Illumina-Eco荧光定量PCR解析
荧光定量PCR实验原理及数据分析
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SYBR Green I 染料法－－优缺点 优 点
使用方便，不必设计 复杂探针 具有价格优势
缺 点
无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低
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Taqman 探针法－－原理
• • • •
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SYBR Green I 染料法－－问题点与关键点
• 问题点：
– SYBR Green I 与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应 体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将同时被检测， 从而可能导致检测结果不准确。
• 关键点：
– 设计合适引物，防止非特异性扩增！
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
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Taqman 探针法－－工作机理
•
拷贝数的计算：
– 待测样本浓度（ng/ul）=OD260×40×稀释倍数 – 样本分子量=碱基数×324 – 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
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绝对定量实验例－－乙肝病人血液中HBV的绝对定量
• • 方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103；2个重复；设阴性 空白对照 • 实验步骤：提取HBV DNA；
病原体检测，疾病耐药基因研究, 药物疗效考核 遗传疾病的诊断 特定基因分析 SNP分析
分子信标
高特异性 荧光 背景低
Eco实时荧光定量PCR
热力学系统
控温元件 温度均一性 温控范围 平均升温速率 样品板 样品体积 反应时间
·专利的中空银槽和半导体 ·± 0.1℃，实际温度均一性 < 0.05℃ ·35–100℃ ·5.5℃ / 秒 ·48孔板 ·5–20μl ·用标准的定量试剂，40循环少于40分钟 ·只读熔解曲线，HRM 功能约4分钟
5个合成的基因变异型：GG,CC,TT,AA和一个 核苷酸的缺失，每个样品4个重复
Eco定量PCR仪软件界面-实验类型选择
实验设置简单直观，设置样品性质 （标准品，阴性对照，未知样品）等
反应条件设置为图形界面，温度，时间一目了然， 反应进程均在界面上显示
产品参数
仪器规格 性能 尺寸/重量
电源参数
·检测灵敏度可低至1 拷贝 ·动力学范围 > 9 logs；区分5,000 和 10,000模板拷贝，具有99%置信度 ·盖子关闭：W×D×H: 13.6 in × 12.2 in × 12.6 in ·盖子打开：W×D×H: 13.6 in × 12.2 in × 14.5 in ·重量：13.6 kg (30 lbs) ·电压：120–240 VAC = 10%；频率: 50/60 Hz = 1% ·标准电流：8A ·峰值功率：500W；标准功率：180W
的染料，均无需额外的校正 ·ROX 支持，可选用
软件
许可证 支持应用
支持数据分析
界面 数据格式
·无，网上免费升级 ·基因表达 ·基因分型 ·高分辨率熔解曲线 ·绝对定量 ·ΔΔCq 法相对定量，支持多内参基因和PCR效率校正 ·等位基因分型 ·高分辨率熔解曲线分析 ·向导式界面，样品布局和反应条件编辑简单、直观，并且常用的应用都有内置
Eco loading dock Eco plates
荧光定量pcr技术原理
荧光定量pcr技术原理荧光定量PCR技术（qPCR）是一种广泛应用于遗传学、病毒学、生物学以及医学等领域的分子生物学技术。
qPCR技术不仅能够准确快速地定量检测DNA模板，还可以检测RNA模板和蛋白质模板。
下面，将对qPCR技术的原理和步骤进行详细解释。
qPCR技术可以快速、精确地检测DNA，RNA和蛋白质等生物分子，其基本原理是通过PCR扩增反应，将DNA等靶分子浓缩，使其达到检测的限度。
同时，通过加入荧光标记的探针或引物，可以精确地记录反应的进程。
PCR反应完成后，荧光信号的变化可以直接反映出DNA分子的变化情况，进而得出浓度的定量结果。
qPCR反应主要包含两个步骤：PCR扩增基因片段和荧光信号检测。
PCR扩增基因片段的过程与普通PCR相同，但是在反应体系中加入荧光标记的探针或引物，所以荧光定量PCR反应的结果不仅表明结果是否出现，还可以定量检测出靶基因的数量。
因此，qPCR技术经常用于测定遗传性状、基因表达水平、微生物的定量，等等。
qPCR技术的优点主要体现在检测精度和灵敏度方面。
相对于传统的PCR技术，qPCR技术具有更高的检测灵敏度和更高的重复性，并且可以在较短的时间内处理大量样本；同时，qPCR技术可以在未开放区间（如DNA合成反应合成DNA的时候）检测反应的进程，这大大提高了实验的灵活性和可操作性。
2. 荧光定量PCR技术步骤（1）实验设计。
实验设计是qPCR技术的第一步，必须选择适当的引物和探针设计。
引物和探针的设计通常使用在线工具进行设计，二者均需具有较高的特异性，对非靶标序列不产生杂交效应，并且需要对目标序列具有较高的亲和性，以获得较好的扩增效果和检测结果。
（2）qPCR反应。
qPCR反应可以在各种qPCR仪器中进行。
在反应中，将提取的DNA或RNA按照设计好的引物和探针进行PCR扩增。
反应条件会因引物和探针的选择而有所不同。
反应结束后，qPCR仪器可以自动记录荧光信号变化，并计算扩增产物的数量，从而得出样品中目标序列的浓度。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
illumina测序原理
illumina测序原理illumina测序是一种分子生物技术，是人类基因组测序领域最常用的序列技术。
Illumina测序可以帮助研究人员对物种基因组进行微观上的分析，以了解物种遗传和表型的变化，以及为药物开发和临床诊断提供技术支持。
本文将介绍illumina测序的原理、技术方法以及用于探索疾病的应用。
illumina测序的原理illumina测序以能够自动分辨双链DNA的激光荧光技术为基础。
它是一种借助微孔板的半结构化的、多芯片的平台，可以同时对多条双链DNA进行高通量测序。
其基本原理是，在介质中悬浮的DNA片段会在illumina仪器上被电场热像(piezo-electric heating)做成微型沉积，然后由四种激光激发激光（excitation laser）、发射激光（emission laser）、紫外线激光（UV laser）、紫外线破坏激光（UV destruction laser）对每个沉积的微粒进行精确的检测。
illumina测序的技术方法illumina测序通常由四个步骤组成：DNA片段制备、多聚合酶链反应(PCR)、样品分配和测序读取。
1、DNA片段制备：这一步是首先利用核酸在体外产生固定大小的DNA片段，然后加入抑制剂阻止PCR反应，最后将数据存储在微孔板中。
2、多聚合酶链反应(PCR)：多聚合酶链反应(PCR)使得每个DNA 片段可以得到大量的复制，以便illumina仪器可以测试它们。
3、样品分配：在这个步骤中，借助芯片的能力，illumina测序仪可以将样品放置在固定的位置上，并精确地控制它们的移动速度和沉积位置，以实现多个样品的定位和分配。
4、测序读取：这是最后一步，也是最重要的步骤，即对每一个沉积的DNA片段序列进行精确的测序，以获得每一条双链DNA的完整序列。
illumina测序用于疾病探索illumina测序不仅应用于普通的基因组测序，还可以用于探索疾病机制，鉴定敏感性突变，并检测基因组结构变异。
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量pcr实验原理与应用荧光定量PCR（qPCR）是一种高灵敏度、高特异性的DNA扩增技术，通过检测PCR反应体系中的荧光信号实时监测DNA的合成量。
这种技术结合了传统PCR的高效性和荧光探针的高度特异性，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因定量、基因型鉴定等领域。
一、原理荧光定量PCR利用荧光信号与PCR产物数量呈正比的原理，通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化来确定反应体系中模板DNA的初始量。
在PCR反应中，荧光探针与特定的DNA序列结合，并发出荧光信号。
随着PCR反应的进行，产物数量逐渐增加，荧光信号也随之增加。
通过检测荧光信号的增长曲线，可以确定初始模板DNA的数量。
二、应用1.基因表达分析：荧光定量PCR可用于实时监测基因的表达水平，通过检测靶基因的mRNA量来研究基因在不同条件下的表达情况。
2.病原体检测：荧光定量PCR可用于快速准确地检测病原体的存在，如病毒、细菌等，对临床诊断和疾病监测具有重要意义。
3.基因定量：荧光定量PCR可用于定量分析基因拷贝数、基因表达水平等，对基因功能研究和疾病诊断有重要作用。
4.基因型鉴定：荧光定量PCR可用于检测基因型多态性，如单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失等，用于遗传学研究和个体鉴定。
三、优势与传统PCR技术相比，荧光定量PCR具有以下优势：1.高灵敏度：荧光信号与PCR产物数量呈正比，可实现低拷贝数DNA的检测。
2.高特异性：荧光探针设计精准，可准确识别靶基因序列，避免非特异性扩增。
3.实时监测：可实时监测PCR反应过程中的荧光信号，得到实时、准确的反应动态信息。
4.高准确性：荧光定量PCR结果稳定可靠，可用于定量分析和比较研究。
荧光定量PCR作为一种高效、高灵敏的DNA定量技术，在生命科学研究、临床诊断、食品安全监测等领域具有广泛应用前景。
随着技术的不断发展和完善，荧光定量PCR将在更多领域发挥重要作用，为科学研究和临床实践提供强有力的支持。
IlluminaEco荧光定量PCR讲课文档
Plate Layout
第16页，共38页。
Standard Curve
第17页，共38页。
Relative Quantification
用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列 表达的相对变化。校正样本可以是一个未经处理的对照或者 是在一个过程研究中处于零时的样本。
DEL
TT
AA
Genotyping 5 distinct clusters observed
第29页，共38页。
产品优势
开放的平台：支持实时PCR的全部应用，包括最具挑战性的高分辨熔解（HRM
）曲线分析
性能卓越：灵敏的精密控制的光学技术；精准的温度控制技术和极佳的温度 均一性；Cq值重复性高，数据准确性高，
仪器20分钟左右开启，预热。 配制PCR体系时，加样一定要准确 加每个样品一定要更换枪头，防止交叉污染 样品板上的膜一定要封好 样品上机之前一定要离心，避免气泡影响实验结果
第26页，共38页。
问题……?
谢谢！
第27页，共38页。
厂家简介
Illumina公司是一家集开发，制造及销售用于分析遗传变异 和生物功能的综合系统的高科技公司。1998年成立，2005 年进入中国，并以惊人的速度不断发展，于2007和2009年 两次入选福布斯杂志评出的美国年度成长速度最快的高科技 公司，同时亚太地区也是Illumina全球增长最快的区域。
，通过饱和的插入染料监控DNA熔解曲线变化而进行分析的一种技术。
扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。只要一个碱基发生了突变， 就会改变DNA链的解链温度。HRM可以区分单碱基差异。
HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，无需使用序列特异性探针，具有高灵 敏度、操作简单、高通量、成本低等优点
二代测序技术-illumina测序原理 -回复
二代测序技术-illumina测序原理-回复二代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）是一种高通量、高效率的DNA测序技术，它革命性地改变了基因组学的研究方式。
其中，illumina测序技术是目前应用最为广泛的二代测序技术之一。
本文将以"illumina测序原理"为主题，详细介绍illumina测序技术的原理和相关步骤。
首先，介绍一下illumina测序技术的基本原理。
Illumina测序技术主要是依托于DNA链延伸和合成特性，利用偶联反应（ligation）和桥式PCR （bridge PCR）进行高效的DNA扩增，并通过荧光信号的记录来反应DNA碱基的顺序。
具体而言，illumina测序原理基于以下几个步骤：1. DNA片段准备：首先，需要将待测DNA样本进行处理。
通常，DNA 样本会被打断成短片段，这些片段的长度可以根据具体实验的需求进行调整。
2. 适配体的连接：接下来，需要将适配体连接到DNA片段的两端。
适配体是一段带有特定序列的DNA，它的作用是为PCR反应和测序提供起始位点。
3. 桥式PCR扩增：连接完适配体后，DNA片段被固定在一个玻璃芯片上。
在芯片上，每个片段的两端都会连成一条桥状结构。
接下来，进行PCR 扩增反应。
PCR反应中使用的引物能够帮助完成DNA合成，从而使得DNA片段在桥状结构上进行扩增。
4. 单碱基的加入：桥式PCR反应产生的DNA片段将被转录成RNA，然后再通过逆转录成DNA。
这一过程中，每个DNA链上的荧光核苷酸被加入到模板链上，形成一个新的DNA链。
每种不同的荧光标记代表一个特定的DNA碱基。
5. 荧光信号的检测：在illumina测序仪中，会通过激光的照射和荧光信号的检测来记录每个位置上的DNA碱基。
由于每个位置上只加入一种荧光标记的碱基，可以通过特定的滤光片来分辨不同的荧光信号。
6. 数据分析：最后，通过计算机算法对测序得到的数据进行分析和处理，得到DNA序列的信息。
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Plate Layout
RQ vs sample
HRM
高分辨率熔解（High Resolution Melting，HRM）分析技术是基于核 酸的物理性质，通过饱和的插入染料监控DNA熔解曲线变化而进行分 析的一种技术。 扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。只要一个碱基发生了突 变，就会改变DNA链的解链温度。HRM可以区分单碱基差异。
实验注意事项
仪器20分钟左右开启，预热。
配制PCR体系时，加样一定要准确 加每个样品一定要更换枪头，防止交叉污染
样品板上的膜一定要封好
样品上机之前一定要离心，避免气泡影响实验结果
问题……?
谢谢！
厂家简介
Illumina公司是一家集开发，制造及销售用于分析遗传变 异和生物功能的综合系统的高科技公司。1998年成立， 2005年进入中国，并以惊人的速度不断发展，于2007和 2009年两次入选福布斯杂志评出的美国年度成长速度最快 的高科技公司，同时亚太地区也是Illumina全球增长最快 的区域。 2010年Illumina并购Helixes公司。
该设计从根本上消除了热不均一性和边缘效应 精准的温度控制和卓越的温度均一性提高了数据质量和实验重复性
创新技术
光学系统--光路
CCD Array
Two sets of 48 high-power fixed LEDs for excitation
Series of four band pass filters (upgradeable to 5)
操作软件
Quantitation High Resolution Melting
GG CC
DEL TT AA
14 series of 2 fold serial dilution B-Actin Fam labeled Taqman probe chemistry
Genotyping 5 distinct clusters observed
Absolute Quantification
用于分析某未知样本中个某一核酸分子的绝对量值， 即通常所说的拷贝数。
应用：
病原微生物或病毒含量的检测 转基因动植物转基因拷贝数的检测 RNAi基因失活率的检测
Plate Layout
Standard Curve
Relative Quantification
HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，无需使用序列特异性探 针，具有高灵敏度、操作简单、高通量、成本低等优点 HRM应用主要基于两种技术的进步：
பைடு நூலகம்
具有精确控温装置和高密度数据采集的仪器（解链温度差异极小，零点几摄氏度， 使用高分辨率的仪器才可以检测） 双链DNA嵌入型饱和荧光染料如LC Green
用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中 同一序列表达的相对变化。校正样本可以是一个未经 处理的对照或者是在一个过程研究中处于零时的样本。 应用： 比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如 药物处理、物理处理、化学处理等 ) 特定基因在不同时间的表达差异 cDNA芯片或差显结果的确证
产品简介
Eco 结构
仪器状态指示灯 固定的光学系统 安全的热盖 高性能反应模块 安全门锁 安静的通风系统
32 cm
34.5 cm 32 cm
体积：32×34.5×32 cm；重量：约16 Kg
创新技术
马达 搅拌浆
精准的控温系统 导热元件是一个中空银槽，中空 银槽是密闭的，内含一种特殊液 体导热介质。在PCR循环过程中， 液体导热介质通过两个反方向搅 拌装置驱动，在中空银槽中快速 流动，使热量从半导体均匀传递 到整个银槽。
BeadXpress
Accuracy, versatility and flexibility for molecular testing
Eco
Gold-standard qPCR made accessible
内
容
产品简介 创新技术 操作界面 应用
产品简介
Eco实时荧光定量PCR系统由1975年诺贝尔生理学和医学奖获得者 David Baltimore博士和世界著名光子与微细加工专家Axel Scherer 博士共同研发
Any Sequencing project within reach
Genome Analyzer IIx
Most widely adopted NGS platform
HiScanSQ
Unique combination of sequencing and arrays
HiScan
Speed, quality and versatility for arrays
HRM
原始曲线 随着DNA熔解，Sybr Green被释放，荧光 信号骤降
分 析 过 程
HRM
导出图 “速率”曲线的最高 峰是分离速率最大的 点，即等于熔解温度
HRM
应用： 突变发现/筛查/扫描 SNP 基因分型/等位基因区分 物种鉴定 表观遗传学/DNA甲基化 微卫星分析
Genotyping
Eco™ Real-Time PCR System
基因有限公司
张振华
厂家简介
Illumina的产品服务
新一代测序技术平台 基因芯片技术平台
Sequencing
实时PCR技术平台
qPCR
Arrays
HiSeq2000
Redefining the trajectory of sequencing
HiSeq1000
产品优势
开放的平台：支持实时PCR的全部应用，包括最具挑战性的高分辨熔 解（HRM）曲线分析 性能卓越：灵敏的精密控制的光学技术；精准的温度控制技术和极佳 的温度均一性；Cq值重复性高，数据准确性高， 4色荧光检测：同类产品荧光通道最多 标准化：出厂时已对SYBR、FAM、HEX、VIC、ROX和 Cy5等荧光染料进 行校正，遵循MIQE指导原则 软件：以图标驱动的软件界面，实验设计和设置简单，简洁明了的操 作流程只需3个步骤 通量：48孔反应板，满足绝大多数用户的需求 微量：5~20μl 反应体系，节约成本 快速：40个循环＜40分钟 小型：结构紧凑、体型小巧，适合个人使用 便宜：同类产品价格最低
48 Blue array
48 Green array
创新技术
光学系统--控制过程
Eco 独特的校准优化数据质量
操作软件
独特的图标驱动用户界面，大大简化了实验设计和设置
操作软件
简捷的样品类型设置
操作软件
直观的循环界面
应用
1. 绝对定量分析 2.相对定量分析--基因表达差异分析 3.HRM分析 4.基因分型