荧光定量PCR实验设计及结果分析
荧光定量pcr结果分析
如果有标准曲线,按照标准曲线计算。
一般都就是相对量。
则用deltaｄｅlｔａCT方法来计算。
举例如下:ﻫ对照组基因A得CT值为２０, 内参(比如βactiｎ)CT值15。
实验组基因A CＴ值１８,内参CＴ值１4。
ﻫ首先算加样量:ｄｅlｔa ＣT＝15-14=1。
２得1次方就是２、也就就是说实验组得加样量就是对照组得2倍、ﻫ基因A: ｄeｌｔａＣT＝2０—1８=2。
2得2次方就是４、也就就是说基因A得量在实验组就是对照组得4倍。
但就是由于加样量就是2倍,所以４处以2＝2,最后得相对量就是2倍、
ﻫ几点注意:ﻫ１。
必须确定扩增得特异性
２、只有相同目标得CT值才能相减(扩增效率有可能不同)
3。
2得某次方只就是理论值,实际扩增效率低于２、ﻫ4。
最好不用Syber Green
由Cｔ值用2＾—△△Ｃｔ法计算计算表达量差异得原理,可以瞧下面得图片:
ﻫ
ﻫ附件得Exｃel文件就是计算用得,感兴趣也可以瞧瞧由Ct值就是如何一步一步算出2^-△△Ct 得。
荧光定量PCR技术
03
结果重复性差
可能原因包括实验操作不规范、仪器 故障等。解决方案包括规范实验操作 、定期维护和校准仪器等。
05
荧光定量PCR技术在生物医学 研究中的应用
基因表达水平检测
绝对定量
通过标准曲线对未知模板进行定量分析，确 定基因的表达量。
相对定量
比较不同样本间基因表达的差异，常用于研究基因 在不同组织、不同发育阶段或不同处理条件下的表 达模式。
光信号的特性，实现对PCR产物的实时监测。
02
第二代荧光定量PCR技术
引入了特异性更高的荧光探针（如TaqMan探针），提高了检测的准确
性和特异性。
03
第三代荧光定量PCR技术
在第二代技术的基础上，进一步改进了荧光探针的设计，引入了多种荧
光基团和猝灭基团，实现了多重荧光定量PCR检测。
应用领域及意义
研究微生物与环境因素的相互作用
荧光定量PCR技术可用于研究微生物与环境因素（如温度、pH值、营养物质等）的相互 作用，揭示微生物在环境中的适应机制和生态功能。
食品安全领域应用
检测食品中的病原微生物
荧光定量PCR技术可用于快速、灵敏地检测食品中的病原微生物，如沙门氏菌、大肠杆菌等，保 障食品安全。
评估食品中的转基因成分
重复性原则
设计合理的实验重复和对照，以验证结果的 稳定性和可靠性。
定量准确性原则
选择合适的荧光定量方法和标准曲线，确保 目标序列的准确定量。
样品准备与DNA提取方法
样品准备
收集待测样品，如组织、细 胞、血液等，并进行适当的 处理，如研磨、裂解等，以
释放DNA。
DNA提取方法
根据样品类型和实验需求选 择合适的DNA提取方法，如 酚氯仿抽提法、试剂盒法等 ，以获得高质量的DNA模板
荧光测定pcr实验报告
荧光测定pcr实验报告引言聚合酶链反应（PCR）是一种常用的分子生物学技术，可以在短时间内扩增DNA 目标序列。
PCR扩增过程中，荧光标记的探针可以用来监测DNA模板的定量。
本实验旨在通过荧光测定PCR的方法，对指定DNA序列进行定量分析。
实验设计与方法实验设计1. 收集样本：收集待测DNA样本。
2. 准备试剂：准备PCR反应体系所需的试剂，包括PCR缓冲液、dNTPs、引物、荧光标记的探针等。
3. 试剂配置：按照实验设计，配置合适浓度的试剂稀释液。
4. PCR反应：根据实验设计，进行PCR反应，在PCR仪中设置加热曲线。
5. 荧光测定：在PCR反应过程中，通过荧光实时监测相应信号。
实验方法1. 收集样本：收集待测DNA样本，保证样本的纯度和完整性。
2. 准备PCR反应体系：按照实验设计，配置PCR反应体系，包括PCR缓冲液、dNTPs、引物、荧光标记的探针等，保证试剂的浓度和质量。
3. 试剂配置：根据实验设计，配置合适浓度的试剂稀释液，保证试剂的稳定性和反应效果。
4. PCR反应：将待测DNA样本和试剂混合，在PCR管中进行适当的温度变化，进行PCR反应。
PCR反应的参数包括初始变性、循环变性、退火、延伸等步骤。
5. 荧光测定：在PCR反应过程中，监测PCR反应产生的荧光信号。
通过荧光实时监测，可以定量分析PCR扩增的产物。
结果与分析荧光测定PCR结果在本实验中，通过荧光测定PCR的方法成功扩增了目标DNA序列。
在PCR反应过程中，实时监测到荧光信号的增强，表明DNA扩增的过程正常进行。
荧光信号定量分析结果通过荧光信号的实时监测，可以进行PCR扩增产物的定量分析。
扩增产物的荧光信号强度与初始模板DNA的浓度成正比，因此可以通过荧光信号的强度来估计初始模板的浓度。
数据处理与统计分析对实验得到的数据进行处理和统计分析，可以得到PCR扩增产物的浓度。
通过与标准曲线的比较，可以确定PCR产物的浓度。
结论本实验成功使用荧光测定PCR的方法扩增了目标DNA序列，并进行了定量分析。
荧光定量PCR实验数据分析
荧光定量PCR实验数据分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction）是一种基于PCR技术的实验方法，用于定量检测特定DNA序列的丰度。
荧光定量PCR是一种非常重要的分子生物学技术，在基因表达分析、疾病诊断等领域得到广泛应用。
在进行荧光定量PCR实验后，需要对实验数据进行分析，以获取样品中目标DNA序列的丰度信息。
本文将介绍荧光定量PCR实验数据分析的基本步骤和常见方法。
首先，荧光定量PCR数据的分析通常包括以下几个步骤：1.荧光PCR数据的获取：荧光定量PCR实验过程中，荧光信号会被记录下来。
对于每个样品，会获得一条荧光曲线，曲线上的荧光信号强度与PCR循环次数（Ct值）有关。
2. 荧光曲线的阈值设置：荧光曲线上的信号强度在实验的早期循环中较低，随着PCR循环的进行逐渐增加，直至达到一个稳定的平台。
阈值（threshold）是在这个平台上设置的一个信号强度的固定值，用于确定Ct值。
常用的阈值设置方法包括固定阈值法和导数阈值法。
3.Ct值的计算：Ct值是荧光定量PCR实验中的一个重要指标，表示荧光信号达到阈值的循环次数。
在荧光曲线上，Ct值可以通过与阈值的交点来确定。
Ct值越小，表示目标DNA序列的丰度越高。
4.样品之间的Ct值比较：荧光定量PCR实验中，通常需要同时检测一些内部参考基因（如GAPDH）作为对照，以便进行样品之间的Ct值比较。
内部参考基因应在不同样品中表达稳定，其Ct值应接近。
通过对目标基因的Ct值与内部参考基因的Ct值进行比较，可以计算出样品中目标DNA序列的相对丰度。
5.目标DNA序列的绝对丰度计算：通过构建标准曲线，可以将目标DNA序列的相对丰度转化为绝对丰度。
标准曲线是通过在实验中使用一系列已知浓度的目标DNA序列标准品进行绘制的。
通过测量标准品的Ct值并绘制荧光信号与目标DNA序列浓度的关系曲线，可以通过比较样品的Ct值与标准曲线来计算目标DNA序列的绝对丰度。
荧光定量PCR技术原理与结果分析
荧光定量PCR技术原理与结果分析一、荧光定量PCR技术原理1.基本原理荧光定量PCR技术基于传统的PCR技术，其中关键的步骤是DNA的扩增。
PCR过程中，DNA模板会通过聚合酶链式反应在多个循环中进行指数级扩增。
在扩增过程中，每一个循环都包括三个主要步骤：变性，引物结合和扩增。
2.荧光标记3.荧光信号检测与分析在PCR反应的扩增过程中，荧光强度会随着PCR产物的扩增而增加。
荧光信号的强度与扩增目标DNA的数量成正比。
因此，通过测量PCR反应中发出的荧光信号的强度，可以确定目标DNA的起始数量。
二、荧光定量PCR技术结果分析1.标准曲线2.反应效率反应效率是PCR扩增的关键因素之一、反应效率是通过标准曲线的斜率来表示的，斜率越接近1，表示反应效率越高。
较低的PCR反应效率可能是由于试剂的浓度不足、PCR条件不合适或者目标DNA的起始浓度低。
3.CT值CT值是PCR反应过程中，荧光信号由背景噪声中分离出来的阈值周期数。
在荧光定量PCR实验中，CT值用于计算目标DNA的起始浓度。
CT值越小，表示目标DNA的起始数量越多。
4.荧光指数荧光指数是指测量PCR反应中特定周期（一般为指定阈值之后的周期）的荧光信号的增加量。
荧光指数也可以用来评估PCR的效果和目标DNA的起始数量。
荧光指数越高，表示目标DNA的起始数量越多。
5.目标基因的相对表达量总结起来就是，荧光定量PCR技术通过引入荧光标记的引物和探针，在PCR反应中实时监测荧光信号的强度变化来定量分析目标DNA的起始数量。
通过制备标准曲线、测量CT值和荧光指数，可以对PCR反应的效果和目标DNA的表达量进行定量分析。
此外，荧光定量PCR还可以用于研究目标基因的相对表达量。
荧光定量PCR的原理方法及结果分析
荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。
其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。
首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。
引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。
引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。
此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。
另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。
其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。
反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。
PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。
PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。
PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。
第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。
通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。
在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。
随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。
荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。
pcr定量实验方案
PCR定量实验方案实验目的本实验旨在通过聚合酶链式反应（PCR）定量检测目标DNA的数量。
通过PCR 定量实验，可以快速、准确地确定目标DNA的含量，为后续实验提供数据支持。
实验原理PCR定量实验基于聚合酶链式反应的基本原理，通过反复复制目标DNA序列，使其数量呈指数增加，并通过荧光信号在PCR循环的各个阶段实时监测目标DNA的增长情况。
荧光信号的强度与目标DNA的初始量成正比，从而可以定量测量目标DNA的数量。
实验步骤1.样本处理：–收集待检测样本，并提取目标DNA。
–使用核酸定量仪检测目标DNA的浓度，并计算出适当的稀释倍数。
–将目标DNA按照所需的浓度稀释，并制备出一系列不同浓度的DNA标准曲线样品。
2.PCR反应体系准备：–准备PCR反应混合液，包括模板DNA、引物、荧光探针、酶和缓冲液等。
–按照所需的PCR反应体系，按比例向反应管中加入相应的试剂，确保反应混合液的配制准确。
3.反应条件设置：–设置PCR反应的温度和时间参数，包括初始变性、循环变性、退火和延伸等步骤。
–根据目标序列的特性和引物设计，调整PCR反应的温度梯度、循环次数等参数，以实现最佳放大效果。
4.PCR反应实施：–将PCR反应混合液分装到反应管中，注意避免产生交叉污染。
–将反应管放入PCR仪中，按照设定的温度和时间参数运行PCR反应。
–实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化，记录关键点的荧光信号值。
5.数据分析：–将PCR反应过程中记录的荧光信号值绘制成实时荧光曲线图。
–根据所制备的DNA标准曲线样品，通过荧光信号值反推目标DNA的初始量。
–根据目标DNA的初始量和稀释倍数，计算样本中目标DNA 的浓度。
实验注意事项1.实验操作前，准备好PCR反应所需的所有试剂和设备，并保持反应管和工作台的清洁。
2.操作过程中，注意避免产生交叉污染，尤其是在样本处理和PCR反应准备阶段。
3.严格按照PCR反应体系准备说明书中的比例和操作要求进行试剂的配制和混合。
荧光定量pcr结果分析
如果有标准曲线，按照标准曲线计算。
一般都是相对量。
则用delta delta CT方法来计算。
举例如下：
对照组基因A的CT值为20，内参（比如βactin)CT值15。
实验组基因A CT值18，内参CT值14。
首先算加样量：delta CT=15-14=1。
2的1次方是2。
也就是说实验组的加样量是对照组的2倍。
基因A: delta CT=20-18=2。
2的2次方是4。
也就是说基因A的量在实验组是对照组的4倍。
但是由于加样量是2倍，所以4处以2=2，最后的相对量是2倍。
几点注意：
1。
必须确定扩增的特异性
2。
只有相同目标的CT值才能相减（扩增效率有可能不同）
3。
2的某次方只是理论值，实际扩增效率低于2。
4。
最好不用Syber Green
由Ct值用2^-△△Ct法计算计算表达量差异的原理，可以看下面的图片：
附件的Excel文件是计算用的，感兴趣也可以看看由Ct值是如何一步一步算出2^-△△Ct的。
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Excitation
SG
5’ 3’
SG SG SG
3’ 5’
SG
实时检测: 双标记探针
5’
5’
3’
激发 激发
RR
3’
R
3’
3’
5’
Q
Q
5’
引物和探针的设计
免费的基于网络的设计软件
Primer3（/） • 引物和双标记水解探针的设计 • Tm的计算
MFold（http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold-simple.html） • 引物和扩怎产物二级结构的预测 • 二级结构的稳定性(delta G) 和融解温度 (Tm)
标准曲线可通过已知浓度的cDNA/RNA来构建
注意事项: - DNA/RNA纯度 - 精确移液 - 标准品的稳定性 - 避免DNA作为RNA的标准品
Two Standard Curves
Concentration normalisation (ratio) = mean G.O.I / mean Ref. Relative value = Ratio Sample / Ratio Calibrator
引物的设计
扩增产物 • 产物越短，反应效率越高 • 理想状态为75–150 bp • 避免形成稳定的颈环二级结构 • 避开回文序列 • 避开G/C含量较高的序列
引物 • 避免二级结构 (发卡) • 避免出现4个连续相同的碱基 (尤其是G) • 尽量避免二聚体 • 长度18–25 nt • Tm值: 60oC • GC含量: 45–55 % • 保证引物特异性 • 引物不含有内含子序列
逆转录酶 • 较高的逆转温度可以减少cDNA二级结构的形成 (Freeman et al. 1996).
逆转录效率 • 理论上RNA/mRNA逆转录成cDNA的效率是100% (< 70%) • 单链结合染料Oligreen® 可以用于测定cDNA的浓度
实时扩增
荧光物质的选择
插入式染料 • 成本低 • 适用于所有的双链 • 研究基因较多时适用 • 特异性低
BLAST • 结构特异性
探针设计原则
• 引物与探针的距离<10碱基 • 避免二级结构 • GC含量: 45 – 55 % • 探针Tm高于引物10 oC 左右 (70 oC) • 5’端保证不是G • 探针少于30个碱基 • 3’端最后5个碱基不要超过 2C或2G • 3’端添加磷酸基团 • BLAST 保证探针特异性
基因型分析
绝对定量
综述: Absolute Quantification of mRNA using real time reverse transcription polymerase chain reaction assays. SA Bustin J. Mol. Endo 2000 25,169-193
MgCl2浓度 • Mg2+ • 最优的MgCl2浓度: 1.5–3.5 mM
反应优化(双标记水解探针)
引物和探针浓度
• 引物浓度25–900 nM • 探针浓度10–250 nM • 引物:探针= 3:1 • 最优的引物浓度: Ct值较小、信噪比较高 • 电泳分析确定扩增产物的长度
水 229.5 µl
反应优化 (掺入式染料)
SYBR® Green I 浓度 • 不同稀释倍数进行实验 • 较高浓度抑制PCR反应 • 较低浓度导致信号较低
引物浓度 • 上下游引物浓度: 300 nM • 固定DNA模板浓度进行优化 • 阳性对照和阴性对照 • 最优的引物浓度: Ct值较小、信噪比较高 • 融解曲线分析扩增产物特异性 • 电泳分析确定扩增产物的长度
10 x 缓冲液 85 µl
MgCl2 51 µl
dNTP 68 µl
Taq 8.5 µl
DNA 34 µl
10 µl 6.25 µM
probe
下
4.5µM
游
引
物
1.5µM
+ 5µl
0.25µM
取140 µl 预混液加入下列反应管中
10 µl 3.75 µM
probe 取15 µl 加入下列PCR反应管中
实时荧光定量PCR 实验的设计及结果的分析
基因有限公司 王争强
术语
对照组：用作对照的样本，与实验组进行比较 实验组：未知样本，用于研究 目的基因(GOI)：用于研究的基因 内参基因(看家基因)：基因表达量比较恒定的基因，用于校正起始上样量的区别 参比样本(Calibrator): 用于比较的样本，如未处理样本、正常组织、0时相样本等 标准品(Standards)：梯度稀释的已知浓度的样品，测定未知样品的浓度和反应效率 Ct值： 样品扩增产物的荧光信号达到所设定的荧光阈值时需要的循环数 反应效率(E)：PCR扩增的速率
Software steps
∆∆CT或 比较 CT 分析
• 无需标准曲线 • 测定相对表达量 • GOI和REF反应效率相同或者相似（需验证） • 假定反应效率100%.
Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^[ -delta delta C(T) ] Method. Livak KJ & Schmittgen TD. Methods 2001 Dec;25(4): 402-408
总结
•减少样品与反应间的差异 •选择合适的方法并优化 •分析数据
RT-qPCR流程示意图源自 RNA 提取样本的准备 • 速度 (RNA 降解) • RNA酶抑制剂 • 保存条件
分离试剂的选择 • 液态或组织 • 植物、动物或者微生物
RNA 质控 • RNA的完整性 • RNA的纯度 • RNA的浓度 • 抑制因子的影响
逆转录
逆转录引物 • 随机六核苷酸引物 (总RNA) 或者 OligodT 引物 (mRNA) • 扩增产物在5’端时，尽量避免用OligodT做引物
add 10 µl 1.25 µM probe
4.5µM 1.5µM 0.25µM
4.5µM 1.5µM 0.25µM
+ 5µl 上游引物
4.5µM 1.5µM 0.25µM
定量分析
定量方法的选择
绝对定量 相对定量
- 双标曲线
- ∆∆CT - Assumption Free Analysis (LinReg) - Relative Expression Software Tool (REST)
双标记水解探针（TaqMan探针） • 特异性高 • 目的基因浓度低时结果可靠 • 需要设计探针及反应条件优化 • 目的基因较少时适用 • 成本较高
实时检测: SYBR® Green I
Excitation
5’
SG
SG
3’
Emission
SG
3’
SG
5’
SG
实时检测: SYBR® Green I