双歧杆菌分离培养鉴定

1 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。

2.2 气相色谱仪配FID检测器。

2.3 冰箱：2 ℃～5 ℃。

2.4 天平：感量0.1 g。

2.5 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。

2.6 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器（200μL～1000μL）及配套吸头。

2.7 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。

2.8 显微镜

2 培养基和试剂

3.1 BS培养基

3.2 PYG培养基

3.3 TPY培养基

3.4 NPNL 培养基

3.5 X-GAL 培养基

3.6 氟化钠：化学纯。

3.7 碘乙酸钠或碘乙酸钾：化学纯。

3.8 果糖-6-磷酸盐：化学纯。

3.9 盐酸羟胺(Hydroxy Lamine-HCl)：化学纯。

3.10 三氯乙酸(TCA)：化学纯。

3.11 三氯化铁（FeCl3·6H2O）：化学纯。

3.12 甲醇:分析纯。

3.13 三氯甲烷：分析纯。

3.14 硫酸：分析纯。

3.15 冰乙酸：分析纯。

3.16 乳酸：分析纯。

3.17 乙酸标准溶液: 吸取分析纯冰乙酸5.7mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,标定,标定方法见附录B.1,此溶液浓度约为1mol/L。

3.18 乙酸标准使用液:将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。

3.19 乳酸标准溶液: 吸取分析纯乳酸8.4mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,标定,标定方法见附录B.2，此溶液浓度约为1mol/L。

3.20 乳酸标准使用液: 将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。

3 双歧杆菌的分离和培养

在无菌室内无菌称取1g双歧杆菌制剂，根据标示的活菌数量，用灭菌稀释液进行10倍梯度稀释至104-107，然后吸取0.2mL涂布于BS和NPNL琼脂平板上，放于厌氧培养箱内培养48到72小时.然后挑选菌落特征为光华、凸圆、边缘整齐、白色或乳脂色、质地柔软的中小菌落，接种于TPY琼脂平板上厌氧培养。待长出菌落后，每个平板选5个以上的特征菌落，先进行革兰氏染色，挑选具有双歧杆菌形态等特征的菌落，再进行需氧和厌氧培养，剔除需氧和厌氧都生长的菌落，选取仅厌氧培养生长的菌落，进一步在TPY琼脂平板上纯化菌株直至镜检为纯菌株。分纯后的菌株进行革兰氏染色，显微镜下观察其形态，然后进行鉴定，经鉴定是双歧杆菌的菌株在TPY液体培养基中增菌至平稳期，4℃，6000g×15min条

件下离心收集菌体分散于20%灭菌脱脂中，然后在一30一40℃条件下冻干，冻干完成后，在真空条件下压盖，-18℃贮存。

4 厌氧培养法

液体中的厌氧培养采用亨盖特厌氧培养技术(Min，1999;Chung，1997)。将配置好的培养基中加入0.01%亚甲基蓝作为氧指示剂，然后将其加热至沸腾，同时通入高纯氮气，5分钟后迅速将加热的培养基放入冷水中冷却至45℃，亚甲基蓝显示为无色则表示已经达到厌氧，迅速盖上橡胶塞，以上操作过程中均保持高纯氮气的不断通入。然后将培养基置于121℃，灭菌21分钟。

5 双歧杆菌的鉴定

（1）镜检

（2）在基础改良MRS培养基中添加X- Gal，对双歧杆菌进行检测

双歧杆菌单独表面涂布呈白色或浅兰色，标准双歧杆菌表面涂布37 ℃48 h 培养后,双歧杆菌呈白色或浅兰色,边缘整齐, 表面隆起部分显白色, 菌落背面观察呈兰色底晕, 随机挑取 5 个白色菌落经革兰氏染色涂片镜检, 该菌为革兰氏阳性,

呈各种分叉, V 形, 棍棒状, 单个, 成对, 或链状排列, 多种不规则形状, 即可基本判定为双歧杆菌。

6 形态特征

菌株在TPY固体平板上厌氧培养24小时，然后进行革兰氏染色，对其个体形态特征进行显微观察。同时把菌株接种平板上培养48小时，进行菌落形态观察。通过菌落及菌体形态可以看出:双歧杆菌菌落微小，光滑，乳白色，呈水样半透明或不透明，边缘整齐，凸起。菌体革兰氏染色呈阳性，并呈多形态性，菌体不规则，传代后，“V”字形和“Y”字形较少见。

7 生理生化检验

糖发酵试验:在无菌操净台内将双歧杆菌合适稀释度的稀释液20mL接种到各糖发酵管中， 37℃48h厌氧培养。

触酶试验:挑取固体培养基18-24h内的菌落1接种环，置于洁净玻片上，滴加3%过氧化氢溶液数滴(新鲜配制)，观察结果。

明胶液化试验:在无菌操净台内将待测菌株接种到装有明胶培养基的厌氧管中，放入37℃恒温培养箱中培养5-7天，然后置于4℃30分钟。同时准备两只未接种的厌氧管进行对照。

吲哚试验:将菌液置于37℃恒温箱中培养4天，然后在菌液中加入吲哚试剂lmL。阳性:培养物与试剂接触处产生一红色的环状物。

阴性:培养物仍为黄色。

硝酸盐还原试验:在无菌操净台内将待测菌株接种于硝酸盐还原培养基中，置于37℃恒温箱中厌氧培养，分别在3d，5d时进行检测。检测时取培养液约0.smL 于干净的试管中，先后滴入格里斯氏试剂A液、B液各2滴，如无红色出现，则加1-2滴二苯胺试剂，若出现蓝色，此菌株进行下一步检测。同时对培养液进行镜检，菌生长良好，且空白对照管加入格里斯氏试剂无红色出现时，以上检测结果有效。

淀粉试验:在无菌操净台内将双歧杆菌合适稀释度的稀释液100µL接种到淀粉固体培养基上，用L棒涂布均匀，37℃48h倒置厌氧培养。

附：

糖发酵培养基:将PY基础培养基中加入1%的各种糖，再加溴甲酚紫一滴，115℃高压灭菌。

触酶试剂:3%过氧化氢溶液(现用现配)。

明胶试剂:将15%的明胶加入PY培养基中，115℃高压灭菌。

吲哚试剂:对二甲基氨基苯甲醛 1g

95%酒精95mL

浓盐酸50mL

硝酸盐试剂:PYG培养基内加入1‰硝酸钾。

格里斯氏试剂:

A液:对氨基苯磺酸0.5g，10%稀醋酸150mL

B液:α-萘酚0.1g，蒸馏水20mL，10%稀醋酸15OmL

二苯胺试剂:对苯胺0.5g溶于IOOmL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释

淀粉试剂:在PY基础培养基中加入2%，115℃高压灭菌。