基因组DNA提取与PCR扩增技术

一、基因组DNA提取

实验目的

基因组DNA的制备是基因分析的前提。

本实验要求掌握基因组DNA提取的基本方法。

实验原理

DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的。核酸与蛋白质之间的结合力包括离子键、氢键、范德华力等，破坏或降低这些结合力就可把核酸与蛋白分开。

DNA、RNA所含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在260nm处，所以，可用紫外分光光度法测定DNA的浓度。

基因组DNA提取试剂盒：在高盐的状态下，DNA纯化树脂专一性地吸附DNA；而在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来。

器材与试剂

台式高速离心机、天平、水浴恒温箱、移液枪、塑料离心管等

试剂盒（纯化树脂、GN结合液、漂洗液、无水乙醇、离心纯化柱）、TE缓冲液

操作

1、将全血轻轻混匀，转移0.5ml全血到1ml纯化树脂中，颠倒混匀5-6次，室温，3min。

其间要颠倒混匀1次，5000r/min离心×3sec；

2、取沉淀，加1mlGN结合液悬浮沉淀，颠倒混匀，5000r/min离心×3sec；

3、取沉淀，加0.5ml漂洗液纯化树脂2次，颠倒混匀，5000r/min离心×3ecs；

4、取沉淀，加0.8ml无水乙醇悬浮沉淀，颠倒混匀；装入离心纯化柱，12000r/min离

心×1min，弃乙醇液；

5、空柱再12000r/min离心×1min，进一步弃乙醇液；

6、取离心好的纯化柱套入一干净的1.5ml离心管中，加入100ul TE缓冲液于纯化树脂

上（不能粘在管壁上），室温下放置3min，12000r/min离心×2min。

注意事项

一般情况下，纯净的DNA OD260/OD280比值约为1.8，RNA为2.0。若样品中含蛋白质，则比值下降，必要时需重新抽提。若DNA的比值<1.75，则加入SDS至0.5%；

从核酸中去除蛋白质时，常用到酚：氯仿等体积混合液。氯仿的作用是使蛋白质变性并有助于水相和有机相的分离；

DNA用TE溶解，可增加DNA的稳定性，便于长期保存。

二、PCR扩增技术

实验目的

本实验以所提出的全血基因组DNA为模板，以线粒体基因上一段核苷酸为引物，扩增出924bp的扩增产物。学习并掌握PCR 反应的基本原理与实验技术。

实验原理

多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。可简述为：

在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA，四种脱氧核苷酸（dNTP），和耐热Taq聚合酶及两个合成的DNA引物，并有Mg2+存在。

加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。

降低溶液温度，使合成引物在低温（56℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。

溶液反应温度升至中温（72℃），在Taq酶作用下，以四种dNTP为原料，引物为复制

起点，模板DNA 的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。

如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA 合成这一循环，使产物DNA 重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA 可作为后一循环的模板DNA 而参与DNA 的合成，使产物DNA 的量按2n 方式扩增。经过25～35个循环，DNA 扩增倍数可达106～109。

器材和试剂

器材

PCR 扩增仪，旋涡振荡器，台式离心机，加样枪及枪头等

试剂

1、蓝色管：Taq DNA 聚合酶、 dNTP 、Mg ＋＋等

2、黄色管：引物1（68kb 上游）、引物 2（69kb 下游）

3、白色管：无菌ddH2O

4、模板DNA ：为本次实验所提出的全血基因组DNA

操作

无菌ddH2O 21.5ul

Taq 酶等 25ul

引物1（68） 0.6ul 引物2 （69） 0.9ul

模板DNA 2ul

混匀后，离心5000r/min ×1min ，置PCR 仪

PCR 扩增的设定：

设置PCR 扩增仪的热盖温度为100℃

预变性：94℃5min

循环： 94℃变性30s

56℃退火30s

30个循环

72℃延伸30s

末次延伸：72℃ 5min

4℃保存

注意事项

1. 由于PCR 技术非常敏感，可使一个DNA 分子得以扩增，装有PCR 试剂的微量离

心管打开之前，应先在微量离心机上作瞬时离心使液体沉积于管底。

2. 最好在加完所有其它反应成分后才加模板DNA ，加模板DNA 时不要形成喷雾。

3. 若用没有热盖的PCR 扩增仪，则需在反应体系中加入液体石蜡等矿物油封闭体系

以防止反应过程中液体的蒸发。