基因工程原理与技术--实验教学大纲

《基因工程原理与技术》实验教学大纲

课程名称：基因工程原理与技术

课程编号：0321011

课程性质：非独立设课课程属性：专业课

学时学分：总学时40，总学分2，实验学时10

应开实验学期：三年级第六学期

适应专业：生物工程、生物技术

先修课程：分子遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学等

大纲主撰人：王新卫大纲审核人：张玉龙张书松

一、实验课程简介

基因工程又称遗传工程、DNA重组技术、分子克隆等。它是上个世纪七十年代在分子生物学发展的基础上形成的新学科。所谓的基因工程，就是在分子水平上，用人工的方法提取或者合成某一生物的遗传物质，在体外切割，拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制和表达。按照人们的意愿创造生物新性状，使之稳定的遗传给下一代。所以基因工程具有广阔的应用前景，既能为工农业生产和医药保健等开拓新途径，又能为生物的细胞分化，生长发育，肿瘤发生等基础研究提供有效的实验手段。目前，基因工程实验技术已经成为生物学领域许多实验室的常用技术，也可以说是生物技术的核心技术，是生物技术专业学生必须掌握的内容。本课程通过对一些基本的基因工程实验技术的操作，使学生得到初步的锻炼，为以后从事生物工程领域的相关科研、教学及生产工作奠定基础。

二、本课程实验教学目的与基本要求

通过实验教学，使学生重点掌握质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定、目的基因的获得和重组载体的构建、感受态细胞的制备和转化及筛选鉴定、目的基因在原核细胞中表达与SDS-PAGE鉴定等技术，最终达到掌握基本实验技能和培养学生创新能力的目的。

要求学生有强烈的事业心，热爱生物技术专业、动物医学专业，理论和实践相结合，更深入的理解和掌握基因工程原理与技术。实验中要认真、仔细，爱护公共财产，并能严格遵守课堂纪律，以保证顺利完成每次实验。

四、实验方式与基本要求

实验方式：实验前要求学生预习实验内容。实验课上指导教师讲述实验的基本原理、方法及仪器的使用，并指导学生独立完成具体实验步骤，解决实验中出现问题，分析实验结果。完成实验报告。

要求：严格按操作规程、步骤进行，遵守实验室纪律。

五、考核方式与成绩评定

本课程要求学生对每次实验进行详细观察和记录，实验结束后形成完整实验资料，在此基础上撰写实验报告，作为实验考核的主要依据；同时，每次实验由指导老师对操作环节进行等级评定。最后的实验成绩按照操作成绩和报告成绩综合评分。

实验成绩占整个成绩的20%。

六、参考书目

楼士林等编著.基因工程.科学出版社.2002年第一版.

吴乃虎.基因工程原理.科学出版社.2002年第二版.

J．萨姆布鲁克等.分子克隆实验指南. 科学出版社.1993年第二版.

J.M.沃克等编，谭天伟等译.分子生物学与生物技术.化学工业出版社.2003年第一版.

七、实验内容安排

实验一、质粒DNA的提取

一、实验学时：3学时

二、实验目的：熟练掌握抽提细菌质粒DNA的一般方法。

三、实验内容：

1．实验准备：各种溶液的配制与器材处理。

2．操作步骤：

（1）菌种接种与培养。

（2）菌液离心沉淀。

（3）碱裂解法提取细菌质粒DNA。

四、实验要求：试验时安静，小心；结束后，清洗仪器，撰写实验报告。

五、实验用品与仪器：

1．器材：超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，试管架，标签纸，磁力搅拌机。

2．试剂：质粒载体菌,LB培养基，葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS 溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer （pH8.0）。

实验二、DNA的酶切、电泳鉴定

一、实验学时：3学时

二、实验目的：掌握限制性内切酶切割质粒DNA的原理与操作步骤；掌握DNA琼脂糖凝胶电泳技术；学会DNA琼脂糖凝胶电泳回收技术。

三、实验内容：

1．实验准备，溶液配制。

2．操作步骤：

（1）、取上述制备的DNA置于离心管内。

（2）、加入缓冲液，然后加入限制性内切酶，

（3）、37度进行酶切。

（4）、琼脂糖凝胶电泳鉴定。

（5）、质粒回收。

四、实验要求：

1．限制性内切酶取出后，放冰盒内操作，用完后立即把内切酶原液送回冰柜。

2．清理桌面垃圾，清洗实验仪器。

3．写出实验报告，并在每步操作之后标明该步骤常发生的问题。

五、实验用品与仪器：

1．器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，l微量离心管，恒温水浴锅。

2．试剂：质粒，EcoR I，内切酶缓冲液，电泳加样缓冲液。

实验三、目的基因的PCR扩增

一、实验学时：2学时

二、实验目的：了解PCR扩增DNA的原理，掌握PCR技术的操作步骤。

三、实验内容：

1．缓冲液配制，引物设计。

2．在反应管内加入反应试剂。

3．执行反应程序，PCR扩增。

4．PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测。

四、实验要求：

1．学会引物的设计方法，注意PCR反应的条件。

2．打扫卫生，整理实验室。

3．写出实验报告，叙述PCR反应原理。

五、实验用品与仪器：

1．器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，PCR微量管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，恒温水浴。

2．试剂： Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液，dNTP，引物，模板质粒，无菌dd water。

实验四、DNA片断的体外连接

一、实验学时：2学时

二、实验目的：熟悉DNA体外连接的原理，掌握连接的步骤。

三、实验内容：

PCR产物与载体的连接。

四、实验要求：

1．了解T4DNA连接酶的工作原理。

2．注意连接酶工作的影响因素。

3．清洁实验室，写出实验报告，分析影响连接的因素。

五、实验用品与仪器：

1．器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，微量离心管，台式离心机，干式恒温气浴等。

2．试剂：酶切载体，插入片断，T4 DNA 连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water。

实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备

一、实验学时：3学时

二、实验目的：了解CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理，掌握制备方法。

三、实验内容：

1．准备培养基。

2．接种培养。

3．感受态细胞制备。

四、实验要求：

1．注意制备时的温度要求。

2．结束后，打扫卫生，写出实验报告，并说明各不骤的要求。

五、实验用品与仪器：

1．器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，核酸蛋白分析仪，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环等。

2．试剂： E. coli DH5 ，E. coli BL21（DE3），LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌dd Water。

实验六、细菌转化与阳性重组子的鉴定

一、实验学时：2学时

二、实验目的：

1. 掌握DNA转化感受态细菌的方法。

2. 掌握PCR法筛选重组质粒技术，酶切技术对阳性重组子的坚定。

三、实验内容：

1.细菌DNA的转化。

2.抗性筛选阳性重组子的。

3.阳性重组子的鉴定。

四、实验要求：

1. 学习转化的原理。

2. 了解抗性筛选的原理。

3. 注意无菌操作技术。

4. 掌握转化的的条件。

5. 写出实验报告，简述转化与阳性重组子鉴定的基本过程。

五、实验用品与仪器：

1.器材：旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，摇菌管。

2.试剂： LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌dd water，IPTG，X-gal，PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液等。

实验七、外源基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

一、实验学时：6学时

二、实验目的：

1. 了解外源基因在原核细胞与真核细胞的表达方式。

2. 了解原核表达的基本步骤与方法。

三、实验内容：

1. 阳性重组细菌表达外源DNA。

2. 表达产物的鉴定。

四、实验要求：

1. 了解原核与真核表达的异同。

2. 了解表达条件对表达量的影响。

3. 了解产物鉴定的电泳技术。

4. 写出实验报告，简述原核表达的基本过程。

五、实验用品与仪器：

1.器材：旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱，摇菌管，台式冷冻离心机，超声波破碎仪，电磁炉，电泳仪，垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子等。

2. 试剂： LB培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌dd water，IPTG， SDS（十二烷基磺酸钠），Acr（丙烯酰胺），Bis（N,N’-亚甲基双丙烯酰胺），Tris（三羟甲基氨基甲烷），甘氨酸，盐酸，Aps（过硫酸氨），TEMED（四甲基乙二胺），蛋白分子量标准（97.4，66.2，43，31，20.1，14.4 kDa），溴酚蓝，甘油，冰醋酸，乙醇， -2-巯基乙醇，考马斯亮蓝R250，甲醇，乙醇。