枯草芽孢杆菌ZC-7中性蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究
枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的分离纯化
武汉工商学院酶工程技术实训论文学院：环境与生物工程学院专业：生物工程年级：2014级学生：学号: 指导教师：职称：题目：枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的分离纯化2017年6月18日目录摘要 (1)关键词 (1)Abstract (1)Keywords (1)1 中性蛋白酶 (2)1.1 中性蛋白酶的来源 (2)1.2 中性蛋白酶的意义 (2)1.3 枯草芽孢杆菌 (2)1.4 枯草芽孢杆菌的产酶特征 (2)1.5 枯草芽胞杆菌的形态特征 (3)1.6 研究目的 (3)2 实验材料与方法 (3)2.1 仪器设备和耗材 (3)2.1.1 仪器 (3)2.1.2 耗材 (3)2.2 枯草芽孢杆菌的筛选 (4)2.3 粗酶液的制备 (4)2.4 酶的分离纯化 (4)2.4.1 硫酸铵饱和度的选择 (4)2.4.2 蛋白酶活力测定 (5)2.4.3 透析及层析 (5)2.4.4 蛋白酶性质的测定 (5)3 结果与分析 (6)3.1 蛋白酶活力测定 (6)3.2 透析除盐 (7)3.3 柱层析分析 (7)3.4 酶作用的最适 pH (8)3.5 金属离子对酶活的影响 (9)3.6 化学试剂对酶活的影响 (9)4 结论与讨论 (10)参考文献 (11)枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的分离纯化摘要中性蛋白酶作为一种生物催化剂已广泛用于食品、酿造、医药、纺织、制革等行业,本文对枯草芽孢杆菌的发酵产酶的提取质量条件进行了研究。
利用硫酸铵分级盐析，葡聚糖层析纯化后蛋白酶总活力为38694U，蛋白酶比活力为4960.8U/mg。
该酶的活力受到EDTA、异丙醇、乙醇抑制。
钙离子、镁离子对该酶有较好的保护作用关键词：枯草芽孢杆菌；中性蛋白酶；葡聚糖层析；分级盐析Extraction quality analysis of producing neutralprotease from Bacillus subtilisAbstractNeutral protease as a biological catalyst has widely for food, and brewing, and medicine, and textile, and leather, industry, will enzyme technology application to seafood condiment, hydrolyzed of production in the, can formed enzyme method processing of unique advantages, makes fermentation products production cycle greatly shortened, and improve protein using, for, I on Bacillus subtilis spore Bacillus (Bacillus Substilis) of fermentation produced enzyme of extraction quality conditions for has research.Keywords:Bacillus subtilis; neutral protease; Dextran chromatography;fractionation; salting out1中性蛋白酶1.1中性蛋白酶的来源蛋白酶是一类催化蛋白质肽键，生成蛋白胨、蛋白肽及氨基酸等产物的水解酶，其广泛分布于自然界的植物、动物和微生物中。
一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的纯化及酶学性质
一种枯草芽孢杆菌氨肽酶的纯化及酶学性质田亚平;须瑛敏【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2006(032)003【摘要】利用乙醇分级沉淀(37.5%～60%)、SephadexG-75凝胶过滤、Phenyl-sepharose6FF疏水色谱三步分离使一种枯草芽孢杆菌氨肽酶得到纯化,比活1.556 7×106U /mg;SDS-PAGE鉴定为纯酶,分子质量75 ku,全酶含2个亚基.纯酶最适温度60℃,温度稳定范围20～70℃.最适pH 8.5,pH稳定范围8.0～10.0.Zn2+、Ni2+有较大的抑制作用,Co2+则对酶活有较强的激活作用.酶活性中心可能结合了2个Zn2+,米氏常数Km为1μmol/L,最大反应速度Vmax为5 000μmol/(L·min).【总页数】4页(P7-10)【作者】田亚平;须瑛敏【作者单位】江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡,214036;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡,214036【正文语种】中文【中图分类】Q5【相关文献】1.枯草芽孢杆菌纳豆激酶分离纯化及酶学性质 [J], 王刚;郭明珠;陈光2.枯草芽孢杆菌醛缩酶的克隆表达、纯化、酶学性质研究及应用 [J], 高品;赵杰;韦光绪;殷志敏3.鸡氨肽酶H在大肠杆菌中的表达、纯化与部分酶学性质分析 [J], 赖庆安;刘树滔;卢菀华;陈莉;Toshihide NISHIMURA;饶平凡4.枯草芽孢杆菌WD-23 β-甘露聚糖酶的纯化及其酶学性质 [J], 张冰;向冰冰;崔岱宗;赵敏5.椰果内生枯草芽孢杆菌YZ-21产β-甘露聚糖酶的纯化及酶学性质研究 [J], 张建新;郭祥瑞;穆广亚;冯军厂;常绪路因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
枯草芽孢杆菌中性蛋白酶nprE的定向进化研究的开题报告
枯草芽孢杆菌中性蛋白酶nprE的定向进化研究的开题报告一、研究背景枯草芽孢杆菌是一种常见的产生蛋白酶的细菌，它可以在环境中广泛存在，还能在一些工业过程中被用作生物催化剂。
其中，中性蛋白酶nprE是一种重要的蛋白酶，在食品工业、纺织工业等领域具有广泛的应用。
然而，中性蛋白酶nprE的性能仍然需要进一步提高以满足实际应用需求。
因此，利用定向进化的方法对中性蛋白酶nprE进行改良研究，将具有重要的科学意义和应用前景。
二、研究目的本研究的主要目的是通过定向进化的方法改良枯草芽孢杆菌中性蛋白酶nprE的性能，使其更加适应实际应用需求。
具体目标包括：1. 基于已有的中性蛋白酶nprE序列进行设计和构建初始文库。
2. 利用定向进化的技术方案，筛选出具有更高性能的变异体。
3. 对筛选出的变异体进行表达、纯化和鉴定，评估其在食品工业和纺织工业中的应用潜力。
三、研究方法本研究将采用以下几种方法：1. 基于已有的中性蛋白酶nprE序列进行设计和构建初始文库，通过突变、插入融合等手段构建不同的变异体。
2. 对文库进行筛选，利用SDS-PAGE、Western blot等方法对突变后的酶活性和稳定性进行评估和筛选。
3. 利用PCR、TA克隆等技术将筛选出的变异体进行克隆、表达和纯化。
4. 对筛选出的变异体进行活性鉴定，比较其与野生型中性蛋白酶nprE的差异。
5. 对性能较好的变异体进行序列分析和结构预测，探究其改良机理。
四、研究意义本研究将利用定向进化的方法对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶nprE进行改良，为实际工业应用提供更加高效的蛋白酶催化剂。
这将具有以下科学意义和应用价值：1. 探究中性蛋白酶nprE的功能和作用机理，拓展其在生物催化领域中的应用潜力。
2. 创新性的利用定向进化技术，为蛋白质改造研究提供了一种新的思路和方法。
3. 为食品工业和纺织工业等领域提供更加高效的生物催化剂，具有广阔的应用前景和经济效益。
五、预期成果通过本研究，我们预期能够达到以下成果：1. 设计和构建出一系列中性蛋白酶nprE的变异体文库，筛选并鉴定出性能更佳的变异体。
枯草芽孢杆菌的分离鉴定及酶系分布的研究
88
水产科学
第 27卷
图 3 发酵过程中酶活力随时间变化趋势
3 结论
在微生物态制剂的研究过程中, 分离得到 1株 产芽孢菌, 经鉴定为枯草芽孢杆菌, 并命名为枯草 芽孢杆菌 YB1。通过摇瓶试验, 对 YB1 菌的生长及 产酶情况作了初步的考察。枯草芽孢杆菌 Y B1 在 种子培养基及发酵培养基中均能迅速进入对数生 长期, 表明此菌代谢旺盛、生命力强, 有利于高密度 发酵以降低微生态制剂生产的成 本。 YB1 菌能够 分泌淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶, 可用于鱼 虾等的饲料添加剂, 促进鱼虾生长及提高饲料利用 率; 同时, 可利用枯草芽孢杆菌分解养殖水体中过 剩饵料中的有机物, 净化水体及脱氮 [ 5 6] 。因此, 枯 草芽孢杆菌 Y B1 适合于研发微生态制剂并进一步 研究其功能和机理。
微生态制剂可以促进幼龄 动物肠道生长发育 及提高消化道酶活性已经被证实, 但对其机理研究 不多, 目前认为, 益生菌 (如芽孢杆菌 ) 能分泌多种 酶类并参与动物消化道的 酶池 , 进而提高了动物 消化酶 活 性, 并 促 进 动 物对 营 养 物 质 的 消 化 吸 收 [ 7] 。同样, 芽孢杆菌在水体净化中的作用与芽孢 杆菌能够分泌多种酶类紧密相关, 但这一相关性尚 未见报道。因此, 要进一步研究芽孢杆菌作为微生 态制剂的作用机制, 有必要对其分泌的酶系进行考 察。笔者在益生菌的研究过程中, 分离出 1株枯草 芽孢杆菌 ( B. subtilis), 并对其酶系分布进行了初步 研究, 以期为进一步深入研究提供参考。
收稿日期: 2007 - 01- 15; 修回日期: 2007 - 04- 18.
作者简介: 胡德朋 ( 1982- ) 男, 硕士研究生, 研究方向: 微生物工程, E m ai:l hudep@ 126. com. 通讯作者: 杨博 ( 1973 - ) 男, 副教授, 研究方向: 植物油酶法脱胶技术; E m ai:l yangbo@ scu t. edu. cn.
枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶的纯化及酶学性质研究
枯草芽孢杆菌弹性蛋白酶的纯化及酶学性质研究刘书亮;吴琦;詹莉;赖文【摘要】对枯草芽孢杆菌BEM01菌株发酵液中的弹性蛋白酶进行了分离纯化,并研究了酶学性质.先后采用了硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和分子筛层析等方法,弹性蛋白酶的回收率为7.88%,纯化倍数为13.79,结合SDS-PAGE和分子筛层析确定该弹性蛋白酶是一单链蛋白,分子量约为31 ku.对酶学性质的研究表明,该弹性蛋白酶属于含有Ca2+的金属蛋白酶类;其最适作用温度为50℃,具有良好的热稳定性;在硼砂.硼酸缓冲体系、Tris-HCl缓冲体系中酶最适反应pH分别为7.4和8.6,在pH 8.0～11.0酶活力趋于稳定;10 mmoL/L的Ca2+有激活和稳定酶活作用,SDS 和吐温-80也有激活酶活作用,而Li+、Na+、Zn+、K+、Ba2+、Mg2+、Mn2+和EDTA对酶活均有不同程度的抑制作用;其催化动力学方程为:y=0.186x+32.493;Vmax=0.030 8 U/mL,Km=0.005 7 g/mL.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2010(036)006【总页数】5页(P26-30)【关键词】弹性蛋白酶;枯草芽孢杆菌;纯化;酶学性质【作者】刘书亮;吴琦;詹莉;赖文【作者单位】四川农业大学食品学院,四川雅安,625014;四川农业大学生命与理学院,四川雅安,625014;四川农业大学生命与理学院,四川雅安,625014;四川农业大学食品学院,四川雅安,625014【正文语种】中文弹性蛋白酶(EC3.4.4.7,Elastase)是一种以水解不溶性弹性蛋白(elastin)为特征的蛋白水解酶[1],主要用作治疗高血脂症和防止动脉粥样硬化症。
同时,其广谱蛋白水解活性和对弹性蛋白的优先特异降解性显示其作为肉类嫩化剂具有广阔的应用前景和较高的商业价值[1-2]。
弹性蛋白酶可从动物胰脏中提取或由微生物发酵制得[3]。
枯草芽胞杆菌突变株ZC-7中性蛋白酶催化区域氨基酸突变导致其活力提高
枯草芽胞杆菌突变株ZC-7中性蛋白酶催化区域氨基酸突变导致其活力提高王建玲;赵丛;杜连祥【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2009(020)004【摘要】目的:探讨枯草芽胞杆菌突变株ZC-7高产中性蛋白酶的原因.方法:用PCR方法分别扩增突变株ZC-7与出发菌株枯草芽胞杆菌AS1.398产中性蛋白酶的编码基因,测序比较二者基因的不同;在CPHmodels Server网站进行氨基酸序列分析,模拟突变前后中性蛋白酶的二级结构.结果:对比结果显示成熟肽中有5个氨基酸位点发生突变,其中3个位于酶的催化区域内;从预测的二级结构模型上可以看到突变位点所处区域的折叠结构发生细微变化.结论:先前研究中发现枯草芽胞杆菌AS1.398和突变株ZC-7发酵液中的酶蛋白含量基本相同,因此推测高产的原因不是酶量的增加,而是突变的氨基酸使酶与底物结合的部位更加适合催化水解反应,从而提高其比活力.【总页数】4页(P526-529)【作者】王建玲;赵丛;杜连祥【作者单位】天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学,生物工程学院,天津,300457;天津科技大学,国际学院,天津,300222;天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学,生物工程学院,天津,300457【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q933【相关文献】1.定向选育氨基酸营养缺陷型苹果酒酵母突变株的研究 [J], 彭帮柱;岳田利;袁亚宏2.60Co辐射诱变姬松茸突变株J3的氨基酸分析与比较研究 [J], 江枝和;翁伯琦;黄挺俊;林勇;肖淑霞3.临床分离2型登革病毒突变株E蛋白N端158氨基酸基序免疫原性初探 [J], 李佳怡;商正玲;左丽4.棘孢小单孢菌耐受无机磷突变株129—P1产生的新的氨基酸苷抗生… [J], 郑榕;杜建国5.60Co辐射诱变姬松茸突变株J3子实体不同部位的氨基酸分析研究 [J], 黄挺俊;翁伯琦;肖淑霞;王义祥;江枝和因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
枯草芽孢杆菌SH7抑菌蛋白的分离纯化及对烟草青枯病菌的抑制作用
中国烟草科学 2010，31（1）：13-15 13枯草芽孢杆菌SH7抑菌蛋白的分离纯化及对烟草青枯病菌的抑制作用张秀玉，孔凡玉*，王静，张成省，李佰乐(国家烟草专卖局烟草病虫害监测与综合治理重点开放实验室，中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101)摘 要：采用硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析及聚丙烯凝胶电泳，从枯草芽孢杆菌SH7代谢物中分离纯化出一种相对分子质量为33.6 kD的蛋白，该活性物质具有淀粉酶活力，对烟草青枯病菌具有一定的抑制作用。
关键词：枯草芽孢杆菌；抑菌蛋白；纯化；拮抗作用中图分类号：S435.72 文章编号：1007-5119(2010)01-0013-03 DOI: 10.3969/j.issn.1007-5119.2010.01.004Isolation, Purification and Antagonism of Extracellular Proteinfrom Bacillus subtilis Strain SH7ZHANG Xiuyu, KONG Fanyu*, WANG Jing, ZHANG Chengsheng, LI Baile (Key Laboratory of Tobacco Pest Monitoring & Integrated Management, State Tobacco Monopoly Bureau, Tobacco ResearchInstitute of CAAS, Qingdao 266101, China)Abstract:Bacillus subtilis strain SH7 showed antagonism against Ralstonia solanacearum.One of the protein was purified by using ammonium sulfate precipitation followed by DEAE Sepharose Fast Flow chromatography and Sephadex G-75. The molecular mass of the protein was 33.6 kD by PAGE analysis. The active protein from Bacillus subtilis strain SH7 have diastatic activity. Keywords:Bacillus subtilis; protein; purification; antagonism activity枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为植物病害主要生防细菌之一，广泛分布于自然界中，因其是对人畜无害、不污染环境的非致病细菌，备受各国研究工作者的青睐。
枯草杆菌芽孢皮层裂解酶的分离纯化以及酶学结构分析
枯草杆菌芽孢皮层裂解酶的分离纯化以及酶学结构分析曾朝玮;孙静;马慧娇;郭家俊;郭洪伟;章中【摘要】本文采用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶过滤的方法对皮层裂解酶粗酶液进行分离纯化.结果表明:当硫酸铵的饱和度为60％时,大部分皮层裂解酶被聚集沉淀下来,总蛋白及皮层裂解酶活力较高,酶的比活力为158.22 U/mg,回收率为84.17％,进一步经SP-sephadex C-25离子交换层析法纯化后该酶的比活力为218.31 U/mg,回收率为68.43％,最后使用Superdex 75凝胶过滤进行分离纯化,得到了电泳纯的皮层裂解酶,并且酶的比活力为1690.75 U/mg,回收率为19.45％.纯度为粗酶液的14.98倍,纯化出的皮层裂解酶分子量为61.1 kDa.运用傅里叶光谱(FTIR)对枯草杆菌芽孢皮层裂解酶酶学结构分析,枯草杆菌皮层裂解酶在3415、1665、1080、528 cm-1波数处均有吸收峰,其中在1665 cm-处有明显的酰胺Ⅰ带,应用二阶导数和曲线拟合的方法研究枯草杆菌芽孢皮层裂解酶的二级结构,发现枯草杆菌皮层裂解酶中含12.80％的α-螺旋、31.56％的β-折叠、44.97％的β-转角、以及10.68％的无规卷曲.本文为研究HPTS杀灭芽孢的机理提供了实验材料.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2019(040)009【总页数】7页(P160-165,223)【关键词】枯草芽孢杆菌;芽孢;皮层裂解酶;分离纯化;二级结构【作者】曾朝玮;孙静;马慧娇;郭家俊;郭洪伟;章中【作者单位】宁夏大学农学院,宁夏银川750021;宁夏大学农学院,宁夏银川750021;宁夏大学农学院,宁夏银川750021;宁夏大学农学院,宁夏银川750021;宁夏大学农学院,宁夏银川750021;宁夏大学农学院,宁夏银川750021【正文语种】中文【中图分类】TS201.3芽孢是某些细菌在生长发育到一定阶段后,在其细胞内形成一个圆形或椭圆形的休眠体,对杀菌处理具有极端抗性,是引起食品安全问题和食品腐败的原因之一[1-5]。
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２ ． １ ． ２ 脱盐浓缩 超滤过程中用 ０ ． ５ ｍ ｏ ｌ ／ ｍ ｌ 的Ｂ ａ Ｃ ｌ ２
２－ 溶液检 测 滤 出 液 中 是 否 含 有 Ｓ Ｏ 以滤出液滴入 ４ ，
１ ． ７ 米氏常数（ Ｋｍ） 和最大反应速度（ Ｖ ） 的测定 ｍａ ｘ
３ ０
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
Ｖ ｏ ｌ ． ２ ７Ｎ ｏ ． １ ０２ ０ ０ ７
２ ． １ ． ４ Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｄ ｅ ｘＧ ７ ５分子筛层析 由洗脱曲线（ 图 ? ３ ） 可知， 经Ｄ Ｅ Ａ Ｅ Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅＦ ａ ｓ ｔ Ｆ ｌ ｏ ｗ离子交换后获得 ? ｅ ｐ ｈ ａ ｄ ｅ ｘＧ ７ ５凝胶过滤后分成两个组 的活性组分经 Ｓ ?
１ ４ ］ 定［ 。蛋白酶活力定义为： ｌ ｍ ｌ 液体酶， ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ， ｐ Ｈ ７ ． ５的磷酸缓冲 液稀释 成 不 同 浓 度， 然后与酶液 ４ ０ ℃反应 １ ０ ｍ ｉ ｎ ， 用 Ｆ ｏ ｌ ｉ ｎ 法测定活力。根据 ｌ ｉ ｎ ｅｗ ｅ ａ ｖ ｅ ｒ Ｂ ｕ ｒ ｋ法计算出 Ｋ ? ｍ 及Ｖ 的值。 ｍ ａ ｘ
关键词 枯草芽孢杆菌 中性蛋白酶 纯化 性质
中图分类号 Ｑ ８ １ ４ １ 中性蛋白酶是最早发现并广泛应用于工业化生产 Ｈ条件下将大分子蛋白质迅 的蛋白酶制剂， 能在中性 ｐ 速水解成肽类和部分游离氨基酸。作为一种生物催化 剂， 该酶催化反应速度较快， 无工业污染， 且反应条件 适应性宽， 被广泛地应用于皮革脱毛、 饮品澄清、 洗涤
１ ， ２ ］ 剂、 化妆品以及医药治疗等行业和领域 ［ 。 １ ０ ］ １ １ ］ １ ２ ］ 近几年， 邓靖等 ［ ， 何胜华等 ［ ， 肖怀秋等 ［ 分
别对米曲霉以及某些芽孢杆菌所产中性蛋白酶的提取 及酶学特性进行了研究， 表明同属中性蛋白酶， 适用范 围却并不相同。本试验选取了合适的纯化方法从枯草 Ｃ ７的发酵液中提纯了该酶， 并对其酶学性 芽孢杆菌 Ｚ ? 质进行了研究， 为该酶基因工程改造提供基础。
国内外对微生物蛋白酶的分离纯化进行了广泛的研
３ ］ 究， Ｂ ａ ｙ ｌ ｉ ｓ ｓ 等［ 对 发 酵 液 进 行 浓 缩 加 热， 通 过 透 析、
１ 材料与方法
１ ． １ Ｚ Ｃ ７中性蛋白酶发酵液 ? 菌株 Ｚ Ｃ ７为枯草芽孢杆菌 Ａ Ｓ １ ． ３ ９ ８经 Ｎ＋离子注 ? 入后的突变株。 １ ． ２ 有关试剂 中空纤维膜购自天津膜天膜工程技术有限公司， 蛋白质分子量标准购自上海生物工程有限公司， 其余 试剂均为国产分析纯或化学纯。 １ ． ３ 中性蛋白酶的分离纯化 １ ． ３ ． １ 盐 析 取 ４ ２小时发酵液在 ４ ℃下 ８ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 离心 １ ０ ｍ ｉ ｎ ， 收集上清液， 分成 １ ５份， 每份 ５ ０ ｍ ｌ ， 加硫酸 ０ ％、 ２ ５ ％、 ３ ０ ％、 ３ ５ ％、 ４ ０ ％、 ４ ５ ％、 ５ ０ ％、 铵分 别 至 ２ ５ ５ ％、 ６ ０ ％、 ６ ５ ％、 ７ ０ ％、 ７ ５ ％、 ８ ０ ％、 ８ ５ ％、 ９ ０ ％ 饱和度， ４ ℃静置过夜， ８ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ离心 １ ０ ｍ ｉ ｎ ， 蛋白沉淀溶于适 量０ ． １ ％的醋酸钙缓冲液（ 含２ ０ ％ 异丙醇） 中， 分别测 定沉淀和上清的酶活， 绘制硫酸铵盐析曲线。
２ 实验结果
２ ． １ Ｚ Ｃ ７中性蛋白酶的分离纯化 ? ２ ． １ ． １ 硫酸铵盐析 当硫酸铵饱和度小于 ３ ０ ％ 时， 沉 淀中酶活力很低， 上清液中酶活力几乎不变。沉淀量 随硫酸铵饱和度的增加而增加， 其酶活力也随之增加， 当硫酸铵饱和度达到 ７ ０ ％时， 沉淀量基本不再增加， 其 酶 活 力 接 近 最 高 值。根 据 图 １盐 析 沉 淀 曲 线， 采用 ３ ０ ％饱和度硫酸铵沉淀去除杂蛋白， 然后对上清液补 加硫酸铵至 ７ ０ ％饱和度沉淀目的蛋白。
Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｄ ｅ ｘ Ｇ １ ０ ０ 提纯酶液， 但活力回收率不高。Ｙ ａ ｓ ｕ ｎ ｏ ｂ ｕ ?
４ ］ 等［ 对枯草杆菌中性蛋白酶采用 Ｄ Ｅ Ａ Ｅ 纤维素和 Ｃ Ｍ? ? ［ ５ ］ 纤维 素 二 次 层 析 进 行 了 纯 化， ８ ０ 年 代， Ｂ ｅ ｒ ｔ ｕ ｓ ， ［ ６ ］ ７ ］ Ｔ ｅ ｔ ｓ ｕ ｏ ，Ａ ｋ ｉ ｒ ａ 等［ 研 究 了 Ｂ ａ ｃ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓｓ ｕ ｂ ｔ ｉ ｌ ｉ ｓ和
分， 通过酶活检测， 第二洗脱峰为活性组分， 第一洗脱 峰没有活性。 活性组分洗脱峰峰形基本对称， 基线接近零， 可与另 Ｅ Ａ Ｅ Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅＦ ａ ｓ ｔ 外一种蛋白组分分开， 表明用其对 Ｄ ? Ｆ ｌ ｏ ｗ离子交换后样品进行最后的分离纯化， 效果很好。 ２ ． ２ 酶的纯化回收 通过对 Ｚ Ｃ ７中性蛋白酶提纯工艺各纯化步骤指 ? ） 。Ｚ Ｃ ７中性蛋白酶纯度最终提高 标的跟踪测定（ 表２ ? 了７ ７ ． ５倍， 回收率为 ２ ７ ． ７ ％。粗酶液经纯化后， 得到 分子量约为 ４ ２ ｋ Ｄ ａ 的单一电泳条带（ 图４ ） ， 目的蛋白 纯度大于 ９ ０ ％。
２ ０ ０ ７ ， ２ ７ （ １ ０ ）
赵 丛 等：枯草芽孢杆菌 Ｚ Ｃ－ ７中性蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究
２ ９
１ ． ３ ． ２ 脱盐浓缩 将盐析沉淀溶解于缓冲液中， 用截 流分子量为 １ ０ ｋ Ｄ ａ ～ ２ ０ ｋ Ｄ ａ 的中空纤维膜超滤， 对样品 ａ Ｃ ｌ 以滤出液 进行脱盐浓缩， 除盐效果用 Ｂ ２ 溶液检测， ａ Ｃ ｌ 滴入 Ｂ ２ 溶液中无沉淀析出为终点。 １ ． ３ ． ３ Ｄ Ｅ Ａ Ｅ Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅＦ ａ ｓ ｔ Ｆ ｌ ｏ ｗ （ ２ ． ４ ｃ ｍ× ３ ０ ｃ ｍ ） 离 ? ． １ ％ 的醋酸钙缓冲液（ 含２ ０ ％ 异丙 子交换层析 用 ０ 醇） 平衡层析柱， 将脱盐后的活性组分用同样的缓冲液 ８ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 离心 １ ０ ｍ ｉ ｎ ， 上样（ ２ ｍ ｌ ） 后用同样的缓 溶解， 冲液先洗脱未吸附的蛋白， 再用含 ０～ １ ｍ ｏ ｌ ／ ＬＮ ａ Ｃ ｌ 的 该缓冲液梯度洗脱， 分步收集， 测定 Ａ ２ ８ ０ ｎ ｍ 吸光值和 酶活力。 １ ． ３ ． ４ Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｄ ｅ ｘＧ ７ ５ （ １ ． ６ ｃ ｍ× ８ ０ ｃ ｍ ） 凝胶层析 离 ? ． １ ５ ｍ ｏ ｌ ／ ＬＮ ａ Ｃ ｌ的 子交换 得 到 的 活 性 组 分 先 用 含 ０ ０ ． １ ％的醋酸钙缓冲液 （ 含２ ０ ％ 异 丙 醇） 平 衡， 样品 ８ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ 离心 １ ０ ｍ ｉ ｎ ， 上样 （ １ ｍ ｌ ） 后用相同的缓冲液 ． ５ ｍ ｌ ／ ｍ ｉ ｎ 的速度洗脱， 每管收集 ２ ． ０ ｍ ｌ ， 紫外检测器 以０ 在线检测 Ａ ２ ８ ０ ｎ ｍ ， 收集活性峰。 １ ． ４ 总蛋白测定 总蛋白测定参见文献［ １ ３ ］ 。 １ ． ５ 酶活力测定 按 部 颁 行 业 标 准 Ｑ Ｂ １ ８ ０ ５ ． ３ ９ ３ ， 采用 Ｆ ｏ ｌ ｉ ｎ法 测 ?
图２ Ｚ Ｃ ７中性蛋白酶 Ｄ Ｅ Ａ Ｅ? Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅＦ ａ ｓ ｔ Ｆ ｌ ｏ ｗ ? 离子交换层析洗脱曲线 Ｆ ｉ ｇ ． ２ Ｉ ｏ ｎｅ ｘ ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｅｃ ｈ ｒ ｏ ｍａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙｏ ｎ Ｄ Ｅ Ａ Ｅ Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅＦ ａ ｓ ｔ Ｆ ｌ ｏ ｗｏ ｆ Ｚ Ｃ ７ｎ ｅ ｕ ｔ ｒ ａ ｌ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｓ ｅ ? ?
％） 活力回收（ ６ ３ ． ７
中空纤维膜超滤
３ ０ ０ ０
２ ２ ９ ． ６
３ ０ ０
１ ４ ６ ． ３
１ ０
２ ． １ ． ３ Ｄ Ｅ Ａ Ｅ Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅＦ ａ ｓ ｔ Ｆ ｌ ｏ ｗ 柱层析 从层析洗 ? 脱曲线（ 图２ ） 可知， 开始先用 ０ ． １ ％ 的醋酸钙缓冲液（ 含 ２ ０ ％异丙醇） 洗脱， 至少有两种蛋白组分被洗脱下来， 然后 用含 ０ ～ １ ｍ ｏ ｌ ／ ＬＮ ａ Ｃ ｌ 进行梯度洗脱， 在此期间又有两种蛋 白被洗脱下来。通过酶活检测， 第三洗脱峰为活性组分， 其它洗脱峰均没有活性。 Ｚ Ｃ ７中性蛋白 酶 被 Ｄ Ｅ Ａ Ｅ ? ? Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅ Ｆ ａ ｓ ｔ Ｆ ｌ ｏ ｗ离子交换色谱介质吸附， 从而与不带电 荷的至少两种杂蛋白彻底分离， 且目标蛋白活性组分峰与 ２ ８ ０ ｎ ｍ蛋白质吸收峰完全重合， 而且峰型比较对称， 基线接 近为 ０ ， 说明这时目标蛋白已经达到了较高的纯度。
摘要 枯草芽孢杆菌 Ｚ Ｃ ７的发酵液， 经离心分离得到粗酶液， 再经硫酸铵盐析、 中空纤维膜除盐 ? Ｄ Ｅ Ａ Ｅ Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅ Ｆ ａ ｓ ｔ Ｆ ｌ ｏ ｗ离子交换层析、 Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｄ ｅ ｘ Ｇ ７ ５柱层析等步骤获得电泳纯的中性蛋 浓缩、 ? ?
－ ３ 白酶。Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ测得其分子量大约为 ４ ２ ｋ Ｄ ａ 。以酪蛋白为底物时， 该酶的 Ｋ ｍ 为 ５× １ ０ ， Ｖ ? ｍ ａ ｘ ４ 为２ ． ５× １ ０ ｇ ／ ｍ ｉ ｎ ， 酶的最适作用 ｐ Ｈ为 ７ ． ０ ， 最适反应温度为 ５ ５ ℃， 在ｐ Ｈ ６ ． ５～ ８ ． ０ ， ４ ０ ℃以下较 μ ２ ＋ ２ ＋ 稳定， 对１ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ｈ ２ Ｏ ２具有一定的耐受性。Ｅ Ｄ Ｔ Ａ 、 异丙醇和乙醇对该酶有抑制作用， Ｃ ａ 、 Ｍ ｇ 和 ｉ ＋ Ｌ 离子对其具有保护作用。
图１ 中性蛋白酶盐析曲线 Ｆ ｉ ｇ ． １ Ｓ ａ ｌ ｔ ｉ ｎ ｇｏ ｕ ｔ ｃ ｕ ｒ ｖ ｅｏ ｆ ｔ ｈ ｅＺ Ｃ ７ｎ ｅ ｕ ｔ ｒ ａ ｌ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ａ ｓ ｅ ?