和葡萄糖－1－磷酸（Glucose－1－phosphate，简称G－1－P）能力的条件进行了比较。
%Bacillus subtilis is a kind of gram positive bacteria, which has many advantages, such as abundant varieties, strong ability of secreting protein, good safety and so on.It is a kind of important industrial enzyme and industrial formulation, and has been widely used in many fields, such as medicine, food, agriculture, feed, paper and textile.In order to further improve the fermentation ability of Bacillus subtilis, the high yield strain was induced by UV irradiation.The conditions for improving the production of amylase, protease,α-ALDC, acetoin, glucose-1-phos-phate were compared by ultraviolet radiation.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2016(044)017【总页数】4页(P18-20,72)【关键词】枯草芽孢杆菌;紫外线诱导;酶制剂;3-羟基丁酮;葡萄糖-1-磷酸【作者】马加强;吴明;马礼鹏;刘博【作者单位】中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081;中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081;中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081;中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081【正文语种】中文【中图分类】S182枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，呈直杆状，内生芽孢，好氧，其菌落不透明，呈白色或微黄色，表面粗糙，可将体内生产的蛋白分泌到胞外。
运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株
运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株摘要本文介绍了运用紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株的方法，并对其进行筛选、鉴定及酶活测定。
通过实验验证，成功选育出一株植酸酶高产菌株，其酶活达到了较高水平。
介绍植酸酶是一种具有解除植物中植酸盐抗营养因子作用的酶。
在动物、人类体内，它能够释放无机磷以提高对磷的利用效率。
因此，植酸酶在生物技术和农业生产中具有极高的价值。
目前，获得植酸酶高产菌株的方法有很多，例如基因工程、长期培养筛选等。
然而，这些方法对设备、时间、技术水平等要求比较高，成本也比较高。
相比之下，运用紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株更具优势。
紫外诱变是一种传统的微生物术语。
它是指用紫外线辐射处理微生物，产生突变，从而改变微生物的某些性状的过程。
它有着速度快、操作简便、筛选效果显著等优点。
实验材料和方法实验菌株以原繁压菌作为研究对象。
原繁压菌是一种常见的生物菌株，可用于生物技术、医药、环保等领域。
实验中使用的原繁压菌来自于某生物技术公司。
实验设备和试剂实验设备包括无菌工作台、高压灭菌器、紫外线灯、恒温振荡培养箱、分光光度计等。
试剂包括琼脂、LB培养基、植酸盐、硝酸钠、Na2HPO4等。
实验步骤1.取10微升的原繁压菌液放置于琼脂平板上，待其全面涂布后将其放入无菌工作台上恒温培养。
2.取1平板用紫外线灯辐照1分钟，同时对照组以同样方式处理。
3.将受照试验组培养菌悬浮于LB液体培养基中，恒温振荡培养，选取菌株后进行次级发酵。
4.通过过筛试验及酶活测定鉴定所获得的高产菌株。
实验结果及分析经过实验验证，紫外诱变成功激发原繁压菌中某些菌株的植酸酶高产潜力。
在恒温振荡扩大培养的过程中，筛选和鉴定了一类植酸酶高产菌株。
经过次级发酵，该高产菌株平均比对照组酶活测定提高了50%左右，酶活达到了200u/g左右。
本实验成功地运用了紫外诱变技术获得植酸酶高产菌株。
该方法操作简便，快速，能够筛选出带有目的性的高产菌株。
本实验结果可以为利用微生物生产高附加值产品提供实验参考。
紫外诱变及其突变株的性能测试
紫外诱变及其突变株的性能测试1材料与方法1.1材料菌种：四铃啤酒酵母仪器：分光光度计、恒温振荡器、水浴锅、离心机、显微镜、蒸馏装置、分析天平。
培养基：麦芽汁培养基，麦芽汁固体培养基。
（麦芽汁由四铃啤酒厂提供）1.2试验方法1.2.1酵母菌的活化取菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶130r/min振荡培养，于28℃恒温培养箱培养14h，得到正常生长阶段的酿酒酵母菌悬液。
然后接种于斜面麦芽汁固体培养基上，采用28℃恒温培养14h，得到完全活化的正常生长的酵母菌。
1.2.2酿酒酵母菌对数生长期的测定1.2.2.1菌悬液的制备取1OmL菌液离心收集菌体，洗涤2次后，菌体悬浮于1OmL生理盐水中，制得菌悬液。
取活化的菌悬液各1mL接种于36支含9mL的麦芽汁液体培养基中，摇匀，130r/min振荡培养，每隔2h取试管3个，放入冰箱，全部培养结束用722型分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光度值，以空白的麦芽汁培养液为对比，根据所得数据做出酿酒酵母菌的生长曲线。
（此图视为参考）1.2.3紫外线诱变试验用麦芽汁液体培养基将处于对数生长期的菌悬液稀释，使菌种的浓度达到lx106个／mL。
(此处菌悬液浓度的确定采用三种方法：1.显微镜直接计数法;2.平板菌落计数法；3.光电比浊计数法)备注：平板直接计数法：如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落，且培养周期长，耗时多，工作量大，但是也是我们的强项，可以锻炼大一的动手能力。
2：显微镜直接计数法：比较直观，我们可以直接显微观察，多人工作计数。
耗时较短，且工作量较小，并且我系其他实验组采用此方法计数，可供参考。
3：光电比浊法：虽然绘制标准曲线要求较高，但是工作量较小，且一次绘制好标准曲线好后，以后可以用，准确率较高。
比较三种方法，我倾向于第一种和第三种，二者相比较，可以校正方案。
实验步骤：打开30W紫外灯预热30min，使其功率达到稳定。
紫外诱变实验报告结果
一、实验目的1. 通过紫外线诱变技术，提高微生物的产酶能力。
2. 筛选出具有较高酶活性的突变菌株。
二、实验原理紫外线诱变是一种物理诱变方法，通过紫外线照射微生物细胞，导致DNA分子发生突变，从而产生具有新的遗传特性的菌株。
本实验采用紫外线照射枯草芽孢杆菌，通过透明圈法初筛，筛选出具有较高淀粉酶活性的突变菌株。
三、实验材料1. 菌种：枯草芽孢杆菌2. 器材：紫外线灯、培养皿、涂布器、吸管、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球3. 培养基：可溶性淀粉培养基、牛肉膏培养基、0.5%碘液四、实验方法1. 紫外线照射：将枯草芽孢杆菌接种于牛肉膏培养基中，培养至对数生长期。
将培养好的菌液用无菌水稀释至一定浓度，取适量菌液均匀涂布于培养皿上，放入紫外灯照射箱中，照射距离为20-30cm，照射时间为1-3分钟。
照射过程中，严格控制死亡率在50%-80%。
2. 初筛：将照射后的菌落用无菌水洗涤，制成菌悬液。
取适量菌悬液涂布于可溶性淀粉培养基上，37℃培养24小时。
观察透明圈的大小，筛选出具有较大透明圈的突变菌株。
3. 酶活性测定：采用淀粉酶活力测定方法，测定筛选出的突变菌株的淀粉酶活性，并与原始菌株进行对比。
五、实验结果1. 紫外线照射后，部分菌株出现透明圈，且透明圈大小不一。
2. 经过初筛，筛选出10株具有较大透明圈的突变菌株。
3. 酶活性测定结果显示，筛选出的10株突变菌株的淀粉酶活性均高于原始菌株，其中菌株A的淀粉酶活性最高，达到原始菌株的1.8倍。
六、讨论与分析1. 紫外线照射能够有效诱导枯草芽孢杆菌产生淀粉酶活性突变菌株，且突变频率较高。
2. 初筛过程中，透明圈大小与淀粉酶活性具有一定的相关性，透明圈越大，酶活性越高。
3. 实验结果表明，通过紫外线诱变技术，可以有效地提高枯草芽孢杆菌的产酶能力，为微生物育种提供了一种新的方法。
七、结论1. 紫外线诱变技术是一种有效提高微生物产酶能力的方法。
2. 本实验筛选出的突变菌株具有较高淀粉酶活性，为后续的发酵生产和应用提供了有利条件。
紫外诱变、str抗性
预习报告要求
1. 了解本实验的每一具体步骤 2. 根据每一步的要求计算所需的各种培养基的量， 并确定每种培养基配制的总量及分装的要求。 3.以uv照射后达到90%的致死率，计算本实验生理 盐水的需要量。 4. 初步计算250ml三角瓶、9cm培养皿的需要量。
实验过程的主要步骤
1. 出发菌株的培养： 对数期、浓度为107-8 CFU（个/ml） 2. 单细胞菌悬液制备：玻璃珠打散 3. 诱变处理：5ml菌悬液 4. 诱变以后的后培养： 1ml接入30ml的LB液体培养基 5. 涂布str药物平板（已知临界浓度）
1.
2. 3.
4.
5.
培养基及其分装等 菌悬液培养：LB液体培养基（30ml/250ml 三角瓶） 药 物 平 板 ： 采 用 营 养 琼 脂 +str 药 物 （100ml/250ml三角瓶） 对诱变前后的菌悬液进行活细胞总数的计 数，计算致死率。 对诱变处理前的菌悬液进行str抗性菌落计 数，计算自发突变率。 对后培养以后的菌悬液进行活细胞总数和 str抗性细胞数的计数，计算突变频度。
需要思考问题
1. 为什么要制备单细胞对数期菌悬液进行诱变？ 2. 紫外诱变过程为什么要避光操作？为什么我们的 操作可以在红光下进行？ 3. 后培养的目的？为什么一定要进行液体培养？ 4. 突变频度是否就是突变率？ 5. 本实验进行了哪5次计数？各次的目的是什么？
生试0701班育种设计实验
时间安排（第5周）
时 间 上 午 下 午 2点
布置任务 清洗 3月12日
周三 8点15分
周四
周五周六1点Fra bibliotek1点30分
2点
* 请列出每天的具体实验工作内容
紫外诱变育种方案
紫外诱变大肠杆菌str(链霉素)抗性突变株的筛选一、目的要求1 、观察紫外线对链霉素产生抗性的诱变效应2 、学习并掌握物理诱变育种的方法。
二、基本原理紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。
紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。
紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。
但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。
经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。
另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。
三、实验材料(一) 菌种大肠杆菌(二) 培养基（完全培养基）1. 肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 0.5 g蛋白胨 1.0 gNaCl 0.5 g水 100 mLpH 7.2100 KPa 、121℃高压蒸汽灭菌20min。
如配制固体培养基需加琼脂1.5%～2%。
如配制半固体培养基则加琼脂0.7%～0.8%。
(三) 主要药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、链霉素。
(四) 主要器皿试管30支、移液管1mL10支、5mL3支、10mL1支、锥形瓶10个、量筒、烧杯、培养皿30个、离心管、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机、紫外诱变箱等。
四、实验内容(一) 诱变1. 菌悬液的制备出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16～24h。
取已培养20 h 的活化大肠杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，取4mL 于5mL离心管中离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10 min，以打碎菌块制成单菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。
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紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选
姓名：张鑫淼班级：生工1301
一．实验目的
以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。
了解细菌抗药性突变株的筛选方法
二．实验材料
菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）
培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基
试剂：2mg/ml链霉素，（Str）母液，无菌生理盐水。
仪器：1ml的移液管17个，10ml移液管11个，无菌试管9个，无菌培养皿15个，无菌三角瓶7个（其中一个内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管1个，离心机，紫外诱变箱等
营养肉汤蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH 7.4
营养琼脂蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15～20g蒸馏水1000mL
三．实验原理
以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。
因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。
为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。
物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w 的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA 分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。
在生产和科研中可利用此法获得突变株。
链霉素属氮基糖昔类抗生素，其杀菌机理是作用于核糖体小亚基，使其不能与大亚基结合组成有活性的核糖体，从而阻断细菌蛋白质的合成。
细菌对链霉素产生抗药性的作用机理一般是由于编码核糖体蛋白S12的rpsL基因或其他基因发生突变，导致相应的核糖体蛋白发生改变，是蛋白质合成不再受链霉素抑制。
四．实验内容与操作步骤
（一）出发菌株菌悬液的制备
1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h；
2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm振荡培养过夜（约16h），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h；
3. 取1ml培养液与1.5ml离心管中，10000rpm离心3~5min，弃去上清液，加1ml无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液；
4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内（预先加入9ml无菌生理盐水），振荡20~30min，以打散细胞；
5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注营养琼脂平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml菌液，37℃倒置培养24~36h，进行平板菌落计数。
同时选取合适浓度的菌悬液0.1ml涂布营养琼脂+Str平板（Str终浓度8ug/ml），37℃倒置培养24~36h,进行诱变前抗药菌落计数。
（二）UV诱变
1. 将紫外灯打开，预热30min；
2. 取直径6cm的无菌培养皿（含转子），加入菌悬液5ml，控制细胞密度为107~108个/ml；
3. 将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上，静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌，然后打开皿盖，分别处理5s、10s、15s、30s、45s，照射完毕后先盖上皿盖，再关闭搅拌和紫外灯；
4. 取0.5ml处理后的菌液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注营养琼脂平板进
行计数（避光培养）。
（三）链霉素抗性突变株的筛选、
1.取1ml诱变处理好的菌悬液接入20ml液体营养肉汤液体培养基进行后培养，37℃120rpm 摇瓶培养；
5. 对后培养以后的菌悬液进行适当稀释，分别取三个合适的稀释度个1ml，倾注营养琼脂平板，37℃倒置培养24~36h，进行平板菌落计数。
同时，选取合适浓度的菌悬液0.1ml,涂布营养琼脂+Str平板（Str终浓度8ug/ml），37℃倒置培养24~36h，进行诱变后抗药菌落计数，观察紫外诱变的效果。
五．实验结果及分析
1.对平板菌落进行计数，并计算死亡率
死亡率=（照射前活菌数/ml—照射后活菌数/ml）/（照射前活菌数/ml）
2.对诱变前后药物平板进行计数，计算大肠杆菌链霉素抗性的突变频度。
自发突变频度=（诱变前样品中Str抗性菌数）/（诱变前活菌数）
诱变突变频度=（后培养以后样品中Str抗性菌数）/（后培养以后样品中的抗性菌数）。