荧光定量PCR实验数据分析
荧光定量pcr结果分析
如果有标准曲线,按照标准曲线计算。
一般都就是相对量。
则用deltaｄｅlｔａCT方法来计算。
举例如下:ﻫ对照组基因A得CT值为２０, 内参(比如βactiｎ)CT值15。
实验组基因A CＴ值１８,内参CＴ值１4。
ﻫ首先算加样量:ｄｅlｔa ＣT＝15-14=1。
２得1次方就是２、也就就是说实验组得加样量就是对照组得2倍、ﻫ基因A: ｄeｌｔａＣT＝2０—1８=2。
2得2次方就是４、也就就是说基因A得量在实验组就是对照组得4倍。
但就是由于加样量就是2倍,所以４处以2＝2,最后得相对量就是2倍、
ﻫ几点注意:ﻫ１。
必须确定扩增得特异性
２、只有相同目标得CT值才能相减(扩增效率有可能不同)
3。
2得某次方只就是理论值,实际扩增效率低于２、ﻫ4。
最好不用Syber Green
由Cｔ值用2＾—△△Ｃｔ法计算计算表达量差异得原理,可以瞧下面得图片:
ﻫ
ﻫ附件得Exｃel文件就是计算用得,感兴趣也可以瞧瞧由Ct值就是如何一步一步算出2^-△△Ct 得。
荧光定量PCR实验数据分析
荧光定量PCR实验数据分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction）是一种基于PCR技术的实验方法，用于定量检测特定DNA序列的丰度。
荧光定量PCR是一种非常重要的分子生物学技术，在基因表达分析、疾病诊断等领域得到广泛应用。
在进行荧光定量PCR实验后，需要对实验数据进行分析，以获取样品中目标DNA序列的丰度信息。
本文将介绍荧光定量PCR实验数据分析的基本步骤和常见方法。
首先，荧光定量PCR数据的分析通常包括以下几个步骤：1.荧光PCR数据的获取：荧光定量PCR实验过程中，荧光信号会被记录下来。
对于每个样品，会获得一条荧光曲线，曲线上的荧光信号强度与PCR循环次数（Ct值）有关。
2. 荧光曲线的阈值设置：荧光曲线上的信号强度在实验的早期循环中较低，随着PCR循环的进行逐渐增加，直至达到一个稳定的平台。
阈值（threshold）是在这个平台上设置的一个信号强度的固定值，用于确定Ct值。
常用的阈值设置方法包括固定阈值法和导数阈值法。
3.Ct值的计算：Ct值是荧光定量PCR实验中的一个重要指标，表示荧光信号达到阈值的循环次数。
在荧光曲线上，Ct值可以通过与阈值的交点来确定。
Ct值越小，表示目标DNA序列的丰度越高。
4.样品之间的Ct值比较：荧光定量PCR实验中，通常需要同时检测一些内部参考基因（如GAPDH）作为对照，以便进行样品之间的Ct值比较。
内部参考基因应在不同样品中表达稳定，其Ct值应接近。
通过对目标基因的Ct值与内部参考基因的Ct值进行比较，可以计算出样品中目标DNA序列的相对丰度。
5.目标DNA序列的绝对丰度计算：通过构建标准曲线，可以将目标DNA序列的相对丰度转化为绝对丰度。
标准曲线是通过在实验中使用一系列已知浓度的目标DNA序列标准品进行绘制的。
通过测量标准品的Ct值并绘制荧光信号与目标DNA序列浓度的关系曲线，可以通过比较样品的Ct值与标准曲线来计算目标DNA序列的绝对丰度。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
荧光定量PCR数据分析
利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量METHODS 25, 402–408 (2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitati ve PCR and the 2－△△CT MethodKenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen¶,1*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ¶ Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。
绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。
2－△△CT方法是实时定量P CR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。
本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。
另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。
关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。
实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。
实时定量PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。
绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。
实时荧光定量PCR的数据分析方法
实时荧光定量PCR的数据分析方法
作者：易健明， 屈武斌， 张成岗， YI Jian-Ming， QU Wu-Bin， ZHANG Cheng-Gang
作者单位：易健明,张成岗,YI Jian-Ming,ZHANG Cheng-Gang(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知与心理卫生研究中心,北京100850;安徽医科大学研究生院,安徽合肥230032)
， 屈武斌,QU Wu-Bin(军事医学科学院放射与辐射医学研究所,蛋白质组学国家重点实验室,全军军事认知
与心理卫生研究中心,北京100850)
刊名：
生物技术通讯
英文刊名：Letters in Biotechnology
年，卷(期)：2015,26(1)
引用本文格式：易健明.屈武斌.张成岗.YI Jian-Ming.QU Wu-Bin.ZHANG Cheng-Gang实时荧光定量PCR的数据分析方法[期刊论文]-生物技术通讯 2015(1)。
实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告
A
25
为什么要做定性测定？
用于未知患者的确认 用于血液筛检 突变检测
A
26
定量和定性测定的结果报告
定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测定则 是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的 确认诊断。
定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范 围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告 >多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围， 则报告<多少，如<103拷贝数/ml，而不能报告为0拷 贝数/ml或阴性。
1/log2=-3.32
如果扩增效率为0.5（100%），则斜率A =1/log1.5=-5.68
A
21
纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝 数时的数学模型
此种计算模式下，斜率 A必≤-3.32。
截距B则为原始模板趋 向于0亦阴性标本检测的 Ct 值，因此，一个实时 荧光PCR，如果设定的 扩增循环数为40，则其 截距B即应≥40。
A
12
实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
在实时荧光PCR 中，每个模板的 Ct值与该模板的 起始拷贝数的对 数存在线性关系， 起始拷贝数越多， Ct值越小。
A
13
实时荧光PCR外标绝对定量的数 学模型
利用已知起始拷贝 数的外部标准品可 做出标准曲线，在 现有实时荧光PCR 中，大部分以纵坐 标为Ct值，横坐标 为起始拷贝数，少 部分以纵坐标为起 始拷贝数，横坐标 为Ct值。
A
5
基本概念
Ct值（threshold cycle）或CP值（crossing point） Ct或CP值指的是实时监测扩增过程的 荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。主要 的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧 光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值 时的循环数则为阈值循环数（Ct）。有实验证 明Ct值与样本中的原始拷贝数成正比关系。Ct 值是当前实时荧光PCR的主要定量参数。
实时荧光定量PCR数据分析及常见问题分析
使用高质量的试剂和仪器
高质量的试剂和仪器是实时荧光定量PCR实验的基础，包括 高质量的DNA聚合酶、高灵敏度的荧光探针、可靠的定量 PCR仪等。
选择经过认证的试剂和仪器，并按照说明书正确使用和维护 ，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
优化PCR反应条件
优化PCR反应条件可以显著提高实验 的重复性和准确性，包括调整模板浓 度、引物浓度、循环数等参数。
通过梯度PCR或条件优化实验，可以 找到最佳的反应条件，使扩增曲线更 符合标准曲线的要求。
严格控制实验操作规范
实验操作规范是保证实时荧光定量PCR数据质量的重要环节，包括实验前的准备 、样本处理、加样、扩增和检测等步骤。
基线漂移
01
总结词
基线漂移是指PCR扩增曲线在起始阶段出现非特异性扩增，导致背景信
号过高。
02
详细描述
基线漂移可能是由于模板污染、酶活性降低或反应条件不适等原因引起
的。高背景信号会掩盖特异性扩增信号，导致检测结果不准确。
03
解决方案
在实验过程中，要严格控制操作环境，避免交叉污染。同时，要定期检
查酶活性，确保其处于最佳状态。此外，可以通过软件对扩增曲线进行
03 实时荧光定量PCR常见问 题分析
扩增效率不一致
总结词
扩增效率不一致会导致数据无法准确反映样本中目标基因 的表达水平。
详细描述
扩增效率不一致通常是由于反应条件、引物设计或试剂质量等 问题导致的。这会导致不同样本间的相对表达量出现偏差，从 而影响实验结果的准确性。
解决方案
在实验过程中，要确保反应条件的一致性，包括温度、时间、 循环数等。同时，要选择质量可靠、设计合理的引物和试剂， 并进行预实验以确定最佳的反应条件。
荧光定量PCR实验及数据分析
14
常用荧光定量标记方法
• 非特异性荧光标记 • SYBR Green I
• 特异性荧光标记 • TaqMan Probe
15
SYBR Green I 染料法－－原理
• SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有 绿色激发波长的染料。
SYBR Green I
12
荧光定量PCR原理－－荧光定量反应性的确认
• 线性关系、扩增效率确认
– 相关系数（R2）：大于0.98 – 标准曲线斜率：-3 － -3.5 – PCR扩增效率（E）：0.9-1.2
• 检测灵敏度确认
– 35Cycles内可得到好的定量结果 – 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增
34
绝对定量质粒标准品的制备
目的基因
基因组DNA PCR
目的基因
目的基因克隆
目的基因 目的基因
质粒
质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用
35
质粒标准品稀释方法与拷贝数计算
• 倍比梯度稀释方法：
– 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii – 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii – 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv – 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
22
Taqman 探针法－－工作机理
探针
热变性
引物
报告基团
R
淬灭基团
引物和探针与模板退火
DNA聚合酶
R
探针
延伸反应
R
R
23
Taqman 探针法－－PCR体系的建立
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在样品制备过程中，加入已知的阴性样品（或水），并将提取物作为模板 加入反应体系，参与整个实验过程。
目的：监控整个实验操作过程中是否存在污染。
16
故障排除时提供有用信息的软件界面17ຫໍສະໝຸດ 原始荧光组分曲线-v2.0
18
扩增曲线-v2.0
19
标准曲线-v2.0
20
原始多通道荧光信号-v2.0
手动设置在“指数扩增期”，避开前期的背景荧光波动与后期 的非指数扩增及阴性对照最高点。
对于绝对定量实验，阈值线设定在使得标准曲线的决定系数值 （R2）接近1，斜率接近-3.32的地方。
对于无标准曲线的实验，阈值线设定在使得重复样品Ct值差异 最小的位置。
阈值线设定在保障灵敏度均为最佳的位置
9
3
AB荧光定量PCR仪家族
第一、二代 7700 5700
第三、四代 7000 7900
第五代
第六代
7300 7500 stepone /plus
第七代 ViiA 7
4
最新型 QuantStudio
荧光定量PCR实验数据分析
5
荧光PCR实验结果的分析流程
查验扩增曲线 检查 NTC 检查 阳性对照 检查阴性对照 检查 / 调整基线 检查 / 调整阈值 分析 样品数据
6
基线与阈值线的设置
一般情况下选择软件默认的“自动设置”； 特殊情况下或必要时，可以手动设置； 手动设置的原则请查询“Data Analysis on the ABI PRISM® 7700 Sequence Detection
System: Setting Baselines and Thresholds: Guide: Rev A ”，文件号： 4370923 。
浓度增加1倍，CT值减小1个单位 浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位
12
荧光定量PCR实验常见问题
13
病原体核酸检测效果的主要影响因素
导致巨大差别的因素
导致一般差别的因素
样品采集和储运 采样部位、保存液、冻融
样品量
核酸抽提 交叉污染、抑制剂、病毒裂解 样品量、回收率
核酸定量检测
引物、探针设计/合成质量 核酸的纯度和完整性 预混液的质量
10 X2
X1
CT2-CT1
K
CT 2-CT 1klgX X12
当扩增效率为100时，K=-3.32，
当扩增效率为100时，K=-3.32，
若C T相差1，则两个样品的浓度差异为： 两个样品的浓度差异为10倍，则C T 差异为：
10 X2
X1
1
3.320.5
C T-2C T 13.3 2 lg 10 3.32
26
如何判断它们是真正的扩增？ • 同时也具有特征性的三个增长阶段。
27
是什么原因造成平台期很低? • 可能是目标模板的浓度太低。
− 通常如果模板的起始浓度太低, 反应体系会形成大量的引物二 聚体。
− 大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲 线的平台期很低。
28
案例2:是否存在扩增？
14
仪器、循环条件
导致异常实验数据的常见原因:
实验污染 反应试剂质量问题 未正确密封而导致的试剂蒸发 错误的荧光染料设置 错误的反应程序设置 使用错误的耗材 荧光污染 仪器硬件问题
15
两种容易混淆的阴性对照
• 无模板的阴性对照
在反应体系中不加入核酸模板，而以水为替代的对照 目的：监控配制反应体系的试剂是否存在污染。
?
29
如何判断它们是否存在扩增？ • 首先，和同一反应中的其他扩增曲线相比，这些曲线的形状
不相同。
30
如何判断它们是否存在扩增？ • 同时，这些曲线都没有明显的指数增长期。
21
原始多通道荧光信号-v2.0
22
质控报告-V2.0
23
理想的实验结果
可疑的扩增曲线
案例1:是否存在扩增？ • 一些形状和正常的扩增曲线有区别的曲线，该如何判断呢？
正常的扩增曲线
平台期很低
25
如何判断它们是真正的扩增？ • 这些曲线都有典型的指数增长期，而且和其他的曲线平行（虽
然比较短）。
10
绝对定量实验效果的评估
11
CT值差与模板量差的关系
CT = k lg X0 + b
CT2— CT1= （k lg X02 + b） —（k lg X01 + b） CT2— CT1= k (lg X02 — lg X01 )
CT2— CT1= k lg (X02 /X01 )
lg (X02 /X01 )= (CT2— CT1)/k
7
基线的设定
系统背景信号，在扣除背景过程中影响扩增信号的数值，最终影响Ct值。 默认自动分析，比如设定在“3-15”个循环。 手动设置时要避开前期的荧光波动与后期的扩增信号。 必要时可以独立设定制定样品的基线取值范围（V2.0）。
8
阈值线的设定
默认设定为同类扩增基线信号标准差的10倍，反映扩增信号具 有统计学显著的意义。不同扩增子应当独立设定阈值线。
实验结果的考评指标
定性实验：
•是否为显著的“S型”扩增曲线 •扩增曲线的“高度”----表示体现扩增性能的“强度” •阳性对照的Ct值是否在“预期”的位置 ： 过早——污染或加样错误 过晚——存在抑制剂或扩增体系条件不佳 •阴性对照是否报告Ct值 污染、探针特异性差、阈值线设定过低
绝对定量实验：
•标准曲线的斜率或扩增效率 •标准曲线的决定系数值：R2 •检测样品是否偏离标准曲线 •重复样品Ct值的标准差
荧光定量PCR实验数据分 析与常见问题解决
技术支持 黄志
内容
• Life Technologies 公司定量PCR仪产品概览 • 荧光定量PCR实验数据分析 • 荧光定量PCR实验常见问题的解决
2
AB荧光定量PCR仪的发展历史
1995 世界上第一台定量PCR仪--7700型诞生 1997 推出面向医疗系统用户的5700型定量PCR仪 2000 推出7900型384孔定量PCR仪 2001 推出7900型96孔定量PCR仪 2001 推出7000型96孔定量PCR仪 2004 获得定量PCR仪专利－确立AB在业界内的领先地位 2004 第5代定量PCR仪7300\7500型诞生 2007 第6代定量PCR仪StepOne和StepOne Plus问世 2010 第7代定量PCR仪ViiA 7发布 2011 最新荧光定量PCR仪 QuantStudio 12K Flex 发布