2020年第二章微生物的纯培养和显微技术参照模板
2 微生物的纯培养和显微技术
2 、 扫描电镜 （ scanning electron microscope, SEM ）
电子束做电子探针在样品表面激发出二 次电子， 二次电子产生的多少与样品表面立体 形貌有关。对 二次电子处理，在荧光屏呈现放 大样品立体图像。 主要用于观察微生物的表面 三、显微镜观察样品的制备 结构。
1 、光学显微镜制样 2 、电子显微镜制样
4m 0m 焦f 距 （ ） 12m 70 m 工离 作 距 4 n光 蓝 2 µ 5 m源 0 . m 3 （ 光的率 ）分 时辨
2 、 特殊功能的光学显微镜
名称 普通光学镜 光源 可见光 特殊装置 视野 亮 样品处理与观 应用 察 染色、清晰 形态结构 观察
暗视野镜 相差镜
可见光 特殊聚光 器 可见光 环状光阑 ，相差板 短波光 滤光片
基分离
富集培养 目的菌验证
选择培养
练习思考题：
利用选择培养基如何筛选： （ 1 ）抗链霉素（ str ）细菌？ （ 2 ）降解利用尿素的细菌？ （ 3 ）分解利用纤维素的细菌 ？ 利用富集培养和选择培养如何分离： （ 1 ） 如何从土壤中分离筛选高温（ 70℃ ）解烃细菌？ （ 2 ） 如何从污染废水中分离筛选苯胺降解细菌？
同一 稀释度 培养 20 支
生长者为纯培养物
三、单细胞（孢子）分离
营养琼脂平板不能形成菌落的微生物 解剖显微镜下用吸管挑选单细胞（孢子 ） 显微镜下用显微操作仪挑选单细胞（孢 子） 操作难度与单细胞（孢子）大小成反比
四、选择培养分离
原理： 创造适于目的微生物生长条件 促使目的微生物快速生长成优势菌 抑制非目的微生物生长 从混杂微生物中选择分离目的微生物 1 、 利用选择培养基直接分离目的微生物 选择培养基（ selective medium ） 只允许特定微生物生长，而同时抑 制或阻止其它微生物生长的培养基。
第二章微生物的纯培养和显微技术
第二章微生物的纯培养和显微技术第二章微生物的纯培养和显微技术第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术。
1、微生物培养的常用器具及其灭菌（1）试管、玻璃烧瓶、培养皿。
（2）高压蒸汽灭菌，杀灭所有的微生物，包括休眠体，同时可保持培养基的营养成分不被破坏。
（3）高温干热灭菌。
2、接种操作无菌条件下，用接种环在火焰附近进行操作，或在无菌操作箱或操作室内进行。
二、用固体培养基获得纯培养1、菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
2、涂布平板法3、稀释倒平板法4、平板划线法5、稀释摇管法对氧气更加敏感的厌氧型微生物。
先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂融化后冷却，将微生物进行梯度稀释，冷凝后，在琼脂表面倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基隔开。
三、用液体培养基获得纯培养对一些个体大的细菌、许多原生动物、藻类。
稀释法。
接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。
经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。
只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类。
四、单细胞（孢子）分离采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。
较大的微生物较容易，个体较小的较难。
对较大微生物，用毛细管提取个体，在低倍显微镜下操作；对较小微生物，采用显微操作仪。
五、选择培养根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制大多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，培养一段时间后，通过平板稀释等方法进行纯培养分离。
1、选择平板培养2、富集培养制定特定的环境，使仅适应于该条件的微生物生长。
第2章纯培养和显微技术
参见P 23 第2大段
2020/2/19
2020/2/19
一、显微镜的种类及原理
参见P 24
5. 透射电子显微镜；6. 扫描电子显微镜
电子束通过电磁场时会产生复杂的螺旋式运动，但最终的结果是正如光线通过
放大 被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！ 分辨率 特定条件下能辨析的两点之间的最小距离 反差 被观察物区别于背景的程度
被观察物区别于背景的程度
与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良
好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。 P21 倒数第一段
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空气（n=1.0）、水（n=1.33）、香柏油（n=1.52） 显微观察时可根据物镜的特性而选用不同的介质
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用浸没油取代空气的作用：
参见P 22 第2大段
介质折射率提高
分辨率得到提高
改变光折射角度
增加照明亮度
光线在穿过折射率不同的介质时发生折射
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浸没油与玻璃的折射率相近
从混杂的群体中分离特定的某一种微生物， 是研究和利用微生物的第一步。（参见P13、14）
一、无菌技术
用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；
在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身
也不污染环境；
（P14第1段）
2020/2/19
一、无菌技术
参见P14
2020/2/19
一、无菌技术
参见P14
2020/2/19
第二章 微生物的纯培养和显微技术 第一节 微生物的分离和纯培养
• 采用显微分离法从混杂群体中直接分离单 个细胞或单个个体进行培养以得到纯培养， 称为单细胞（单孢子）分离法。
• 单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小 成反比，较大的微生物如藻类、原生动物 较容易，个体很小的细菌则较难。
较大的微生物：可使用毛细管提取单个个 体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几 次，除去较小微生物的污染。这项操作可 在低倍显微镜下进行。 个体较小的微生物：需采用显微操作仪， 在显微镜下进行。
六、二元培养物
纯培养物:只有一种微生物的培养物称为纯培养 物。 混合培养物:含有两种以上微生物的培养物称为 混合培养物。
二元培养物:如果培养物中只含有两种微生物，
而且是有意识的保持两者之间的特定关系的培 养物称为二元培养物。
例如病毒－－宿主，原生动物－－细小微生物
微生物纯培养分离方法的比较
方法
涂布平板法（spread plate method)
1、微生物悬液适当稀释 2、稀释液放置在无菌的已经凝固的营养琼 脂平板上 3、用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布 在培养基表面上 4、恒温培养
涂布平板法 稀释倒平板法
平板划线法（streak plate method）
用无菌的接种环以无菌操作沾取少许待分离 的培养物，在无菌的平板表面上进行划线。 划线的方法很多，常见的比较容易出现单个 菌落的划线方法有扇形划线、连续划线、方 格划线、放射划线、四格划线等。
如果经稀释后的大多数试管中没有微生物 生长，那么有微生物生长的试管得到的培 养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的 试管中有微生物生长的比例提高了，得到 的纯培养物的概率就会急剧下降。 因此，采用稀释法进行液体分离，必须在 同一个稀释度的许多平行试管中，大多数 （一般应超过95%）表现为不生长。
第二章微生物的纯培养和显微技术精品PPT课件
四联球菌
▲八叠球菌 按三个互相垂直的平
面进行分裂后，每八个 球菌在一起成立方体形.
如藤黄八叠球菌
（Sarcina ureae)
八叠球菌
▲葡萄球菌 分裂面不规则，多个球菌
聚在一起，像一串串葡萄。 如金黄色葡萄球菌
（Staphylococcus aureus)
第二节 显微镜和显微技术
显微镜自 身特点
放大倍数 分辨率 反差
显微 观察效果
操作者 技能
显微镜使用 标本制作 观察技术
一 显微镜的种类及原理 二 显微观察样品的制备
一 显微镜的种类及原理
普通光学显微镜 暗视野显微镜（视野暗，样品亮。细菌运动） 相差显微镜（不染色观察细微结构） 荧光显微镜（黑暗时荧光素吸收紫外线放出可见光） 电子显微镜
第二章 微生物的纯培养和显微技术
第一节 微生物的分离和纯培养 第二节 显微镜和显微技术 第三节 原核微生物 第四节 真核微生物
第一节 微生物的分离和纯培养
微生物的培养物（culture) 微生物的纯培养物(pure cultrue) 微生物的纯培养技术
无菌技术
防止实验操作过程中其被其他微生物污
显微镜的数值孔径与镜口角及工作距离间的关系 η.sinθ——数值孔径NA。
低倍镜 高倍镜
油镜
以空气做介质同以香柏油做介质的比较 η.sinθ——数值孔径NA。
(a)×500
(b)×175
(c)×210
(a) (b)暗视野显微镜观察 (c) (d) (e)相差显微镜观察
(d)×600
(e)×100
普通光学显微镜
机械装置——镜座、支架、载物台、调焦螺旋 光学系统——物镜、目镜、聚光器
第二章纯培养和显微技术
含牛奶选择培养基目的菌的平板
2020/5/13
例二：从土壤中分离筛选产高温淀粉酶（65℃）细菌
2020/5/13
2. 富集培养
特定的条件
2020/5/13
使目的微生物旺盛生长 待分离微生物在群体中成为优势菌 从自然界中分离到所需的特定微生物
例：从土壤中分离能降解利用对羟基苯甲酸的细菌
2020/5/13
• 纯种分离的原理和方法
2020/5/13
1. 用固体培养基分离纯培养法
• 原理： 使微生物稀释后在固体培养基平板上形成
单个菌落
方法： • 稀释倒平板法 • 涂布平板法 • 平板划线法 • 厌氧微生物的固体平板分离法
2020/5/13
2020/5/13
2、涂布平板法
使用较多的常规 方法，但有时涂 布不均匀！
单个（或一团相同）微生物在适宜的固体培养基表 面或内部生长、繁殖到一定程度形成肉眼可见的、有一 定形态结构的子细胞生长群体
众多菌落连成一片
2020/5/13
菌苔（lawn）
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般 都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微 生物进行分类、鉴定的重要依据。
解剖显微镜下用吸管挑选单细胞（孢子） 一般采用显微操作仪，在显微镜下进行； 操作难度与细胞或个体的大小成反比；
2020/5/13
4、选择培养分离法
原理： 创造适于目的微生物生长条件； 使待分离的目的微生物成为优势菌； 抑制大多数其它非目的微生物；
2020/5/13
• 方法：
• 1、利用选择培养基直接分离目的微生物 • 2. 富集培养
高温干热灭菌
2020/5/13
微生物学教案第二章微生物的纯培养和显微技术
微生物学教案第二章微生物的纯培养和显微技术第二章微生物的纯培养和显微技术大多数动物植物的研究、利用都能以个体为单位进行，而微生物由于个体微小，在绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性，微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。
在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物（culture），而只有一种微生物的培养物称为纯培养物（pure culture）。
由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。
相应的，微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。
显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等方面的内容。
实际上，正是由于显微技术及微生物纯培养技术的建立才使我们得以认识丰富多彩的微生物世界，并真正使对微生物的研究发展成为一门科学。
第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。
因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术（aseptic technique），它是保证微生物学研究正常进行的关键。
1.微生物培养的常用器具及其灭菌试管、玻璃烧瓶、平皿（culture dish，Petri dish）等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。
培养微生物的营养物质（称为培养基（culture medium））可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。
最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。
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冷冻真空干燥保藏
是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在 真空下通过水的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在 真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物 处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以 达到长期保藏的目的。
用水升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的 程度相对比较小，存活率及保藏效果均不错，是目前使用 最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。
•
1、传代培养保藏
是微生物保存的基本方法。 琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等。 橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温
保存。 4℃保存。
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2、冷冻保藏
代谢作用停止。 细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比
有细胞壁敏感。其原因是低温会使细胞内水分形成冰晶， 从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。 速冻及快速解冻可减少损伤；还可加一些保护剂，如0.5% 左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱 水作用而保护细胞； 大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各 种保护剂以提高培养物的存活率。
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三、用液体培养基分离纯培养
用于细胞大的细菌、原生动物和藻类等的 纯化分离。
稀释法：经高度稀释后，同一个稀释度的 试管中大多数（95%以上）表现不生长，很 可能得到的是纯培养。
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四、单细胞（单孢子）分离
单细胞分离：采取显微分离法从混杂群体中直接 分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。
菌落：单个微生物在 适宜的固体培养基表 面或内部生长、繁殖 到一定程度可以形成 肉眼可见的、有一定 形态结构的子细胞生 长群体。
菌苔：当固体培养基 表面众多菌落连成一 片时，便成为菌苔。
•
•
菌落
菌落或菌苔是对微生物进行分类和鉴定的重要依据。
细菌菌落特征剖面图 •
菌落
细菌菌落特征化学和生物等。以从土壤中分离能降解酚类化合物对 羟基苯甲酸的微生物的实验为例。
•
六、微生物的保藏技术
保藏期间微生物不死亡、不污染、不会因发生 而丢失重要的生物学性状。
许多国家都设有相应的菌种保藏机构：
中国微生物菌种保藏委员会 美国典型菌种保藏中心 世界菌种保藏联合会等
•
如要分离高温菌，可在高温条件进行 培养；要分离某种抗生素抗性菌株， 可在加有抗生素的平板上进行分离。
•
2、富集培养
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件， 使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增 加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。
•
3、干燥保藏法
沙土管保存和冷冻真空干燥保 藏是最常用的二项微生物干燥 保藏技术。
•
沙土管保存
一般将菌种接种至斜面，培养至长出大量的 孢子后，洗下孢子制备孢子悬浮液，加入无 菌沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干， 最后用石蜡、橡胶塞等封闭管口，置冰箱保 存。此法主要适用于产孢子的微生物，如芽 孢杆菌、放线菌等，保藏时间相对较长。
•
稀释倒平板法
Pour plate
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涂布平板法
无菌水、梯度稀释 涂布平板
Spread plate
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稀释倒平板法和涂布平板法
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平板划线分离法
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稀释摇管法
用于分离严格厌氧菌。先将一系列盛有无菌琼脂培养基 的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待 分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均 匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固 体石蜡的混合物，将培养基与空气隔开。
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第二节 显微镜和显微技术
显微镜的种类及原理 显微观察样品的制备
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一、显微镜的种类及原理
普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 扫描隧道显微镜
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普通复式光学显微镜
普通生物显微镜由三部分构成： ➢ 照明系统：包括光源和聚光器。 ➢ 光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显 微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜 和物镜都由复杂的透镜组构成。 ➢ 机械装置：保证光学系统的准确配制，用 于固定材料和观察方便。
第三章 微生物的纯培养和显微技术
A：研究微生物的途径：（群体） 培养物：在微生物学中，在人为规定的条
件下培养，繁殖得到的微生物群体。 纯培养物：只有一种微生物的培养物。
（利于研究、应用、重复结果） B：利用显微技术进行研究
显微技术包括显微标本的制作、观察、测 定、分析及记录等方面的内容。
•
第一节 微生物的分离和纯培养
单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比。 个体较大的可在低倍显微镜下进行，个体较小的 则需采用显微操作仪。
•
五、选择培养分离
当某一种微生物所存在的数量与其他微 生物相比非常少时，单采用一般的平板 稀释方法几乎是不可能分离到该种微生 物的，故需采用选择培养分离法。
•
1、利用选择培养基进行直接分离
菌种保藏
菌种保藏：就是根据菌种特性及保藏目的 的不同，给微生物菌株以特定的条件，使 其存活而得以延续。
对于生产中使用的菌种保藏培养基， 要求比较丰富的氮源，以防止菌种退 化变质。
•
菌种保藏方法
连续移接 改变条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）
使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到 半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得 到保藏，有的可保藏几十年或更长的时间。 在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物 恢复活力。
培养平板（平板）：指熔化的固 体培养基倒入无菌平皿，冷却凝 固后，盛有固体培养基的平皿。
•
平板分离微生物纯培养技术
稀释倒平板法 涂布平板法 平板划线分离法 稀释摇管法
•
1、稀释倒平板法：
无菌水、梯度稀释、50℃左右的琼脂培养基、灭过菌 的培养皿。注意要稀释得当。
分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到 纯培养。
无菌技术 用固体培养基分离纯培养 用液体培养基分离纯培养 单细胞（单孢子）分离 选择培养分离
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一、无菌技术
无菌技术：在分离、转接及培 养纯培养(物)时防止其被其他 微生物污染的技术。
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保持无菌的方法
高压蒸气灭菌 高温干热灭菌 棉塞 超净工作台等
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接种操作
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二、用固体培养基分离纯培养