腺相关病毒概述
活体实验的利器：AAV腺相关病毒来了！
活体实验的利器：AAV腺相关病毒来了！
“AAV”是“Adeno-associated virus”，也即是腺相关病毒的缩写。
AAV病毒是一种理想的外源基因导入细胞的工具，无法自主进行复制，安全性高。
AAV病毒直径只有20-30 nm（慢病毒直径90-110 nm），相对容易穿透血脑屏障，在活体注射实验上有更大优势。
相对地，AAV能包装的基因片段也比慢病毒小，通常能包装3kb 以下的基因片段。
不同病毒的生物学特性比较
不同血清型AAV的组织嗜亲性
AAVPrime™ 腺相关病毒颗粒
12种血清型可选
预制腺相关病毒颗粒折后低至1190元
直接用于活体实验
定制包装服务范围：ORF cDNA, shRNA, CRISPR sgRNA，SaCas9
高滴度：纯化型AAV病毒滴度高达10^14 GC/ml (genome copies/ml)
*AAV克隆可选启动子
CMV, EF-1α, CAG, CBh, CAMKlla, hSYN, MHC
*AAV对照颗粒选择
GFP, IRES-GFP, LacZ, CRE, mCherry, FLuc, GLuc
AAV应用
可用于基因过表达，敲低，敲除的体内或体外实验。
病毒转基因技术原理腺相关病毒课件
腺相关病毒的监管现状与政策建议
监管机构
各国政府设立了相应的监管机构 ，负责监督和管理病毒转基因技
术的研发和应用。
法规制定
各国政府制定了一系列法规和标 准，以确保病毒转基因技术的安
全性和可靠性。
政策建议
建议各国政府加强国际合作，共 同制定和完善病毒转基因技术的
监管政策和标准。
未来展望与研究方向
未来展望
06
CATALOGUE
腺相关病毒的安全性评价与监管现状
腺相关病毒的安全性评价
宿主范围
腺相关病毒的宿主范围窄，主 要感染分裂期细胞，对静止期
细胞不感染。
免疫原性
腺相关病毒的免疫原性低，不 会引发明显的免疫反应。
基因整合
腺相关病毒的基因整合频率低 ，不会引起基因突变。
毒性
腺相关病毒的毒性很低，对动 物和人体无毒害作用。
病毒转基因技术原 理腺相关病毒课件
目录
• 病毒转基因技术概述 • 腺相关病毒概述 • 腺相关病毒作为基因治疗载体的优势与局
限 • 腺相关病毒的基因转移机制 • 腺相关病毒在基因治疗中的应用案例 • 腺相关病毒的安全性评价与监管现状
01
CATALOGUE
病毒转基因技术概述
病毒转基因技术的定义与特点
04
新产生的病毒粒子通过 细胞膜释放到细胞外， 完成基因转移过程。
腺相关病毒的免疫反应与逃逸机制
宿主细胞对腺相关病毒的感染会产生 免疫反应，如产生抗体和细胞毒性T 细胞等。
了解腺相关病毒的免疫反应与逃逸机 制有助于提高基因转移效率和安全性 。
腺相关病毒通过逃逸机制逃避宿主细 胞的免疫攻击，如抗原变异和免疫抑 制等。
总结词
腺相关病毒在罕见病基因治疗中具有独 特优势，为罕见病患者提供了新的希望 。
腺病毒知识点总结
腺病毒知识点总结1. 腺病毒的分类腺病毒目前已知包括了六个属，分别为腺病毒属（Mastadenovirus）、阿卡洛病毒属（Atadenovirus）、索哈病毒属（Siadenovirus）等。
其中腺病毒属包括高度致病性的人类腺病毒、犬腺病毒等。
2. 腺病毒的结构腺病毒的外壳由蛋白质构成，内含双链DNA。
典型的腺病毒粒子呈多面体或类似无规则聚合的形状，直径约70-90纳米，表面均匀分布有纤维状的突起。
腺病毒粒子内含有DNA、蛋白质和酶。
3. 腺病毒的感染机制腺病毒通过呼吸道、消化道、眼部粘膜等途径进行感染。
一旦腺病毒进入人体，通过与细胞表面相关受体结合，进入细胞内。
腺病毒感染后，宿主细胞会被利用来合成病毒的DNA 和蛋白质，在宿主细胞内进行繁殖和增殖，破坏并利用宿主细胞的资源。
4. 腺病毒的致病性腺病毒引起的疾病种类繁多，常见的包括呼吸道感染、结膜炎、胃肠道感染、脑膜炎等。
不同种类的腺病毒可引起不同的疾病。
例如，腺病毒D型和E型主要引起呼吸道感染，腺病毒F型主要引起眼部感染。
5. 腺病毒的预防措施目前，预防腺病毒感染的主要措施包括加强个人卫生、保持良好的生活习惯、接种疫苗等。
通过保持清洁卫生，避免接触患者体液，保持良好的生活习惯，如良好的饮食习惯、充足的睡眠等，有助于预防腺病毒感染。
此外，疫苗接种也是预防腺病毒感染的有效手段。
目前，已有一些疫苗用于预防特定种类的腺病毒感染。
总之，腺病毒是一类广泛存在的病原体，对人类和动植物造成了严重威胁。
了解腺病毒的分类、结构、感染机制、致病性和预防措施等知识，有助于人们更好地认识腺病毒，预防和控制腺病毒感染，保障公共健康。
希望通过本文的介绍，读者能够更全面地了解腺病毒及其相关知识。
腺病毒感染怎么办
腺病毒感染怎么办一、腺病毒感染的概述腺病毒感染是一种常见的病毒感染，主要通过空气飞沫传播，尤其在冬春季节较为流行。
该病毒常引起上呼吸道感染，如感冒、咽炎等，也可导致眼部感染、胃肠道感染等。
二、腺病毒感染的症状腺病毒感染的症状多种多样，包括但不限于以下几种常见症状：1.上呼吸道感染症状：如咳嗽、打喷嚏、鼻塞、流鼻涕等。
2.咽部症状：如咽喉痛、扁桃体发炎等。
3.眼部症状：如结膜炎、眼结膜发红、流泪等。
4.胃肠道症状：如腹泻、腹痛、恶心、呕吐等。
5.发热：体温升高。
三、腺病毒感染的诊断腺病毒感染的诊断主要基于病史和临床表现。
医生可以根据患者的症状进行初步判断，并通过咽拭子、眼部分泌物等样本进行病原体检测。
此外，也可以通过血清学检测来确定感染情况。
四、腺病毒感染的治疗目前，腺病毒感染的治疗主要是对症治疗，缓解症状并促进康复。
以下是常见的治疗方法：1.卧床休息：患者应适当休息，避免过度劳累，有利于提高免疫力。
2.充足饮水：饮水可以稀释病毒，促进体内废物排除，预防脱水。
3.温热水洗浴：温热水洗浴有助于缓解鼻塞、咽痛等症状。
4.对症治疗：如发热可以使用退烧药物，咽痛可以漱口或含漱含漱液等。
5.药物治疗：对于某些病例，医生可能会考虑使用抗病毒药物，以减轻病情。
五、腺病毒感染的预防与控制腺病毒感染的预防与控制是非常重要的，以下是一些常见的预防措施：1.接种疫苗：腺病毒疫苗的接种可以有效预防感染，特别是对于容易受感染的人群，如儿童和老年人。
2.勤洗手：经常洗手可以有效减少病毒的传播，特别是在接触到有病毒的物体或人之后。
3.避免接触：尽量避免接触已经感染的人，避免参加人员密集的场所。
4.健康生活习惯：保持良好的生活习惯，如良好的饮食、充足的睡眠等，可以提高免疫力，减少感染的机会。
5.咳嗽礼仪：咳嗽或打喷嚏时使用纸巾或屈肘遮挡口鼻，避免飞沫传播。
六、腺病毒感染的并发症及预后腺病毒感染引起的并发症相对较少，但还是需要警惕可能的并发症，如中耳炎、肺炎等。
腺病毒是什么病毒严重吗
腺病毒是什么病毒？病毒危害程度如何？
腺病毒是一类拥有足柄的DNA病毒，可以感染人类和其他哺乳动物。
腺病毒
主要通过呼吸道分泌物、唾液等途径传播，感染后引起一系列的疾病。
腺病毒感染症状
腺病毒感染的症状主要包括发热、咽喉痛、咳嗽、流感样症状、淋巴结肿大等。
在一些感染严重的情况下，可能会出现肺炎、心肌炎等并发症。
腺病毒传播方式
腺病毒主要通过空气飞沫传播，也可通过接触患者的呼吸道分泌物等间接传播。
感染腺病毒后，患者可能在症状出现前数天就已具有传染性，因此很容易引起传播。
腺病毒的治疗方法
目前尚无特效的针对腺病毒的药物，一般采用对症治疗的方法，如退热、保持
充足的水分摄入、休息等。
对于一些严重病例，可能需要住院治疗，接受支持性治疗。
预防腺病毒感染
预防腺病毒感染的最有效方法是加强个人卫生习惯，勤洗手、避免接触患者呼
吸道分泌物、避免密切接触感染者等。
此外，腺病毒疫苗的接种也是有效的预防措施。
综上所述，腺病毒虽然具有一定的传染性和感染性，但通过正确的预防措施和
及时的治疗，大多数患者可以获得良好的康复。
如感染腺病毒后出现严重症状，应及时就医并遵医嘱接受治疗，以减少病情恶化的危险。
病毒转基因技术原理 腺相关病毒
病毒转基因技术原理腺相关病毒
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第一节腺相关病毒简介
l生物学特性 l致病性与免疫性
第一部分生物学特性
l血清型 l病毒结构 l病毒复制 l对理化因素的抵抗力
血清型
lAAV是从腺病毒的污染物1965年、人群或非人灵长类动物等 的组织中分离鉴定到的, l共鉴定了11个AAV血清型以及108个AAV变株variants， l通过签名PCRsignaturePCR技术,利用高度保守序列扩增Cap 基因的一小段可变区的DNA序列,以筛检是否是新的AAV分离 株,然后利用PCR技术获得新的AAV分离株的Cap或和Rep基 因的全长序列，在人类、非人灵长类动物、马、猪、牛、绵 羊、山羊和蛇等的不同组织器官,发现了大量的具有多样性的 AAV的基因组，但新分离的病毒株,尚未进行血清学分型,通称 为变株， lAAV不同血清型和变株的基因组结构相对较为保守,与AAV-2 型较为类似,不同血清型的衣壳蛋白结构中表位的差异， 50~80%AAV-2抗体在人群中检测出，
第二节腺相关病毒载体 转基因技术原理
l蛋白表达型腺相关病毒载体
―三成分包装系统 ―自我互补型AAV载体self-complementaryAAVvector,scAAV l基―因打反靶式型剪腺接相型关A病AV毒载载体体trans-splicingAAVvector,tsAAV lrA―AV衣的壳纯蛋化和白定修量饰型AAV载体
腺病毒和腺相关病毒有哪些区别
腺病毒和腺相关病毒有哪些区别？腺病毒和腺相关病毒（AAV）是用于基因传递的两种不同类型的病毒载体。
这两个重组病毒系统都具有感染广泛宿主的能力，包括分裂和非分裂细胞，而无需与宿主基因组整合。
它们两之间有几个主要区别：包装能力、水平，基因表达的起效和持续时间以及免疫应答。
腺病毒简介腺病毒有约8.5千碱基的容量，具有高水平的蛋白质表达和瞬时基因表达。
表达的发作时间可早于感染后16-24小时。
腺病毒系统的局限性主要在于靶细胞的高免疫应答。
尽管如此，由于它们对大多数组织有高效转导作用，仍被广泛用于研究中。
腺病毒不能整合至宿主基因组，仅能瞬时表达。
它可以对分裂期及非分裂期细胞进行感染。
其包装片段至多8 kb，浓缩滴度至多为1011-1012TU/mL，片段越大，滴度越低，表达水平还是比较高的。
腺病毒优势宿主范围广：能够感染分裂期细胞与静止期细胞；对上皮细胞有高度嗜性，尤其适用于感染原代细胞、悬浮细胞等难转染细胞类型感染效率高：优于其他病毒载体和转染系统的高感染能力，能达到近100%的效率包装容量大：最高可插入7.5 kb的外源片段表达水平高：1-2d即开始高水平表达安全系数高：去除病毒蛋白编码序列，降低细胞毒性和免疫反应；双质粒转染系统，生物安全性高无整合风险：无插入致突变性腺相关病毒简介AAV的包装容量约为4.5千碱基，蛋白质表达水平相对较低，有长效基因表达的潜力。
AAV的趋向性也可以通过不同的血清型增强。
AAV的主要缺点是其对目的基因的包装容量较小，并且表达起效较晚（体外2-7天，体内3-21天），然而，该传递系统所产生的免疫应答水平却非常低。
腺相关病毒可以稳定整合至宿主基因组，并且可以在特定基因产物存在的条件下整合至人类19号染色体中的特定位点。
它能对分裂期及非分裂期细胞进行感染。
其包装片段至多8 kb，浓缩滴度至多为1011-1013TU/mL，片段越大，滴度越低。
腺相关病毒可以应用Tet-on等诱导表达系统，表达水平也是比较高的。
病毒转基因技术原理腺相关病毒课件
ITR
ITR中的前125个核苷酸具有回文结 构，其中还存在两个小的内部回文结 构，可自身折叠后经碱基配对、形成T 字形的发夹结构；剩余的20个核苷酸， 保持非配对状态，称为D序列（D sequence）。 ITR中还具有Rep结合元件（Rep binding elements， RBEs) RBE和 RBEˊ ， 以及一个末端解离位点TRS （terminal resolution site）等重要序 列。 ITR是在AAV生物学中重要的顺式
右端的ORF（Cap基因）
由P40启动子指导转录，产生两个转录物，可编码三个病毒衣壳蛋白， 即VP1，VP2和VP3。 这些衣壳蛋白利用共同的ORF ，但转录起始位置不一致。 一般而言，VP1、VP2和VP3的分子比是1：1：8/10。 构成这些病毒体的衣壳蛋白的比例的差异，最有可能会影响病毒的感染 性，尤其是VP1含量低的情况下。缺乏VP1的病毒体没有感染性。
AAV-3 AAV-4 AAV-5 AAV-6 AAV-7
受体和辅助受体
α2–3/α2–6 N linked SA HSPG, FGFR1, HGFR, integrins, 37/67 kDa LamR HSPG, 37/67 kDa LamR α2–3 O linked SA α2–3 N linked SA, PDGFR HSPG, α2–3/α2–6 N linked SA
AAV的复制周期可以分为两个阶段
AAV成功感染细胞后，依据是否有辅助病毒存 在的情况下：裂解阶段（ lytic stage）和溶原性阶 段（lysogenic stage）
溶原性阶段（lysogenic stage）:在缺乏辅助病毒如AdV、HSV等感染的 情况下，AAV几乎不能复制，基因表达受到抑制，AAV基因组会整合到 染色体q13.4的一个4kb大小的区域（命名为AAVS1），建立潜伏感染
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腺相关病毒引言腺相关病毒（AAVs）是一种复制缺陷型细小病毒，其生产性感染需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以生产出无需辅助病毒的重组人血清型2型腺相关病毒（AAV-2）。
AAV HELPER-FREE SYSTEM利用已经明确用于调节AAV复制和表达的腺病毒基因产物，并且这些基因产物能通过转染引进宿主细胞。
在AAV HELPER-FREE SYSTEM中，生产具感染性的AAV 病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（例如：E2A,E4和VA RNA 基因）大部分由和人AAV-2载体ＤＮＡ共转染进细胞的pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。
本系统包括通过改良HEK293腺相关病毒生产能力而衍生出的AAV-293细胞。
通过消除对活的辅助病毒的需求，AAV Helper-Free System提供一个更安全，更纯净和更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统。
野生型AAV-2基因组由病毒rep和cap基因（分别编码复制和基因）及位于两侧的包含所有辅助和包装必须的顺式作用元件的反向末端重复序列（ITRs）组成。
在AAV Helper-Free System中，rep和cap 基因从病毒载体中移除并转移到pAAV-RC质粒中，AAV-2 ITRs仍位于病毒载体中。
AAV rep和cap基因的转移允许感兴趣的外源基因插入病毒基因组中。
本系统可以容纳最大插入3kb。
在传统的基因传递系统中，有一个很大的顾虑是通过重组而恢复病毒野生型。
在本系统中，包含AAV-2末端重复序列的质粒(pAAV-MCS, pAAV-LacZ 和pAAV-hrGFP 以及 pAAV-IRES-hrGFP)与包含rep/cap基因的质粒(pAAV-RC)没有任何共同区域，从而阻止通过重组来野生型AAV-2。
为了确保这种无共同区域的保持，只用本系统提供的组件是非常重要的。
特殊情况下，只能用pAAV-RC作为rep和cap基因的来源和包含ITR的载体进行共转。
在AAV载体生产和AAV储存液滴度测定步骤中，AAV Helper-Free System都消除了对野生型腺病毒进行共感染的需求，使本系统成为彻底的无辅助病毒系统。
而传统的AAV载体滴度测定时，需要野生型腺病毒和AAV载体储存液进行共感染。
由于细胞类型的不同，进行滴度测定时用腺病毒进行共转染的最佳MOI值也是不同的，通常需要进行优化，这就导致了共转染进行滴度测定的方法变的复杂。
在我们AAV Helper-Free System中独创了一个新颖的无腺病毒滴度测定方法，去除了对腺病毒进行共感染的需求，而且得出同腺病毒共感染方法相同的结果。
重组腺相关病毒是基因传递和表达的一个重要工具。
AAV Helper-Free System具有广泛的宿主范围，高滴度病毒生产能力和长期的基因转染潜力的特征。
AAV具有广泛的细胞类型感染能力，并且不依赖于宿主细胞活跃的分裂能力。
另外，由于本系统不包含任何野生型病毒产品，宿主细胞免疫反应被降至最低，从而允许对具有免疫能力的宿主细胞进行基因传递。
对于哺乳动物细胞基因传递策略，高滴度的重组病毒生产能力是必须要顾及的。
AAV Helper-Free System可以生产出重组病毒滴度≥107病毒颗粒/毫升的病毒原液（浓缩后可以获得更高的滴度，文献报道浓缩后滴度最高可达≥1012病毒颗粒/毫升。
浓缩及纯化方法见参考文献）。
AAV-2在复制许可的前提下具有复制到染色体上的能力，所以AAV-2在长期基因表达方面有特别重要的价值。
缓慢分裂期或非分裂期细胞可以长期保存AAV-2基因组于染色体上，并能稳定表达。
高速分裂期细胞在细胞复制和分裂后失去染色体上病毒基因组，并因此失去基因表达能力。
病毒整合进基因组也会发生，但是整合事件是罕见的。
如果进行极高的复感染或者细胞被感染过并表达腺病毒复制酶，整合事件发生的频率则会增加。
腺相关病毒用于基因传递和表达的优势较高的生物安全级别AAV-2是天然缺陷型病毒（生产性感染依赖于几个额外的反式因子），并且目前还没有发现它和任何的人类疾病有关联。
在AAV Helper-Free System中，AAV-2 反向重复（ITR）序列和rep/cap基因分别位于缺少共同序列的单独的质粒上，以阻止生产出重组野生型病毒。
这样特征赋予了作为病毒来源的基因传递和表达系统的AAV Helper-Free System一个较高的生物安全级别。
宿主细胞范围广腺相关病毒可以感染广泛的哺乳动物细胞并且以成功应用于人类和非人来蛋白的表达。
和其它病毒来源各种载体相比，已证明用于具有免疫活性细胞的基因表达时，腺相关病毒载体效果更好。
高滴度按照此手册重组AAV-2可以生产出≥107 病毒颗粒/毫升的高滴度病毒。
文献报道病毒原液经浓缩后滴度最高可达≥1012病毒颗粒/毫升。
宿主细胞活跃的分裂不是感染的必要条件重组腺相关病毒能感染分裂期和非分裂期细胞。
表达出的人类蛋白质可以正确的折叠和修饰因为AAV Helper-Free System可以传递基因进入宿主人类细胞系，所以利用此系统表达的人类蛋白质可以正确的进行翻译后的修饰和折叠。
长期的基因表达潜能重组AAV-2能保存于人类宿主细胞中，保持长期的基因转录潜能。
在所有的细胞群中，病毒基因组通常存在于染色体上，一般形成串联体。
这些串联体在缓慢分裂或非分裂细胞内稳定存在，在细胞群内长期进行基因转录和表达。
然而，在处于高速分裂的细胞群内，则会丢失染色体上AAV基因组。
病毒能整合今进宿主基因组，导致基因在分裂期细胞内长期表达，但是这是稀有事件。
如果使用极高感染复数（MOI）的AAV进行感染或细胞被感染过野生型腺病毒并表达腺病毒复制酶，则整合发生的可能性会增加。
然而，使用野生型腺病毒来增加整合事件会降低AAV系统的生物安全性。
AAV System简述使用AAV System生产重组AAV颗粒。
第一步是把外源基因克隆进合适的载体。
大多数情况下，外源基因被克隆到一个包含ITR/MCS的载体中（pAAV-MCS 或pAAV-IRES-hrGFP）。
这些载体中反向末端重复（ITR）序列提供所有AAV-2复制和包装必须的顺式作用元件。
在一些情况下，插入到含ITR的载体的某些序列由于大肠杆菌内ITRs之间的同源重组而发生序列重排。
这时，外源基因应首先克隆进穿梭载体pCMV-MCS中，构建鉴定完成后，将包含表达框的Not I片段亚克隆进已经经Not I酶消化好的包含ITR的pAAV载体中。
重组表达质粒同pHelper（携带腺病毒来源的基因）和pAAV-RC（携带AAV-2复制和衣壳基因）共转染进AAV-293细胞（提供AAV复制和包装所需的所有反式作用因子）。
从被感染AAV-293细胞中收集AAV-2病毒颗粒，随后用于感染各种哺乳动物类细胞。
感染宿主细胞后，基因表达前，单链病毒必须变成双链病毒。
病毒互补链的合成依赖于细胞复制因子。
这个转变是重组基因表达的限制步骤，可以通过腺病毒双重感染或依托泊苷（喜树碱或丁酸钠）来加速。
然而，加速基因表达的试剂对目标细胞是有毒的，如果残留到细胞上会杀死目标细胞。
因此依托泊苷只能短期使用或为了提高病毒滴度时使用。
通常，为了基因的稳定表达，AAV基因组在细胞内会形成高分子量多联体。
腺相关病毒包装细胞AAV-293冻存AAV-293细胞的复苏：1、将10mlDMEM生长培养基（见培养基和试剂的准备）加入15ml圆锥管中。
2、将细胞冻存管放入37℃水浴中轻轻摇动1-2分钟使之融解。
从水浴中拿出冻存管并通过用70%酒精（室温）擦拭管表面进行净化。
3、将融解的细胞悬浮液移至装有10 ml生长培养基的锥形管中。
4、200×g，3分钟，室温离心收集细胞。
吸去生长培养基。
5、加入5 ml新鲜生长培养基到锥形管中，用吸液管上下轻轻吹打使细胞悬浮。
6、将5 ml细胞悬浮液移至75cm2含有10 ml新鲜生长培养基的组织培养瓶中。
将细胞放入37℃，5%CO2培养箱中。
7、每天监视细胞密度。
当细胞培养至50%汇合率时要进行传代。
接下来进行AAV-293细胞传代或AAV-293细胞液氮存贮液的准备。
AAV-293细胞的传代：注：下述的实验方案是从75cm2组织培养瓶中传代细胞。
当细胞单层达到50%汇合率时需要进行传代，如果细胞汇合率超过70%，AAV-293细胞会失去增强的病毒生产表型。
1、在37℃水浴中预热DMEM生长培养基和胰酶-EDTA溶液。
2、移去生长培养基。
用10 mlPBS(phosphate-buffered saline)清洗细胞一次。
3、用5 ml胰酶-EDTA溶液消化细胞1-3分钟。
注：用胰酶-EDTA溶液作孵育细胞的时间最短需要使贴壁细胞从培养瓶上脱落下来。
这个过程可以使用倒置显微镜监视，过度消化会破坏或杀死细胞。
4、用5 ml生长培养基稀释细胞以使胰酶失活。
5、分别转移2 ml的细胞悬浮液到每一个175cm2的组织培养瓶，共5瓶。
每一瓶含有28 ml的生长培养基。
将细胞放入37℃，5%CO2培养箱中。
每天查看细胞密度，细胞汇合率要维持在50%。
AAV-293细胞液氮冻存：1、37℃水浴预热DMEM生长培养基，胰酶-EDTA溶液和冻存培养基。
2、收集健康的处于对数生长期的细胞。
吸去生长培养基，用10 ml PBS清洗细胞。
用胰酶-EDTA溶液作用于细胞1-3分钟。
注：用胰酶-EDTA溶液作孵育细胞的时间最短需要使贴壁细胞从培养瓶上脱落下来。
这个过程可以使用倒置显微镜监视，过度消化会破坏或杀死细胞。
3、用10ml生长培养基稀释细胞阻止胰酶作用。
转移细胞悬液到50ml离心管中。
取一小份细胞用血细胞计数器计数。
4、200 × g，10分钟，室温离心收集细胞。
吸除生长培养基。
5、用冻存培养基（见培养基和试剂的准备，不含抗生素）再悬浮细胞至1×106个/ml，然后分装细胞悬液到2ml冷冻管，1 ml/管。
6、通过逐渐降温冷冻细胞。
将小管至于泡沫盒然后将盒子放入-80℃冷冻过夜。
7、转移冻存细胞的小管到液氮中长期保存。
初级AAV溶液的制备：准备AAV-293细胞在每一个100-mm组织培养盘10 mlDMEM生长培养基中加入3×106 个AAV-293细胞，48小时后用于转染。
注：为了获得较高的滴度，AAV-293细胞的健康和传代的密度是非常重要的因素。
当细胞汇合率达到50%时须传代。
当细胞在低代并生长健康是进行大量冻存是非常重要的。
当传代和铺板用于转染时要避免细胞成团。
在用AAV质粒转染之前细胞或许会生长到较高的汇合率。
AAV-293细胞的转染：尽管大量的转染实验方案可以成功用于这些载体的转染，但是推荐使用百恩维HET高效转染试剂盒。