7 第七章 非水相介质酶

2011 食品酶学讲义西大李全阳1第七章：非水相介质中酶的催化2011 食品酶学讲义西大李全阳27.1 概述酶作为生物催化剂，具有选择性、高效性、反应条件温和等优点，受到人们的普遍关注。

原有的研究理论认为：酶只能在水溶液中发挥其催化作用，在有机溶剂中酶蛋白容易变性失活。

然而大多数有机物质不溶于水，因此限制了酶催化反应在有机合成等有机介质中的应用和发展。

2011 食品酶学讲义西大李全阳31984年，Klibanov 等人在《Science 》上报道了酶在有机介质中的应用。

他们利用酶，在仅含微量水的有机介质中成功地合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。

他们发现，只要条件适合，酶可以在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性底物向产物的转化，酶不仅可以在水与有机溶剂互溶的体系中表现出催化活性，还可在仅含微量水或几乎无水的有机溶剂中表现出催化活性。

2011 食品酶学讲义西大李全阳4近二十多年，酶在非水介质中催化反应的研究十分活跃。

现已报道，脂肪酶、酯酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等水解酶类；过氧化物酶、过氧化氢酶、醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、多酚氧化酶、细胞色素氧化酶等氧化还原酶类和醛缩酶等转移酶类中的几十种酶在适宜的有机溶剂中均具有与水溶液中可比的催化活性。

2011 食品酶学讲义西大李全阳5与传统水相酶催化相比，非水介质中进行的酶催化反应具有下列优点：①酶催化产物不需进行萃取等后处理步骤，总产率通常更高；可以避免乳化造成的损失；使用低沸点的有机溶剂，产物回收容易。

②非极性底物溶解性增加，底物转化速率更高。

③有机溶剂“环境”不利于活细胞生存，可以降低微生物污染的风险。

这对于工业规模的反应尤其重要，因为在工业上保持无菌是一个严重的问题。

2011 食品酶学讲义西大李全阳6④亲脂性底物和／或产物引起的酶的失活和／或抑制作用可以降至最小，因为其在有机溶剂中的溶解性使得其在酶表面的局部浓度降低。

⑤许多依赖于水的副反应，如不稳定基团的水解，醌类的聚合反应，氰醇的外消旋化或酰基转移等，在有机溶剂中多数可以被抑制。

2011 食品酶学讲义西大李全阳7⑥酶即使不固定化，因为不溶于有机溶剂，反应后通过简单的过滤即可回收。

亲脂的环境可以在很大程度上阻止固定化后的酶从载体上脱落到介质中。

⑦很多与酶变性有关的反应是水解性反应，因此在低水环境中酶更加稳定。

2011 食品酶学讲义西大李全阳8⑧酶在形成酶­底物复合物时(诱导­契合)构型的改变(局部去折叠和再折叠)，导致大量氢键断裂。

在水介质中，断裂的氢键迅速被周围水形成的氢键替代。

因而，水在这里发挥了“分子润滑剂”的作用。

而在有机溶剂中没有这种“润滑”作用，酶在有机溶剂中表现出更多的“刚性”。

所以，有可能通过改变溶剂，调整某些酶的催化性质，例如底物专一性，化学键、区域和对映体选择性等。

2011 食品酶学讲义西大李全阳9⑨非水介质酶催化反应最突出的优势在于热力学平衡从水解向合成方向移动的可能性。

因而，在有机溶剂中利用水解酶类(主要是脂肪酶和蛋白酶)能够以化学­、区域­和对映体选择性的方式合成酯、聚酯、内酯、氨基化合物和肽。

非水介质中酶催化的优势使其受到广泛重视，发展很快，迄今已经初步建立起了非水酶学的理论体系，并在多肽、酯类物质、功能高分子的合成，甾体转化，手性药物的拆分等方面取得了显著成果。

2011 食品酶学讲义西大李全阳10从大量的文献报道来看，非水介质中酶催化的研究主要集中在三个方面：①非水介质中酶学基本理论研究，包括了影响非水介质中酶催化的主要因素以及非水介质中酶学性质；②通过对酶在非水介质中结构与功能的研究，阐明非水介质中酶的催化机制，建立和完善非水酶学的基本理论；③利用基本理论来指导非水介质中酶催化反应的研究和应用。

2011 食品酶学讲义西大李全阳117.2 非水介质中酶的结构传统酶学中，酶分子存在于水溶液中，除固定化酶外，酶分子是均一地溶解于水中。

酶不溶于疏水有机溶剂，它在含微量水的有机溶剂中以悬浮状态起催化作用(图8—3)。

根据热力学原理预测，球状蛋白质的构象在水溶液中是稳定的，在疏水环境中是不稳定的。

2011 食品酶学讲义西大李全阳12但是，大量实验结果表明，酶悬浮于苯、环己烷等疏水有机溶剂中不变性，而且还能表现出催化活性。

为此，许多学者对酶在水相和有机相的结构进行了比较，他们的实验证实了酶在有机相中能够保持其整体结构的完整性；有机溶剂中酶的结构，至少酶活性部位的结构，与水溶液中是相同的。

2011 食品酶学讲义西大李全阳13例如，Fitzpatrick 用0.23 nm 分辨率的x 射线衍射技术比较枯草杆菌Carlsberg 蛋白酶在水中和乙腈中的晶体结构，发现酶的三维结构在乙腈中与水中相比变化很小，这种变化甚至比在水中两次重复测定的结果变化还小，酶活性中心的氢键结构仍保持完整。

2011 食品酶学讲义西大李全阳14Yennawar 等对胰凝乳蛋白酶晶体在正己烷中的x 射线结构研究与Fitzpatrick 得到的结果基本相似，即酶在有机溶剂中蛋白质分子骨架的构象与水中相比没有明显的变化。

目前晶体结构实验证据都支持酶在有机溶剂中蛋白质能保持三维结构和活性中心的完整性。

2011 食品酶学讲义西大李全阳152011 食品酶学讲义西大李全阳16酶作为蛋白质，在水溶液中以具有一定构象的三维结构状态存在。

这种结构和构象是酶发挥催化功能必需的“紧密”而又有“柔性”的状态。

紧密状态主要取决于蛋白质分子内的氢键，溶液中水分子与蛋白质分子之间形成的氢键使蛋白质分子内氢键受到一定程度的破坏，蛋白质结构变得松散，呈一种“开启”状态。

2011 食品酶学讲义西大李全阳17北口司博认为，酶分子的“紧密”和“开启”两种状态处于一种可动的平衡中，表现出一定的柔性(图8—4)。

2011 食品酶学讲义西大李全阳18酶分子在水溶液中以其紧密的空间结构和一定的柔性发挥催化功能。

Zaks 认为，酶悬浮于含微量水(<1％)的有机溶剂中时，与蛋白质分子形成分子间氢键的水分子极少，蛋白质分子内氢键起主导作用，导致蛋白质结构变得“刚硬”，活动的自由度变小。

蛋白质分子的这种动力学刚性限制了疏水环境下蛋白质构象向热力学稳定状态转化，能维持和水溶液中相同的结构和构象，不变形而且能表现出催化活性。

2011 食品酶学讲义西大李全阳197.3 非水介质中的酶学性质酶在有机溶剂中能够保持其整体结构及活性中心结构的完整，从而发挥其催化功能。

然而，酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而影响酶的热稳定性、底物专一性、立体选择性、区域选择性和化学键选择性等酶学性质，显示出与水溶液中不同的催化特性。

2011 食品酶学讲义西大李全阳207.3.1 热稳定性许多酶在有机溶剂中热稳定性和储存稳定性比水溶液中高。

例如，猪胰脂肪酶(PPL)在苯中催化酯交换反应时，酶活性随温度升高(20～70℃)而增加，而且在70℃连续反应7次(每次96 h)后酶活力仍保持60％。

PPL 在水溶液中l00℃加热后很快失活，而在非水介质(戊醇和三丁酸甘油酯)中，l00℃加热后酶仍具有活性，其活性大小与溶剂中水含量相关。

2011 食品酶学讲义西大李全阳21在l00℃，当有机溶剂中的水含量为0.015％(W ／v)时，酶的半衰期长达12 h ；当水含量为0.8％(w ／v)时，酶的半衰期约为15 min ，见图8­5。

又如，胰凝乳蛋白酶在无水辛烷中20℃放置6个月后活力没有降低，而在同样温度下酶在水溶液中的半衰期只有几天。

2011 食品酶学讲义西大李全阳222011 食品酶学讲义西大李全阳23Klibanov 等认为，有机溶剂中酶的热稳定性比水溶液中高的原因是：有机溶剂中缺少使酶热失活的水分子，因此由水而引起的酶蛋白热失活的过程，如酶分子中天冬酰胺、谷氨酰胺的脱氨基作用，天冬氨酸肽键的水解，二硫键的破坏，半胱氨酸的氧化以及脯氨酸和甘氨酸的异构化等很难进行。

上述因素只是热稳定性高的一个原因，还有更重要的原因，即结构的刚性提高热稳定性。

2011 食品酶学讲义西大李全阳247.3.2 酶的选择性1．底物专一性底物专一性是指酶具有区分两个结构相似的不同底物的能力。

它取决于底物疏水性能的差异。

许多蛋白酶(例如，α­胰凝乳蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶)与底物的结合能力取决于氨基酸底物侧链与酶的活性中心之间的疏水作用，由于疏水底物与酶的结合能力大，因此，疏水底物比亲水底物容易反应。

2011 食品酶学讲义西大李全阳25但是在有机介质中，酶与底物的结合受到溶剂的影响而发生了某些变化，底物与酶之间的疏水作用不再那么重要了。

例如，α­胰凝乳蛋白酶催化N ­乙酰­L ­丝氨酸乙酯和N ­乙酰­L ­苯丙氨酸乙酯的水解反应时，由于苯丙氨酸的疏水性比丝氨酸强，所以，酶在水溶液中催化苯丙氨酸酯水解的速度比在同等条件下催化丝氨酸酯水解的速度高5×104倍；2011 食品酶学讲义西大李全阳26而在辛烷介质中，酶催化丝氨酸酯水解的速度却比催化苯丙氨酸酯水解的速度快20倍。

又如，在二氯甲烷中，枯草杆菌蛋白酶与N ­乙酰­L 苯丙氨酸乙酯反应的速度比作用N ­乙酰­L 丝氨酸乙酯的反应快8倍，但是在叔丁酰氨中，情况正好相反。

2011 食品酶学讲义西大李全阳272．对映体选择性酶的对映体选择性是指酶识别外消旋化合物中某种构型对映异构体的能力。

这种选择性取决于两种对映体自由能的差异。

许多试验表明，疏水性强的有机溶剂中，酶的立体选择性差，因此某些蛋白水解酶在有机溶剂中可以合成D ­氨基酸的肽，而在水溶液中，酶只选择L ­氨基酸。

Klibanov 等对有些脂肪酶也观察到类似的现象。

2011 食品酶学讲义西大李全阳28蛋白质的刚性主要是由于静电相互作用及分子内氢键的存在，因此在低介电常数的溶剂中(如二氧六环)催化的选择性要高于高介电常数的溶剂(如乙腈)中催化的选择性。

计算机模拟的结果也证实了上述实验结果。

2011 食品酶学讲义西大李全阳293．区域选择性酶在非水介质中进行催化时具有区域选择性，即酶能够选择性地优先催化底物分子中某一区域的基团。

例如，Klibanov 用猪胰脂肪酶在无水吡啶中催化各种脂肪酸(C2、C4、C8、C ，12)的三氯乙酯与单糖的酯交换反应，实现了葡萄糖1位羟基的选择性酰化。

2011 食品酶学讲义西大李全阳304．化学键选择性化学键选择性是指酶选择性地催化底物分子中不同功能基团中某个基团的反应。