质粒载体概述及提取

质粒载体的概述及提取

生物技术112班第2学习小组姓名：鲍臻学号：2011013410

本次研讨方向：质粒载体的概述及提取方法介绍

质粒在所有的细菌类群中都可发现，它们是独立于细菌染色体外自我复制的DNA分子。自然界中，质粒是在营养充足时出现的，它在结构、大小、复制方式，每个细菌的拷贝数，在不同的细菌体内的繁殖力，在菌种之间的转移力等方面都会变化，可能最重要的是质粒

所携带的特征的改变。大多数原核生物的质粒是双链环状的DNA分子；但是无论是在革兰

式阳性还是阴性菌体内都可以发现线状质粒。质粒大小变化很大，可从几个到数百个kb。

质粒依靠宿主细胞提供的蛋白质进行复制，但也可以使宿主细胞获得质粒编码的功能。质

粒复制可以与细菌的细胞周期同步，导致菌体内质粒的拷贝数较低，质粒复制也可独立于

细胞周期，使每个菌体内扩增了成百上千个质粒拷贝。一些质粒在菌种间可自由地转移它

们的DNA分子，另一些只转移质粒给同种细菌，而有些却根本不转移它们的DNA。质粒带

有具有许多功能的基因，这些功能包括对抗生素和重金属道德抗性、对诱变原的敏感性、

对噬菌体的易感或抗性、产生限制酶、产生稀有的氨基酸和毒素、决定毒力、降解复杂有

机分子，以及形成共生关系的能力和在生物界内转移DNA的能力。

目前提取质粒DNA的方法有两种：煮沸法和碱变性抽提法，而决定用哪种方法是根据

质粒载体的特征来决定的。包括:质粒载体的大小，宿主大肠杆菌的菌株特性及纯化质粒DNA方法。

目前各实验室最常用的质粒DNA提取方法。提取原理主要是根据细菌染色体DNA分子

比质粒DNA分子大得多，也复杂得多，所以染色体DNA和质粒DNA的变性和复性过程有较

大差异，从而达到分离目的。

在pH12的碱性条件下，线性染色体DNA和蛋白质变性充分。质粒DNA大部分氢链也断裂变性，但质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离。当用pH4.8

的KAc的高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA容易恢复到原来的构型，溶解在溶液中，而染色体DNA不能完全恢复原构型，而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA，大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等会一起沉淀。这样将质粒DNA分离出。

实验的步骤：

1.取1~1.5mL过夜培养的细菌加入eppendorf管中，置冰水中。

2.10000~12000 rpm，室温离心5分钟。

3.去上清（如沉淀太少，可再加1~1.5mL菌液，再离心沉淀一次），加入预冷的溶液

I 100 μL（50mmol/L 蔗糖，25mmol/L Tris-HC1pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0），

振荡器上振混匀。

4.加新鲜配制的溶液Ⅱ200 μL（10N NaOH 2mL，10% SDS 10mL，ddH2O

88mL），轻轻混匀，静置5min,可见溶液变清。

5.加入预冷的溶液III 150 μL （5mol/L 醋酸钾 60mL，冰醋酸 11.5mL，

ddH2O28.5mL灭菌，置4℃保存），轻轻小心混匀。可见白色絮状沉淀。

6.室温12000rpm 离心5分钟,上清转入一个新的eppendorf管中。

7.加入等体积的酚-氯仿（V/V）混合液400 μL ，混匀，静置5min 。

8.室温12000rpm，离心5分钟,可见溶液分层。

9.小心取上层水相（注意不能接触到界面）转入一个新的eppendorf管中。加入二倍

体积的无水乙醇（约1ml）。混匀，混匀后置-20℃30min。

10.室温12000rpm，离心5分钟，弃乙醇。

11.用0.5 mL 75%乙醇洗沉淀和管壁（除盐),去乙醇，室温晾干。

12.沉淀溶于30~50 μ L TE或双蒸水中,（Rnase 20 μ g/mL） -20℃保存。

在经提取的DNA最后必须抽干。DNA可贮存在pH8.0的TE中，这样可DNA比较稳

定，EDTA还能抑制DNA酶的作用。DNA也可贮存在双蒸水中，因为没有金属离子，所以

DNA酶也无活性。当然DNA也可贮存于乙醇中。