第七章 有机介质中的酶反应.

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例：
当枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂（N-Ac-Tyr-NH2） 的水溶液中冻干出来后，再将抑制剂除去，该酶在辛烷中催
化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液中冻干出来的酶高
100倍，但这样处理的酶在水溶液中其活性与未处理的酶相 同。
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第二节 有机介质中酶促反应的条件


酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有 催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被 破坏，酶将变性失活。故此，酶分子需要一层 水化层，以维持其完整的空间构象－必需水 （essential water）。 有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著 影响。存在最适水含量。
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2.表征必需水作用的参数---热力学水活度

定义：在一定温度和压力下，反应体系中的水蒸汽压与
相同条件下纯水的蒸气压之比。该参数直接反应酶分子上 水分的多少，与体系中水含量及所用溶剂无关。

含义：水在体系中的固相（酶，载体），液相（含底物
的溶剂）和气相（液面上部的空间）之间进行分配，达到
平衡时各相水活度相等。
C.提高溶剂选择性的基本原则：
第一：操作温度和压力在超临界流体的临界点接近； 第二：超临界流体的化学选择和待分离溶质的化学性质 接近。
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D. SC 流体的溶解能力
超临界流体的溶解能力与其密度有很大关系，而密度 又受到体系温度或压力的明显影响，所以压力或温度的变 化，就会直接改变其溶解能力。
E.超临界流体的选定
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一．必需水
1.概念： 紧紧吸附在酶分子表 面，维持酶催化活 性所必需的最少量 水。 注意：酶的活性是由 必需水决定的，与 溶剂里的水含量无 关。
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非水介质酶催化反应的共识

微量的水对酶有效发挥催化作用是必需的，因为水间 接或直接的参与了酶天然构想中包括氢键、静电作用、 疏水作用和范德华力在内的所有非共价相互作用。 无水条件下，酶分子的带电基团和极性基团之间通过 相互作用形成一种非活性的“封闭”结构，水的加入 可以削弱这种相互作用，使非共活性的“封闭”结构 “疏松”，从而酶分子的柔韧性增加，并通过非共价 作用力来维持酶的催化活性构象，即水充当了酶分子 的“润滑剂”。


加入适量的水，能使酶活 性中心的极性和柔性提高， 从而使酶活急剧升高。 再增加含水量时，非但不 会增加酶的催化活力，反 而会引起酶活力的降低。
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原因

酶分子结构的柔性过大，酶的构象将向疏水环境下热 力学稳定的状态变化，引起酶分子结构的改变而使酶 失去活性。

水分子在活性位点之间形成水束，通过介电屏蔽的作 用，掩盖了活性部位的极性。
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（二） 酶促反应有机介质体系
（1）非极性有机溶剂酶悬浮体系(微水介质体系) 用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机 相中。但仍然含有必需的结合水以保持酶的催化活性(含水量一般 小于2%)。 酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在 固体载体表面上。 （2）与水互溶的有机溶剂水单相体系 有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都 能溶解在这种体系中。
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溶解在溶剂中的水
结合在酶分 子上的水
水活度
结合在其他 组分上的水
气相中的水蒸气
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采用水活度作为结合水量的衡量有多个优点
1 水活度的大小能直接反映出酶分子结合水的多少
2 反微量水的低水有机溶剂体系是一个涉及含酶和 载体的固相、含底物溶剂的液相和体系空间的气 相等三相系统，可用各相的水活度相等的原则方 便的表示或处理体系的平衡状态 3 可以在反应到达平衡时通过测定体系的气体湿度 比较方便的测定出水活度。
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水的介电性高，有机溶剂中少量的“必需水”能够有 效的屏蔽有机溶剂与酶蛋白表面某点之间的静电相互 作用，使酶分子构象与结晶状态一致，即与水溶液中 酶分子结构类似。 如果溶剂的极性非常强，水的介电能力不足以屏蔽溶 剂与蛋白分子之间的静电相互作用，或者溶剂的亲水 性大于酶蛋白表面的亲水性，水脱离酶蛋白而进入有 机溶剂时，酶蛋白分子的结构才会受到溶剂的影响。
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优势：利用仿水溶剂与酶形成氢键的能力，调节酶的柔性，提高酶的活力和 控制酶的选择，还可以控制由水而产生的逆反应和副反应。
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（2）分子印迹技术

原理： 竞争性抑制剂诱导酶活性中心构象发生变化，形 成一种高活性的构象形式，而此种构象形式在除 去抑制剂后，因酶在有机介质中的高度刚性而得 到保持。

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Ⅰ为对水敏感型，当体系中不加水及水活度极低时， 酶的催化活力接近于零，随着水活度的增加，酶的催 化活性急剧上升，至最大值后，随着水的加入，酶的 催化活性又逐渐下降。 Ⅱ为范围敏感型，即在很低的水活度时，酶就具有一 定的催化能力，而在最佳水活度附近，随着水活度的 变化，酶的催化活性随之发生急剧变化。 Ⅲ为水不敏感型，催化反应具有最佳水活度，但水活 度对酶的催化活性影响不显著，酶的催化活性不会随 水活度的改变而发生突跃式的变化。
8. 酶易于实现固定化。
3.能催化在水中不能进行的反 9.酶和产物易于回收。 应 4.可改变反应平衡移动方向 5.可控制底物专一性 6.可防止由水引起的副反应 10.可避免微生物污染。
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三． 有机相酶反应具备条件
1． 2． 3． 4． 保证必需水含量。 选择合适的酶及酶形式。 选择合适的溶剂及反应体系。 选择最佳pH值。
（２）化学修饰酶：
例如：SOD酶经糖脂修饰后变成脂溶性，它对温度、pH、 蛋白酶水解的稳定性均高于天然SOD。
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（３） 固定化酶： 把酶吸附在不溶性载体上（如硅胶、硅藻土、 玻璃珠等）制成固定化酶，其对抗有机介质变性的能 力、反应速度、热稳定性等都可提高。
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第一节 有机介质中的酶促反应概述

一、酶催化反应的介质 二．有机相酶反应的优点


三．有机相酶反应必备条件
四．有机相酶反应的研究进展
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一、酶催化反应的介质
水是酶促反应最常用的反应介质。
但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为 许多有机化合物(底物)在水介质中难溶或不溶。
（3）非极性有机溶剂水两相/多相体系
由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相 所组成的两相体系。
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(4) 正胶束体系 正胶束是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂， 加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。表面活性剂的极 性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂被包在液滴内部。反应时， 酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部。 反应在胶束的两相界面中进行。
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3 .干燥酶的水合过程
溶菌酶：
（1） 与酶分子表面带电基团结合达到0-0.07g/g
（水/酶） （2） 与酶分子表面的极性基团结合(0.07-0.25g/g) （3） 凝聚到酶分子表面相互作用较弱的部位 （0.25~0.38g/g） （4） 酶分子表面完全水化，被一层水分子覆盖。
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4.影响酶需水量的因素
（一）酶非水相催化的分类
1.有机介质中的酶催化
指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。 适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催 化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结 构和活性中心的空间构象，所以能够发挥其催化功能。
2.气相介质中的酶催化 酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或 者能够转化为气体的物质的酶催化反应。 由于气体介质的 密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液 中的催化作用有明显的不同特点。
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2． 仿水溶剂和印迹技术
（1） 仿水溶剂体系

原理: 酶在有机相中主要依靠必需水与酶分子间的氢键
维持活性构象，因此可用二甲基甲酰胺（DMF），乙二醇， 丙三醇等极性添加剂部分或全部替代系统中的水，以调节 酶分子的柔性，从而影响酶的活性和立体选择性。
极性添加剂对体系的影响
a. 对ห้องสมุดไป่ตู้应体系内水的分配影响 b. 与蛋白质的直接作用 c. 对产物分配的影响
22.11
4.88
临界密度 (g/cm3)
0.220
0.228
0.232
0.227
0.23 6
0.460
0.525
0.326
0.203
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B. 超临界CO2
指纯净的CO2被加热或压缩到高于其临界点（临界温度
31.1℃，临界压力7.28Mpa)时的状态。该流体具有无毒、
无臭、不燃等优点。对多数酶都能适用，且产物易于分离。
第七章 有机介质中的酶反应
Enzymatic catalysis in Non-aqueous system
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Contents of chapter 6
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第一节 有机介质中的酶促反应概述 第二节 有机介质中酶促反应的条件 第三节 有机介质对酶性质的影响 第四节 有机介质中酶促反应的应用
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由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反 应的发生。
是否存在非水介质能保证酶催化？？
1984年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反应 的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽类、 手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶体系 中进行催化反应。 4
太多的水会使酶积聚成团，导致疏水性底物较难进入 酶的活性部位，引起传质阻力。

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二. 酶的选择
1. 酶种类的选择
应具有对抗有机介质变性的潜在能力，在有机 介质中能保持其催化活性构象。
2．酶形式的选择
（1）酶粉：
例如：有人研究a-胰凝乳蛋白酶在酒精中转酯反应， 发现催化活性随反应体系中酶量的减少而显著增加。
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（2）超临界流体的有关性质
A.超临界流体的P-V-T性质
流体名称 乙烷 丙烷 丁烷 戊烷 乙烯 氨 CO2 二氧化硫 水
临界温度 （℃）
32.3
96.9
150.0
296.7
9.9
132.4
31.1
157.6
374.3
临界压力 （Mpa）
4.26
3.8
3.38
5.12
11.2 8
7.38
7.28
a 不同酶需水量不同
b. 同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同
溶剂疏水性越强，需水量越少（水在溶剂和酶
之间分配）
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不同种类的酶因为其分子结构的不同，维持酶 具有活性的构象所必需的水量也不同，即使同 一种类的酶，由于酶的来源不同，所需的水量 也显著不同。 例，在脂肪酶催化转酯反映中，根据脂肪酶对 水的敏感程度可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型。
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3.超临界介质中的酶催化
酶在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温 度和压力超过某物质超临界点的流体。
4.离子液介质中的酶催化
酶在离子液中进行的催化作用。挥发性低、稳定性好。 酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、 立体选择性、键选择性等显著特点。
离子液（ionic liquids）是由有机阳离子与有机（无机） 阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类。
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四． 有机相酶反应的研究进展
1． 超临界流体中的酶反应 2． 仿水溶剂和印迹技术
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1． 超临界流体中的酶反应
（1）概念:
指温度和压力均在本身的临界
点以上的高密度流体，具有和液体 同样的凝聚力、溶解力；然而其扩 散系数又接近于气体，是通常液体 的近百倍。
超临界流体萃取具有很高的萃 取速度。另外该流体随着温度与压 力的连续变化，对物质的萃取具有 选择性，而且萃取后分离也很容易。
(5)反胶束体系 反胶束是指在大量与水不混溶的有机溶剂中，含有少量的水 溶液，加入表面活性剂后形成油包水的微小液滴。
不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂 和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。
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二．有机相酶反应的优点
1.有利于疏水性底物的反应
2.可提高酶的稳定性
7.可扩大反应pH值的适应性。

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5.水对催化反应速度的影响

酶在有机介质中的催化活力要比在水溶液中低 在非水介质中酶的水化作用不完全，水化程 度低的酶有较高的结构刚性，酶分子内部流动 性降低导致稳定性增加，但是结构上柔韧性的 降低导致活性降低。
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水含量对酶催化速度的影响

当有机溶剂中酶含水量低 于最适水含量时，酶分子 的构象过于“刚性”而失 去催化活性
① 萃取剂需具有化学稳定性，对设备没有腐蚀性； ② 临界温度不能太低或太高，最好在室温附近或操作
温度附近； ③ 操作温度应低于被萃取溶质的分解温度或变质温度；
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④ 临界压力不能太高，可节约压缩动力费；
⑤ 选择性要好，容易得到高纯度制品；
⑥ 溶解度要高，可以减少溶剂的循环量； ⑦ 萃取剂要容易获取，价格要便宜； ⑧ 萃取剂必须对人体没有任何毒性。（在医药、食品上使 用）