产果胶酶黑曲霉的筛选及诱变育种

方法同１．２．１。 １．２．３果胶平板培养基（％）［３１
Ｋ２ＨＰ０４ ０．１，ＭｇＳ０４ ０．０５，ＮａＮ％０．３，Ｆ０２ （Ｓ０４）３ ０．００１，琼脂２．０，果胶０．２，ｐＨ５．５。 １．２．４固体发酵复筛培养基
麸皮１０９，豆粕０．２５９，ＮＡＮ０３ Ｏ．３５９， （ＮＨ４）２Ｓ０４ ０．１９，装入２５０ｍｌ三角瓶，按料水比 （ｗ／ｖ）ｌ：１．５加入ｐＨ５．０—５．５的水。
第２８卷第２期 ２００８年４月
农业与技术
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖｄ．２８ Ｎｏ．２ Ａｐｒ．２００８
。６８’
产果胶酶黑曲霉的筛选及诱变育种
杜国军刘晓兰郑喜群
（齐齐哈尔大学。黑龙江齐齐哈尔１６１００６）
【摘 要】以黑曲霉（Ａ印廿ｇｉｌｌ啪ＩＩｉｇｅｒ）ＨＹ为出发菌株，进行了紫外线诱变。初筛使用透明圈法。从果胶平板上的突变茵株中。
哈尔大学学报。１９９８，（１）：６３—６６ ［５］张宁欣，赵学慧．果胶酶高产菌株选育［Ｊ］．微生物杂志。１９９６
（３）：１—８
［６］ｓ日ｔ｝Ｉｙａｍｍｙ蛐Ｎ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｏｐ硎翻《ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｐ既舡ｎｍ—ａ托耐删［Ｊ］．Ｐｒｏ嘲Ｂｉｏｅｈｅｍｉｓ打ｙ ３ｓ（ａｘＪａ）：９７８—９９６
本文链接：/Periodical_nyyjs200802024.aspx
１实验材料
１．１菌种 黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ＨＹ，由齐齐哈尔
大学生命科学与工程学院生化工程实验室提供。 １．２培养基 １．２．１斜面培养基（ＰＤＡ）
马铃薯２００９去皮，切块煮沸３０ｍｉｎ，然后用 纱布过滤，再加葡萄糖２０９及琼脂２０９，溶化后补 水至１０００ｍ１．ｐＨ自然。 １．２．２平板分离培养基（ＰＤＡ）
参考文献(6条) 1.Sathyanarayana N Purification and biochemical poperties of microbial pectinase-a review 2003 2.张宁欣;赵学慧 果胶酶高产菌株选育 1996(03) 3.江洁;刘晓兰 果胶酶活性分光光度计测定方法的研究 1998(01) 4.陈峰 果胶酶高产菌株选育及产酶条件与酶学性质研究[学位论文] 1999
Ｄ９ Ｄ１０
１３．７６ １５．７８
１９．５５
１．４２１
；————入＼·／ ２３．５０
１．４８９
攀
邑
式
烬
避
第１代 第２代 第３代
第４代 第５代
代数
图３突变株ＨＹ—Ｄ３酶活力遗传稳定性曲线
４结论
图２ ＨＹ—Ｄ３的透明圈 ３．２．２高产突变株的复筛
将初筛所得的正突变株分别接种于固体发酵 培养基作进一步复筛，部分结果见表２。最后筛选 出一株高产果胶酶的菌株ＨＹ—Ｄ３。
文献标识码：Ｇ
果胶酶（Ｐｅｅｔｉｎａｓｅ）是分解果胶质的多种酶的 总称…１。自然界产果胶酶的菌株很多，主要有曲 霉属、青霉属、镰孢属、克鲁维氏酵母及某些兼 性厌氧细菌等［２】２。目前国内外仍多以黑曲霉、根 霉和盾壳霉发酵法制取果胶酶。由于我国对果胶 酶的研究较晚，存在着酶活力低，应用效果不良 等缺点，严重制约着果胶酶的生产和开发。故本 文利用紫外线对黑曲霉进行诱变处理，旨在获得 性能稳定、酶活力高的优良菌株，为我国果胶酶 的研究和发展服务。
２．１．３平板分离 将菌悬液进行系列稀释。使之成１０５、１０４、
１０３、１０２个孢子／ｍｌ，并分别涂布于果胶平板培养 基，３６℃恒温培养５—７天。 ２．１．４菌株的筛选
向平皿中加入５ｍｌ碘液，静止２ｍｉｎ即可见清 晰的透明圈，将碘液倒出加入５ｍｌ生理盐水 １０ｒａｉｎ，将剩余碘液冲洗干净，选取透明圈与菌落 直径比大的接种于斜面培养基，并分别进行固体 发酵，选取酶活力高的作为出发菌株。 ２．２紫外线照射剂量的选择 ２．２．１取３６℃恒温培养５天的出发菌种斜面，用
表２突变株的复筛结果
菌种代号 ＨＹ（对照）
果胶酶活力（Ｕ／ｇ）
１２８５Ｄ３Fra bibliotek２６７６
Ｄ６
２３５１
本文以黑曲霉ＨＹ为出发菌株，采用紫外线 诱变方法，诱变剂量为２１０Ｓ，用透明圈法进行了 初筛，共筛选出１２０株突变株。对这些突变株进 行复筛后，最后筛选出１株高产果胶酶的菌株ＨＹ —Ｄ３，经传代５次进行产酶稳定性实验，发现ＨＹ —Ｄ３产酶性能稳定。
２．５突变株遗传稳定性的测定 对复筛获得的正突变株连续传代５代，采用
固体发酵法考察菌株的产酶特性。
３结果与讨论
３．１紫外线照射剂量的选择 各种诱变剂有不同的剂量表示方法。剂量一
般指强度与作用时间的乘积。在育种实践中，常 以杀菌率作为诱变剂的相对剂量。本文以相应条 件下的紫外线照射时间作诱变剂量，适宜剂量则 以对黑曲霉孢子致死率为指标进行选择。
万方数据
·６９·２００８年４月
农业与技术
０．９％的生理盐水洗下孢子，将孢子悬浮液置于无 菌的盛有玻璃珠的三角瓶中，震荡使孢子分散， 再以双层无菌擦镜纸过滤，使形成分散程度达９０ 。９５％的单孢子悬液。然后用生理盐水将孢子悬 浮液浓度调整到１０６个／ｍｌ。 ２．２．２吸取１０ｍｌ上述悬浮液，加入直径９厘米 的底部平整的平皿中。将１５Ｗ紫外灯打开，预热 ３０ｍｉｎ，使光波稳定。 ２．２．３将盛有悬浮液的平皿置于诱变箱内的磁力 搅拌器上，平皿距紫外灯管垂直距离３０ｃｍ，调节 搅拌子的转速，待搅拌子转速稳定后，打开平皿 盖子照射，照射计时从开盖起，加盖止，照射时 间分别为Ｏｓ、１２０ｓ、１８０ｓ、２４０ｓ、３００ｓ和３６０ｓ。 ２．２．４分别从每个照射时间的平皿中取出菌悬液 做适当稀释，吸取０．１ｍｌ涂布于分离平板培养基， 每一浓度涂布３个平板。 ２．２．５将平皿用黑牛皮纸包裹以避光，置于３６℃ 恒温箱中倒置培养，菌落长好后（约４天）记数。 诱变操作过程均在红光下进行。 ２．２．６计算不同照射时间的相对致死率：
万方数据
农业与技术
２００８年４月 ·７０·
表ｌ突变株透明圈直径与菌落直径比 菌种代号 菌落直径／ｅｍ 透明圈直径／ｅｒｎ 比值
续表
Ｄｌ
１５．１５
Ｄ２
１５．９６
Ｉ）３
１２．１４
Ｄ４
１７．６２
Ｄ５
１４．６０
Ｄ６
１５．５２
ＩＹ７
１３．５４
Ｄ８
１４．４３
２２．０６ ２３．５４ ２２．８０ ２６．３０ ２２．４０ ２６．３２ ２１．６４ ２０．９５
以上培养基均在０．ＩＭｐａ／ｃｒｎ２灭菌３０ｍｉｎ。
２实验方法
２．１出发菌株的筛选 ２．１．１菌种的活化
取斜面保藏的黑曲霉菌种１支，接种于ＰＤＡ 斜面培养基，３６℃恒温培养５．７天。 ２．１．２制备孢子悬液
取活化的斜面１支，加入无菌水洗下孢子。 制成均匀的孢子悬液，调整孢子浓度为１ａ６个／
ＩＩｌｌｏ
参考文献 ［１］张树政．酶制剂工业［Ｍ］．北京：科学技术出版社１９９５：６２５—６５０ 【２］张智维，杨辉，陈合．ＩＩｅ—Ｎｅ激光诱变选育果胶酶高产菌株［Ｊ】．
食品工业科技，２００６，（１０）：１５６—１５７ ［３］陈峰．果胶酶高产菌株选育及产酶条件与酶学性质研究［Ｊ］．华
中农业大学博士学位论文，１９９９ ［４］正洁，刘晓兰．果胶酶活性分光光度计测定方法的研究［Ｊ］．齐齐
相对致死率＝（未处理组存活孢子数一处理 组存活孢子数）／未处理组存活孢子数Ｘ １００％。 ２．２．７选择致死率７０％一８０％作为紫外线照射剂 量。 ２．３突变株的筛选 ２．３．１突变株的初筛
方法同２．１。 ２．３．２突变株的复筛
将初筛所获得菌株进行固体发酵，每株作５ 个平行，３６０Ｃ培养７２ｈ后，以干基的２５倍（ｗ／ｖ） 分别向培养基中加入蒸馏水浸提３ｈ，四层纱布过 滤，得粗酶液。将其适当稀释分别测各菌株的果 胶酶活力，选取果胶酶活力高的菌株。 ２．４果胶酶活力的测定方法
挑取了１２０株透明圈与茵落直径比值显著大于出发茵株的突变株。将这些突变株进行三角瓶目体发酵复拜。最后筛选出１株高产
果胶酶的突变株ＨＹ一１）３。突变株ＨＹ—Ｉ）３经斜面传代培养了５代，产酶遗传特性稳定．其果胶酶产量可迭２０００Ｕ／ｇ干基以上，比
出发菌株提高了１倍。
【关键词】黑曲霉；果胶酶；诱变
中图分类号：Ｓ０３５．２
１．４５６ １．４７５ １．８７８ １．４９３ １．５３４ １．６９６ １．５９８ １．４５２
Ｄ２６ Ｄ３８ Ｄ４５
２２６３ ２２３４ ２２１９
３．３突变株的产酶遗传稳定性 对突变株ＨＹ—Ｉ）３进行传代培养，连续传５
代，每代菌株进行固体发酵，结果见图３。由图３ 可见，突变株ＨＹ—Ｄ３传代５次后，果胶酶活力 都较高且产酶性状保持稳定。
采用３，５一二硝基水杨酸法（ＤＮＳ法）【４】。 底物为０．４％果胶溶液（ｐＨ４．０）。取０．５ｍｌ适当稀 释的酶液于比色管中，加入２ｍｌ底物溶液，４５。Ｃ 水浴反应３０ｒａｉｎ，加入ＤＮＳ溶液煮沸５ｍｉｎ，冷却， 定容至２５ＩＩｌｌ，５２０ｎｍ测定吸光值。酶活力定义为：
上述条件下每分钟分解果胶生成ｌｐｍｏｌ半乳糖醛 酸所需的酶量为一个酶活力单位（ｕ）。
5.张智维;杨辉;陈合 He-Ne激光诱变选育果胶酶高产菌株[期刊论文]-食品工业科技 2006(10)
6.张树政 酶制剂工业 1995
引证文献(3条)
1.裘纪莹.王未名.陈建爱.王同燕.杜方岭.梁新乐 微生物果胶酶的研究进展[期刊论文]-中国食品添加剂 2010(4) 2.武莹浣.叶汉英 果胶酶微生物筛选和酶活测定方法研究[期刊论文]-食品与机械 2010(2) 3.胡慧磊.艾方.彭丽桃 聚半乳糖醛酸酶菌株的分离、筛选及其鉴定[期刊论文]-食品科技 2010(8)
出发菌株用不同剂量的紫外线进行诱变，紫 外灯（１５Ｗ）距离３０ｅｍ分别照射１２０ｓ、１８０ｓ、 ２４０ｓ、３００ｓ、３６０ｓ，紫外线照射剂量与致死率关系 见图ｌ。