第六章蛋白质翻译后修饰的鉴定(医学相关)
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第六章蛋白质翻译后修饰的鉴定
04
抗体法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应用
抗体法原理及技术流程
原理
抗体法利用特异性抗体与蛋白质翻译 后修饰位点结合的原理，通过免疫学 方法进行检测和鉴定。
技术流程
包括抗原制备、抗体生产、抗体纯化 和特异性验证等步骤。
抗体法鉴定蛋白质翻译后修饰的优势与局限性
优势
高特异性、高灵敏度、可定量分析等。
局限性
化学方法
质谱分析
通过质谱技术检测蛋白质分子的质量和化学 性质，从而鉴定蛋白质的翻译后修饰类型和 位点。
荧光标记
利用荧光标记技术标记特定的修饰位点，通过荧光 信号的强度和分布来鉴定蛋白质的翻译后修饰。
蛋白质芯片技术
将蛋白质固定在芯片表面，利用特定的抗体 或配体检测蛋白质的翻译后修饰类型和位点 。
实例分析
第六章蛋白质翻译后 修饰的鉴定
汇报人：XX
目录
• 蛋白质翻译后修饰概述 • 蛋白质翻译后修饰的鉴定方法 • 质谱法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应用 • 抗体法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应用 • 其他方法在蛋白质翻译后修饰鉴定中的应
用 • 蛋白质翻译后修饰鉴定的挑战与未来发展
01
蛋白质翻译后修饰概述
数据准备
收集已知的蛋白质乙酰化修饰位点数据，包括蛋白质序列、修饰位点 的位置和化学性质等。
特征提取
从蛋白质序列中提取与乙酰化修饰相关的特征，如氨基酸组成、序列 模体、结构域等。
模型训练
利用机器学习或深度学习算法，如支持向量机、神经网络等，训练预 测模型。
预测与验证
将新的蛋白质序列输入到训练好的模型中，预测潜在的乙酰化修饰位 点，并通过实验验证预测结果的准确性。
其他方法
1 2 3
蛋白质翻译后修饰
细胞应激反应
在应激条件下，如氧化应激和DNA损伤， 蛋白质翻译后修饰可以调控应激反应相关蛋 白的活性和功能，从而影响细胞的生存和凋
亡。
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泛素化作用
泛素化可以影响靶蛋白的稳定性、定位、活性以及与其他蛋白质的相互作用，从 而调控细胞内的多种生物学过程，如细胞周期、信号转导和自噬等。
泛素化可以标记受损或不需要的蛋白质，引导其被蛋白酶体降解，从而维持细胞 内蛋白质的平衡。
泛素化调控
泛素化过程受到严格的调控，涉及多种酶的协同作用。这些酶包括E1（泛素活化酶）、 E2（泛素结合酶）和E3（泛素连接酶）。
E3酶在泛素化过程中起着关键作用，它能够识别并结合特定的靶蛋白，将泛素分子准 确地连接到靶蛋白上。
此外，去泛素化酶能够逆转泛素化过程，去除已经结合在靶蛋白上的泛素分子，从而对 泛素化进行动态调控。
05
其他翻译后修饰
乙酰化
总结词
乙酰化是一种常见的蛋白质翻译后修饰，通过将乙酰基团连接到蛋白质的特定氨基酸残基上，可以调节蛋白质的 活性和功能。
翻译后修饰可以影响蛋白质的稳定性 ，通过增加或减少蛋白质的降解速率 ，从而影响细胞内蛋白质的水平和功 能。
蛋白质降解
某些翻译后修饰，如泛素化，可以标 记蛋白质进行降解，通过蛋白酶体途 径降解蛋白质，维持细胞内蛋白质的 动态平衡。
蛋白质功能调控
酶活性调节
亚细胞定位
许多蛋白质在翻译后被修饰以改变其酶活性， 例如，磷酸化可以激活或抑制酶的活性，从 而调控代谢过程和信号转导。
03
疾病与磷酸化
许多人类疾病与蛋白质磷酸化的异常有关。例如，一些癌症和神经退行
性疾病的发生与特定蛋白质的异常磷酸化有关。因此，对蛋白质磷酸化
蛋白质翻译及翻译后修饰课件.ppt
1.3 核糖体（ribosome）与核糖体rRNA
核糖体是rRNA 与几十种蛋白质的复合体，有大、小两个亚基构成。含有 合成蛋白质多肽链所必需的酶、起始因子（IF）、延伸因子（EF）、释放 因子（RF）等。
原核的核糖体（70S）= 30S小亚基 + 50S大亚基 30S小亚基: 16S rRNA + 21种蛋白质 50S大亚基: 23S，5SrRNA + 34种蛋白质
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
tRNA的结构—“四环一臂”
倒L形的三级结构
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
tRNA的功能是解读mRNA上的密码子和搬运氨基酸。 tRNA上至少有4 个位点与多肽链合成有关：即3’CCA氨基酸接受位
点、氨基酰-tRNA合成酶识别位点、核糖体识别位点和反密码子位点。 每一个氨基酸有其相应的tRNA携带, 氨基酸的羧基与tRNA的 3’
反应如下：
A A t R N A A T P 氨 酰 基 - t R N A 合 成 酶 A A - t R N A A M P P P i
氨基酸的羧基与tRNA 的3’端CCA-OH 以酯键相连，因此其氨基是自 由的。
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
tRNAfmet fMet-tRNA合成酶
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
分泌型蛋白质在翻译过程中通过信号肽协助转入内质网的机制
信号肽（signal peptide）是在新生的多肽链中，可被细胞识别系统识别的 特征性氨基酸序列，在蛋白质翻译过程中或翻译后的定位发挥引导的作用。
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
本章结束
蛋白质翻译及翻译后修饰课件
氨酰基tRNA进入A位
新的氨基酸-tRNA的进位依赖Tu-Ts因子和GTP的协助
蛋白质翻译后修饰【病理生理学教研室】 ppt课件
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泛素化
泛素化是指泛素（一类低分子量的蛋白 质）分子在一系列特殊的酶作用下，将细胞 内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并 对靶蛋白进行特异性修饰（主要是降解）的 过程。
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(二)蛋白激酶的种类
真核细胞的蛋白激酶可分为五类：
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，磷酸基团的受体是丝氨酸 /苏氨酸羟基； 酪氨酸蛋白激酶，磷酸基团的受体是酪氨酸的酚羟 基；
组/赖/精氨酸蛋白激酶，磷酸基团的受体是咪唑环 、胍基、氨基； 半胱氨酸蛋白激酶，磷酸基团的受体是巯基；
MEK5
MKK
ERK1/2
JNKs
p38s
ERK5
MAPK
生长
凋亡
炎症反应
?
细胞反应
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MAPK的作用底物:
转录因子： ATF2、c-Jun、Chop10、 MEF2C、ELK1
胞内蛋白激酶：MAPKAPK2/3、MNK1/2、 PRAK、MSK1/2
骨架相关蛋白：MAPs、Tau、sHSP
离子通道蛋白：Na+通道蛋白
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MAPK介导的细胞反应
Stress response
Inflammation
Apoptosis
Development Proliferation
MAP kinases Differentiation
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蛋白质翻译后修饰与加工
VS
信号转导
在信号转导过程中，蛋白质的翻译后修饰 可以影响蛋白质与其他信号分子或受体的 结合，从而调控信号转导通路的激活或抑 制。
蛋白质构象变化
构象变化
某些蛋白质在翻译后经过特定的化学修饰， 如磷酸化、乙酰化等，这些修饰可以改变蛋 白质的构象，从而影响蛋白质的功能。
结构域运动
蛋白质的结构域之间可以发生相对运动，这 种运动可以影响蛋白质与其他分子的结合或 构象变化，从而调控蛋白质的功能。
糖基化
总结词
糖基化是一种在蛋白质翻译后发生的修饰，通过将糖链连接到蛋白质的特定氨基酸残基上，影响蛋白质的结构和 功能。
详细描述
糖基化分为两种类型：N-糖基化和O-糖基化。N-糖基化发生在新生蛋白的N-端，而O-糖基化发生在丝氨酸或苏 氨酸残基上。糖基化可以影响蛋白质的稳定性、分泌和细胞间的相互作用，参与多种生物学过程，如细胞识别、 信号转导和免疫应答等。溶酶体途径Fra bibliotek溶酶体
是一种细胞器，内部含有多种水解酶，能够分解各种生物大分子。
溶酶体途径
是指通过溶酶体降解细胞内物质的过程。
04
蛋白质定位与转运
核定位信号
01
02
03
04
核定位信号（NLS）
是一种特殊的氨基酸序列，能 够引导蛋白质进入细胞核。
核输出信号（NES）
存在于某些蛋白质中，能够将 蛋白质从细胞核输出到细胞质 。
酶的激活
某些蛋白质在翻译后经过特定的化学 修饰，如磷酸化、乙酰化或甲基化等， 这些修饰可以改变酶的构象或电荷分 布，从而激活酶的活性。
酶的失活
某些蛋白质经过特定的化学修饰后， 如泛素化或糖基化等，会导致酶的活 性降低或完全失活，从而调控蛋白质 的降解或功能。
第6章 翻译后过程
•
PrP有两种形式；细胞型PrPc和异常型PrPsc。正常细胞中PrPc的序列以α螺旋结构为主， β折叠仅占11.9% 若PrPc中的α螺旋发生结构转换成β折叠， 则变成为异常型的PrPsc， 其
结构中β折叠占43%。 PrPsc蛋白聚集沉积，引起病状并有传染性。
牛海绵状脑病（俗称疯牛病）、羊瘙痒病、 人克雅氏病、震颤病和吉斯综合症，老年 性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固 醇症、家族性淀粉样蛋白症、某些肿瘤、 白内障等等
（一）蛋白质的折叠（PROTEIN FOLDING)
蛋白质一级结构 三级结构
蛋白质的折叠
从核糖体上释放出来的多肽链，按照一级结构中氨基酸侧
链的性质，进行卷曲，形成一定的空间结构
细胞内的蛋白质折叠与组装：在胞浆、线粒体或内质网（ endoplasmic retinum ， ER ）
内质网中的蛋白质折叠
• 内质网（endoplasmic reticulum;ER ）： 真核细胞细胞质内广泛分布的由膜构成的扁囊、小管或小泡连接形成的连续 的三维网状膜系统。分为糙面内质网和光面内质网两种。 粗糙型内质网： 膜上附着核糖体颗粒 功能是合成蛋白质大分子，并把它从细胞输送出去或在细胞内转运到其 他部 位。 光滑型内质网：没有核糖体附在上面 功能与糖类和脂类的合成、解毒有关，并且还具有运输蛋白质的功能。
组蛋白乙酰化与癌症（Histone Acetylation and Cancer） • • 负责组蛋白乙酰化和去乙酰化的是一对功能相互拮抗的蛋白酶———组 蛋白乙酰化转移酶（histone acetylases, HATs） 和组蛋白去乙酰化酶（ Histone deacetylases, HDACs ）
分子伴侣的发现： • Laskey等(1987) 研究非洲爪蟾核小体形成时发现一种酸性核蛋白— —nucleoplasmin。 • 实验：在生理离子强度 下，体外把DNA与组蛋白混合在一起，不能自 我组装，而是形成沉淀。如果把组蛋白与过量nucleoplasmin混合，再 加入DNA，则可形成核小体结 构，而且最终形成的核小体中没有 nucleoplasmin。 • 结论：它在DNA与组蛋白装配成核小体时是必需的。 • 据此Laskey 称它为“分子伴侣”。 • 分子伴侣（Molecular chaperone）的发现，说明细胞内新生肽段的折 叠一般意义上说是需要帮助的，而不是自发进行的。
6.翻译后修饰的鉴定2009
(2)IMAC分离/富集磷酸肽 分离/ 分离 固相金属亲和色谱( 固相金属亲和色谱(immobilized metal affinity chromatography IMAC)原来用来纯 原来用来纯 化含组氨酸的蛋白质, 化含组氨酸的蛋白质,现在也常被用来选择 性富集磷酸肽. 性富集磷酸肽. 磷酸基团与固相化的金属离子有高亲和力, 磷酸基团与固相化的金属离子有高亲和力, 可被选择性地吸附在上面,用高pH溶液或 可被选择性地吸附在上面,用高 溶液或 磷酸盐洗脱后即为富集的磷酸肽. 磷酸盐洗脱后即为富集的磷酸肽. L Limitation: non-specific binding to acidic side chains (D, E). Solution: Derivatize all peptides by methyl esterification to reduce non- specific binding by carboxylate.groups.
真核细胞蛋白质中常见的几种磷酸 化修饰氨基酸残基的结构
二. 磷酸化蛋白质分析概述
传统的磷酸化蛋白质的分析有许多是利用 体外激酶反应使蛋白质被磷酸化修饰, 体外激酶反应使蛋白质被磷酸化修饰,产生足 够用于分析的磷酸化蛋白, 够用于分析的磷酸化蛋白,经化学或质谱分析 确定磷酸化位点,例如Edman Edman测序和串联质谱 确定磷酸化位点 ,例如 Edman 测序和串联质谱 测序. 测序.同时为了证明体外研究确定的磷酸化位 点确实具有生物学意义, 点确实具有生物学意义,还必须证实在体内存 在相同的磷酸化位点. 在相同的磷酸化位点. 通常通过比较磷酸化蛋白质的二维磷酸肽 图得以证实. 图得以证实.当体内和体外同一磷酸化蛋白质 酶切后各自的磷酸肽在二维谱图中共迁移时, 酶切后各自的磷酸肽在二维谱图中共迁移时, 可认为体内, 可认为体内,体外磷酸化蛋白有相同的磷酸化 位点. 位点.
蛋白组学翻译后修饰.pptx
• 细胞膜的许多蛋白质是以糖蛋白形式存在
• 糖低聚物在细胞间信号传递中也起了重要的作用
• 成为免疫系统调控和癌症治疗的最重要的线索之
一
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糖苷键类型 • N连接：天冬酰胺序列子Asn-X-Thr/Ser • O连接:Ser/Thr • 糖基磷脂酰肌醇锚 (glycosyl phophotidylinositol, GPI)：
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PSD－MALDI－TOF－MS
• PSD：源后衰变（post-source decay），母离子在飞行中发生断裂， 丢失一个中性分子。磷酸化肽段丢失HPO3或者H3PO4，产生质量 数减少80kD或者98kD的子离子。
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磷酸化位点的确定
• 用串联质谱（MS/MS）对磷酸化肽进行分析。 • 将磷酸化肽打碎，产生全部碎片离子，根据离子数量推断
• 至少有30%的蛋白被磷酸化修饰 • 大部分蛋白磷酸化是可逆的 • 磷酸化的作用位点
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蛋白质组学在磷酸化分析中的困 难
• 磷酸化蛋白质在细胞内的蛋白质中是相对较低丰度的； • 即使我们找到一种磷酸化蛋白质，也不能排除有该蛋白质的其他磷酸化形式存在； • 细胞内有很多磷酸酯酶，在样品处理时，这些酶很容易将磷酸基团脱掉； • 磷酸化蛋白质酶解后的磷酸化肽段，因为其化学性质的负电性，在质谱技术中面
抗体免疫印迹法
• 优点 • 灵敏 • 直观
• 克服同位素法的局限 • 无同位素污染，操作相对方便 • 可检测无磷酸化转换的蛋白 • 能区分不同残基的磷酸化
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磷酸化肽段的分离和富集
• 使用磷酸化蛋白的抗体 • IMAC法 • 磷酸基团亲和取代
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蛋白质翻译后修饰指南
蛋白质翻译后修饰指南蛋白质是构成生物体的重要组成部分，其翻译后修饰对于蛋白质的功能和稳定性具有重要的影响。
本指南将介绍蛋白质翻译后修饰的主要类型和作用，以及在实验室中常用的技术和方法。
一、蛋白质翻译后修饰的类型1. 糖基化：糖基化是一种常见的蛋白质翻译后修饰方式，它可以增加蛋白质的稳定性和溶解性，并调节蛋白质的功能。
糖基化的糖链可以通过N-糖基化和O-糖基化两种方式与蛋白质结合。
2. 磷酸化：磷酸化是一种通过添加磷酸基团来改变蛋白质功能的修饰方式。
磷酸化可以调节蛋白质的酶活性、亲和力和细胞定位，从而影响细胞信号传导和许多生物学过程。
3. 乙酰化：乙酰化是一种通过添加乙酰基团来改变蛋白质的修饰方式。
乙酰化可以影响蛋白质的结构和亲和力，从而调节其功能、稳定性和细胞定位。
4. 甲基化：甲基化是一种通过添加甲基基团来改变蛋白质的修饰方式。
甲基化可以影响蛋白质的稳定性、DNA或RNA结合能力，从而调节基因表达和细胞分化。
二、蛋白质翻译后修饰的作用1. 调节蛋白质功能：翻译后修饰可以改变蛋白质的结构和活性，进而影响其功能。
例如，磷酸化可以调节酶的活性，糖基化可以影响蛋白质的折叠和稳定性。
2. 控制蛋白质降解：某些翻译后修饰方式可以促进或抑制蛋白质的降解，从而控制蛋白质在细胞内的寿命和稳定性。
例如，泛素化是一种促进蛋白质降解的修饰方式。
3. 调控细胞信号传导：许多翻译后修饰方式可以调节细胞内的信号传导通路。
例如，磷酸化可以激活或抑制信号蛋白的功能，从而影响细胞的生理过程。
三、蛋白质翻译后修饰的实验方法1. 质谱分析：质谱分析是研究蛋白质翻译后修饰的重要方法之一。
通过质谱仪可以检测修饰蛋白质的质量和结构，从而确定修饰的类型和位置。
2. 免疫印迹：免疫印迹是一种常用的蛋白质检测方法，可以用于检测特定修饰的蛋白质。
通过使用特异性的抗体，可以识别和分析特定修饰方式下的蛋白质。
3. 免疫组织化学：免疫组织化学是一种用于研究修饰蛋白质在细胞或组织中的定位和表达的方法。
植物蛋白质翻译后修饰的研究
植物蛋白质翻译后修饰的研究
植物蛋白质翻译后修饰是指蛋白质在经过翻译过程后，又经过一系列的后修饰
才形成最终的功能蛋白质。
这个过程非常重要，它能够影响蛋白质的稳定性、半衰期、定位、交互以及活性状态等，为植物细胞维持正常的代谢进程提供了重要的支持。
植物蛋白质翻译后修饰的种类很多，其中包括了糖基化、磷酸化、甲基化、等
修饰过程。
这些修饰是由特定的酶类催化的，因此酶的活性也对其生成产物有很大的影响。
比如，由于纤维素水解酶Cellobiohydrolase I（Cel7A）的Structure与函数关系特别密切，因此对Cel7A的后修饰进行研究是极其重要的。
目前的研究表明，糖基化是影响Cel7A生成产物的一个重要修饰。
为了研究后修饰对植物蛋白质功能的影响和机理，研究者们采用了多种技术手段，包括了质谱法、电泳法、RNA干扰等方法。
最近的研究中，科学家使用了基
因编辑技术来研究Cel7A的功能，并发现了一个新的修饰方式——磷酸化。
这项
研究不仅为同行们理解植物蛋白质后修饰机制提供了新的数据，而且为工程改造
Cel7A提供了更多的思路和方向。
除了Cel7A，还有很多植物蛋白质的后修饰机制需要我们去探究，如何优化现
有的技术手段、提高相应酶类的活性、改良修饰机制等都是当前研究的热点问题。
通过深入研究，我们可以更好地理解植物蛋白质的相关功能，为未来的植物工程学、生物制药等领域的发展提供有力支撑。
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一、生物体内的蛋白质磷酸化修饰及其功能
蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团 从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生 物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的 传递过程中占有极其重要的地位
蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移 到底物蛋白质氨基酸残基上的过程
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第六章 蛋白质翻译后修饰的鉴定
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1
蛋白质翻译后修饰
蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的 作用，它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为 完善，调节更为精细，作用更为专一
N-端fMet或Met的切除
二硫键的形成
化学修饰
剪切
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2
泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA修复、免疫 应答和应激反应等生理过程起着重要作用
此方法提供了其他方法不能提供的有关蛋白质磷
酸化状态的重要信息
(1)磷酸化位点的最大数目
(2)放射自显影强度提供了在所有磷酸化肽中磷酸 化的相对化学计量
(3)电泳和TCL的正交分离提供了磷酸肽之间亲水性
的相对状态
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12
二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸肽本身所具有的负电性使其在正离子模式 的质谱分析中信号受到抑制，在MALDI源的质 谱仪中磷酸肽的信号丰度会比其相应未磷酸化 肽段的信号强度要低很多
6
磷酸化类型
丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸酯化 精氨酸、组氨酸和赖氨酸的亚酰胺化，天冬氨酸
和谷氨酸的酰化 丝氨酸磷酸化：苏氨酸磷酸化：酪氨酸磷酸化
=1800：200：1
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7
被磷酸化修饰的蛋白
改变所带的电荷 改变催化基团的性质 改变蛋白质的构象 改变蛋白质的亚细胞分步 蛋白质功能变化的多样性
培养待标记的细胞至适当的生长期，在生长旺盛的 细胞中磷酸盐的转运达到最高峰，用不含磷酸盐的 标记培养液替换原来的细胞培养液，并加入32P标 记磷酸盐共培养，使细胞ATP库与32P平衡，蛋白激 酶利用被放射标记的ATP使底物磷酸化
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局限性
磷酸转换速率较低的磷酸化蛋白质 不能标记组织样本 放射性污染
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8
蛋白质磷酸化研究有三个主要目的
(1)对位于某一特定状态下细胞内的给定蛋白 质在体内的磷酸化氨基酸残基定位
(2)鉴定与磷酸化过程有关的激酶 (3)分析所观察到的磷酸化现象对功能的影响
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二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋 白质组学研究的关键技术之一
细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化,即使蛋白质的 表达量处于相对较高的水平,该蛋白质的磷酸化部 分的分析也很困难, 一般一个发生磷酸化的蛋白
质其磷酸化的部分仅占其总量的10%
磷酸化蛋白质含量少，化学计量值低，磷酸化的肽段
很容易淹没在大量非磷酸化的肽段中
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二、磷酸化蛋白质分析的概述
磷酸氨基酸 分析
体外 pmol 32p蛋白标记
蛋白质分离 蛋白酶切 2DPP作图
体内 fmol 32p细胞标记
相关分析
蛋白酶切 2DPP作图
μHPLC
μLC－ESI-MS或 MALDI-MS
IMAC
μLC－ESI-MS
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二、磷酸化蛋白质分析的概述
双相磷酸多肽谱图 2D—PP
多肽在薄层纤维板上进行电泳是第一相，在同一 块板上进行薄层色谱(TCL)为第二相，分离得到的 磷酸肽用放射自显影或磷储屏检测
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2、抗体免疫印迹检测法
通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质的免疫印迹反 应(Western blotting)来检出磷酸化蛋白质是较常用 的方法
在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨 酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化
已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗 体,其中抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好，磷酸化丝 氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小,抗原抗体结合位点有 空间障碍,所以抗体的结合力较差
磷酰键较肽键容易断裂，使磷酸化蛋白比非磷 酸化蛋白鉴定要困难的多
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三、磷酸化蛋白质的检测
32P放射性标记法 抗体免疫印迹检测法
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1、32P放射性标记法
32 P 放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测 方法
放射性32P标记的ATP处理细胞，使32P掺入磷酸化 蛋白质
磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收 缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过 程
糖基化在许多生物过程中如免疫保护、病毒的 复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作 用
脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常 关键的作用
组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关
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3
第一节 蛋白质翻译后修饰的鉴定
4
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5
蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用
在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点 胞内信使，cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油）
蛋白质的磷酸化与脱磷酸化控制了细胞内已有的 酶“活性”
对外界信号具有级联放大作用 蛋白质的磷酸化与脱磷酸化保证了细胞对外界信
号的持续反应
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免疫印迹法与免疫沉淀相结合,可以在电泳之前先富集
目的蛋白质,但这样也有可能丢失部分低丰度的目的蛋
白质,同时免疫沉淀技术对抗体的要求更高,抗磷酸酪氨
酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验
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样品制备（细胞、组织、体液提取蛋白质）
制备型2D胶电泳
分析型2D胶电泳
考马斯亮蓝染色
转印到膜
磷酸氨基酸抗体免疫检测—得到磷酸化蛋白质
图谱比较
找出相应的磷酸化蛋白质
染色—得到全部蛋白质点
磷酸化蛋白质鉴定
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四、蛋白质磷酸化位点的分析
1、磷酸肽的分离和富集
分离浓缩分析物，提高信噪比
如果磷酸肽被放射性标记，并具有相同的比活度，那 么每一个被分离的肽段相应的活度计数就表明这一组 分中磷酸肽的相对量，如果已知所用放射性标记物的 比活，就能容易算出磷酸肽的绝对量
放射性标记的磷酸肽的分离谱可以用来定量检测不同 时间或细胞状态下蛋白质磷酸肽状态的变化
肽分离方法也有效地除去了非肽类杂质，更有利检测 和分析低丰度磷酸肽
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1、磷酸肽的分离和富集
方法