安全选择标记和无选择标记转基因技术研究进展(定稿)

3.1.2 Homologous Recombination（同源重组）应用实例
成功地应用于动物和微生物，植物上尚处于探索阶段。
三、 MFTPS获得途径
3.1.3 Site-specific Recombination System（位点特异性重组）
该方法利用重组酶催化2个短的特定DNA序列间的重组，将 位于这两个短DNA序列中间的选择标记基因筛除，获得无选择 标记转基因植物。已发现的位点特异性重组系统包括Cre/loxp 、FLP/FRT、R/RS和Gin/gix、attp等5种。 Cre/loxP系统是目前位点特异性重组系统中研究较多的一种， 其原理是将标记基因构建于2个同向重复的lox位点(34 bp)之间，将 目的基因构建于lox位点之外。在获得转基因植株后,再诱导植株体 内Cre基因的表达，将位于lox位点之间的选择标记基因切除。 （王贺伟等，2013）
Luo等开发的基于该系统的“基因删除(GM-Gene-Deletor)”技术 （2007），以高效的外源基因删除效率成功应用于烟草、玉米(Zea mays)和油菜(Brassica，napus)等经济植物。
三、 MFTPS获得途径
3.1.4 Transposes Mediated Reorientation（转座子系统）
二、安全筛选标记技术
2.2 基于负向选择的安全标记基因
利用来源于植物的基因（如菠菜BADH基因）作为选择标记基因
，该基因所编码的甜菜碱脱氢酶将有毒的甜菜碱醛转化为无毒的 甜菜碱。
2.3 基于可视化选择的安全标记基因
维多利亚水母中分离出的绿色荧光蛋白(GFP)
二、安全筛选标记技术
2.4 该技术的优缺点：
三、MFTPS获得途径
3.1.3 Site-specific Recombination System（Cre/loxP）
三、MFTPS获得途径
3.1.3 Site-specific Recombination System 应用实例：
Andrew等以pART27为骨架构建了一个ART54-PCre-1去标记系统， 其中pART54载体TDNA中含一个uidA报告基因，一个nptII选择标记基 因和一个指示删除反映的负标记基因codA，PCre载体是一个含有Cre基 因和hpt基因的双元载体。
R/RS是从酵母中获得另外一种位点特异性重组系统。重组酶基因切除 与之相邻位于重组位点RS之间的DNA片段。将选择标记基因位于RS 之间，而目的基因位于RS区域外。 sugit等报道了两步法转化烟草，MAT载体中R重组酶由来源于玉米的 化学诱导启动子谷肤甘肤-s-转移酶(GST-n-27)启动，转基因植株培养 添加外源除草剂的解毒剂SafenerR29148即可激活，R重组酶的将筛选 标记iPt切除，从而高效获得无筛选标记的转基因植物(图3)。经过二次 筛选，获得大量的单拷贝、无筛选标记且表型正常的植株。
安全选择标记和无选择标记 转基因技术研究进展
The Advances in Research of the Transgenic Plants with Safe or No Selection Markers
小组成员：窦富强、鄢苗、张哲、张作林 指导老师：张椿雨 教授
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引言
转基因植物的形成过程（以Bt抗虫棉为例）：
三、 MFTPS获得途径
3.1.3 Site-specific Recombination System（Cre/loxP）
三、 MFTPS获得途径
3.1.3 Site-specific Recombination System（Cre/loxP）
Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆 的过程，可以分成三种情况：
三、MFTPS获得途径
3.1.1 Co-transformation（共转化）
农 杆 菌 介 导
三、MFTPS获得途径
3.1.1 Co-transformation（共转化）
无标记基因
三、 MFTPS获得途径
3.1.1 Co-transformation
无标记基因
三、 MFTPS获得途径
3.1.1 Co-transformation（共转化）应用实例
the isopentenyl transferase (ipt)
gene
三、MFTPS 获得途径
3.1 Excise a marker gene(标记基因移除)
技术流程：
利用通常的选择标记筛选出初级转基因植株，然后利用转基因植株 后代遗传重组使选择标记与目的基因分离，或利用位点特异性酶将标记 基因切除而培育无选择标记的转基因植株。
三、 MFTPS获得途径
3.1.5 Multi-auto-transformation (MAT)载体系统
该方法将选 择标记基因同位 点特异重组R/RS 体系或玉米的转 座元件进行整合 ，利用特异性重 组或转座将转化 细胞中的标记基 因剔除。
三、MFTPS获得途径
3.1.5 Multi-auto-transformation (MAT)载体系统应用
目前对烟草、拟南芥、水稻、玉米、油菜、大豆、小麦等都已成功。
不适于马铃薯、甘蔗等无性繁殖植物，不适于多年生植物。
三、 MFTPS获得途径
3.1.2 Homologous Recombination（同源重组）
同源重组发生在DNA的同源序列之间，只要两条DNA序列相 同或相近，重组就可以在此序列中的任何一点发生。
（2）影响转化细胞再生 （3）影响多重转化
二、安全筛选标记技术
2.1 基因正向选择（Positive Selection）的安全标记基因 （1）与激素生物合成有关的基因 异戊烯基转移酶基因ipt和吲哚-3-乙酰胺水解酶基因IaaH。 （2）与糖类代谢有关的基因 与糖类代谢有关的基因主要包括甘露糖磷酸异构酶基因pmi，木糖异构酶 基因xylA和核糖醇操纵子rtl。 （3）与氨基酸代谢有关的基因 主要有D-氨基酸氧化酶(DAAO)和天冬氨酸激酶(AK)等。 细菌的ak基因对赖氨酸和苏氨酸并不敏感。
三、MFTPS 获得途径
无标记转基因植物 （Marker-free Transgenic Plants，MFTPS）
First approach：
Second approach：
excise or segregate
a marker gene from a target gene
overexpression of
在这个过程中，为了提高 对转化细胞的筛选效率，我们 不可避免地引入了 Marker Gene ，如图中的抗生素基因。
引言
（一）转基因技术的发展及意义
改良遗传性状
（二）转基因技术的现状
标记基因转化后仍留在植物体，植物及环境 安全性能否能到保障？ 为此，科学家们提出了无标记转基因作物 （Marker-Free Transgenic Plants，MFTPs）的概念。
标记移除技术： co-transformation(共转化) homologous recombination（同源重组) site-specific recombination system(位点特异性重组系统) transposes mediated reorientation(转座子介导的再定位系统) multi-auto-transformation vector(MAT载体系统) tissue specific expression(组织特异性表达）
通过转座酶的转座作用实现基 因重组，转座子由自主成员和非自 主成员两部分组成，如玉米的 Ac/Ds系统，其自主成员Ac基因编 码转座酶用于自身和非自主成员Ds 基因的转座。非自主成员是由自主 成员缺失了某些序列后所形成的， 不具备合成转座酶的能力。非自主 成员两端有数百个核苷酸是必需的 ，中间可换成或插入较大的外源基 因，而插入外源基因的非自主成员 仍能同自主成员一起被转座酶转移 。把标记基因置于整个转座子的外 部，目的基因将设于非自主成员内 部，转化后植物可通过转座作用将 二者分离，最后分离出无标记的转 基因后代。
三、MFTPS获得途径
3.1.6 Tissue Specific Expression（组织特异性） 利用一个能在时间或空间上起控制作用的组织特 异性表达的启动子（如G10-90、AoPRLl、AFP启动子 等）调控选择标记基因在转化位点的表达，即使选择 标记基因只在早期筛选时表达，而在转基因植株生长 过程中不表达，也可能在成熟植株中获得不表达选择 标记基因的转化体。 在食用植物上有重要的应用价值，例如定向删除 果实、菜叶等食用器官中的标记基因，以降低对人体 健康的影响。
三、MFTPS获得途径
3.2 Marker-free Mransformation(无标记转化）的转化技术
左键儒等发现在拟南芥中可利用化学调控(chemical-inducible),DNA位 点切除(site-specific DNA excision system)调控 Cre/loxP 载体DNA 重组 系统。重组酶的表达受雌激素载体融合XVE反式激活因子严格控制。 被感应到的ß -雌二醇，可标记编码序列，Cre和两个loxP端夹住的XVE 从拟南芥的基因组移除。
三、 MFTPS获得途径
3.1.2 Homபைடு நூலகம்logous Recombination（同源重组）
用选择标记进行筛选并获得转基因植株后，再重新导入一段序 列，使标记基因置于2个DNA同源序列之间，通过染色体内重组将含有 选择标记的DNA片段去除，获得MFTPS。
基 因 打 靶
三、 MFTPS获得途径
ipt 基因 优点：高水平有利于转化植物的再生，提高转化率。 缺点：ipt的低水平表达会导致植物表型的反常变化，如植物出现 茎不伸长，侧根难以形成等一系列不正常的发育现象； GFP基因 优点：能够对转化细胞进行可视化观察，方法灵活，范围广泛，检 测快捷，使用方便。 缺点：野生型GFP发光较弱，荧光反应也不是酶反应，且不能通过 添加某些物质来加强信号,更不易对荧光进行定量检测。另外，GFP基因 在植物细胞内的表达频率并不高，甚至在某些植物细胞中并不表达。