最新酶学基础三
第一章 酶学基础
• A、Km是酶的特征常数之一，一般只与酶 的性质有关，而与酶的浓度无关。不同的 酶Km不同。 • B、Km值也会因外界条件如pH值、温度以 及离子强度等因素的影响而不同。因此Km 值作为常数只是对应某一特定的酶反应、 特定底物、特定的反应条件而言的。测定 酶的Km可以作为鉴别酶的手段，但是必须 在指定的实验条件下进行。
• 延胡索酸酶有两种底物： • 延胡索酸 Km5.0x10-6 • 苹果酸 Km2.5x10-5
• 问：哪种底物是最适底物？哪种底物与酶
的亲和力大？
• （2）、使用范围和实际用途 • 适用于单底物酶促反应；底物浓度远远大于酶浓 度；无激活剂和抑制剂存在时。 • 实际用途：可由已知V0，求【S0】，或由【S0 】求V0。 • (3)、反应速度V0与酶浓度【E0】之间的关系 • 当【S0】》Km时，V0≈Vmax＝K2【E0】，此 时反应速度V0正比于酶浓度【E0】，而与底物浓 度无关，这是一个实用结论。在测定酶活性时， 一般选择【S0】》Km的条件。
四、PH的影响
固定酶反应的其它条件，在不同pH处测定酶 反应速度，可得各种类型的酶活性与pH关系
生化学家将酶活性最高处的pH称为最适pH。一般来
说，血清中大多数酶最适pH接近中性（pH6.5-7.5）。
测定酶活性浓度时一定要选择在最适pH处，不仅因为此 处酶反应速度最大，测定灵敏度最高，还因为此处酶活 性变化的斜率最小，如反应体系中出现pH变化时，对测
（三）恒态酶与调节酶
根据酶在代谢中所处的地位、含量与活性情况分：
• 恒态酶：构成代谢途径和物质转化体系的基本组 成成分，在细胞中含量相对稳定，其活性仅受反 应动力学系统本身的组成因素调节。 • 调节酶：在代谢途径和物质转化体系中起调节作 用的关键酶，含量与活性常因机体机能状况而不 同。
高三酶知识点总结
高三酶知识点总结一、酶的基本概念酶是生物体内的生物催化剂，是一种能够促进生物化学反应进行的蛋白质。
酶作为生命的催化剂，在维持生命活动中起着至关重要的作用。
通过降低反应的活化能，酶能够加速生物化学反应的进行，使反应在体温下进行，并且保证了反应的特异性和高效性。
二、酶的分类1.按照作用类型分类：（1）氧化还原酶：如过氧化氢酶、蔗糖氧化酶等；（2）转移酶：如葡萄糖转移酶、苹果酸转移酶等；（3）水解酶：如淀粉酶、脂肪酶等；（4）合成酶：如葡萄糖合成酶、胰岛素合成酶等；（5）异构酶：如磷酸烯醇式异构酶、谷氨酰磷酸转肉酰胺合成酶等；2.按照活性位置分类：（1）内质网酶；（2）线粒体酶；（3）叶绿体酶；（4）细胞壁酶；（5）胞质酶；3.按照化学性质分类：（1）氧化酶；（2）还原酶；（3）过氧化酶；（4）转移酶；（5）水解酶；（6）合成酶；4.按照底物分类：（1）葡萄糖类；（2）淀粉类；（3）蛋白质类；（4）脂肪类；（5）核酸类；三、酶的作用机制酶的作用机制是通过酶与基质形成复合物来参与生物化学反应的进行。
酶通过活性中心与底物结合，从而促进了底物分子的变换。
酶可能通过使底物分子的构象变化，也可能通过消除底物分子上所需的能量，从而加速反应的进行。
此外，酶还可以通过提出中间体，催化反应的进行，还可以通过改变底物之间的空间关系，加速反应的进行。
四、酶的特性1.酶具有高效性：酶作为生物体内的生物催化剂，具有高效的特点。
一般来说，酶的催化速度是非酶催化速度的百万倍。
这也正是酶能够在体温下促进生物化学反应的进行的原因。
2.酶具有专一性：酶对底物的专一性是指酶对特定的底物具有高度的选择性和专一性，能够使特定的底物与酶形成底物-酶结合物，从而进行特定的生物化学反应。
3.酶具有可逆性：在生物体内，酶所催化的反应通常都是可逆反应，在逆反应中，酶可以使用同样的底物进行逆反应，从而保持生物体内的动态平衡。
4.酶受到环境条件的影响：酶的活性受到环境条件（如温度、pH值等）的影响，一般情况下酶的活性在特定的温度和pH值下表现最佳。
《酶》 知识清单
《酶》知识清单一、酶的定义酶是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或 RNA。
酶的化学本质是蛋白质或 RNA，这一特点决定了酶具有不同于一般催化剂的独特性质。
二、酶的作用酶在生物体内发挥着至关重要的作用，几乎参与了所有的生命活动过程。
1、催化代谢反应酶能够加速生物体内的化学反应，使得原本需要在苛刻条件下才能进行的反应在温和的生理条件下迅速完成。
例如，消化酶能够帮助我们分解食物中的大分子物质，使其变成能够被吸收的小分子。
2、调节生理功能通过调节酶的活性和含量，可以控制生物体内的各种生理过程。
比如，某些激素可以通过激活或抑制特定的酶来调节细胞的代谢和功能。
3、参与物质运输一些酶参与物质的跨膜运输，帮助细胞摄取或排出所需的物质。
4、维持细胞结构和功能某些酶参与细胞结构的构建和维护，保证细胞的正常形态和功能。
三、酶的特性1、高效性酶的催化效率极高，通常比非催化反应高 10⁸ 10²⁰倍。
这使得生物体内的各种代谢反应能够快速进行，以适应生命活动的需要。
2、特异性酶对底物具有严格的选择性，一种酶通常只能催化一种或一类特定的化学反应。
这种特异性分为绝对特异性和相对特异性。
绝对特异性是指酶只作用于一种底物，产生一定的反应；相对特异性则是指酶作用于一类底物或一种化学键。
3、可调节性细胞可以根据内外环境的变化，通过多种方式调节酶的活性和含量，从而改变代谢的速度和方向。
4、不稳定性大多数酶是蛋白质，其活性容易受到多种因素的影响，如温度、pH 值、抑制剂等。
在极端条件下，酶可能会变性失活。
四、酶的分类根据酶催化反应的类型，酶可以分为六大类：1、氧化还原酶类参与氧化还原反应，如细胞呼吸中的脱氢酶。
2、转移酶类催化基团转移反应，例如甲基转移酶、氨基转移酶等。
3、水解酶类催化水解反应，如蛋白酶、淀粉酶等。
4、裂解酶类催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应或其逆反应。
5、异构酶类催化同分异构体之间的相互转化。
酶学-3-胰凝乳蛋白酶的催化机制
基础生物化学Basic Biochemistry
胰凝乳蛋白酶的催化机制
酶促反应的机制：中间产物学说
酶促反应的专一性：诱导契合学说
影响酶催化的机制：（临近和定向效应，张力作用，酸碱催化，共价催化，微环境效应）
蛋白质的结构
食物中蛋白质的消化
卵清蛋白（PDB ID: 1UHG
）氨基酸
胰凝乳蛋白酶
胰凝乳蛋白酶催化具有疏水基团的羧基肽键水解。
（切断多肽链中的芳香族氨基酸残基的羧基一侧）。
参与食物中蛋白质的消化过程。
His57
Asp102
Ser195
催化的活性部位
胰凝乳蛋白酶的活性中心由Ser195、His57和Asp102组成，它们构成一个电荷转接系统。
Ser195由于His57和Asp102的影响而成为很强的亲核基团。
催化的四
面体中间物的形成
催化形成的
四面体中间物的稳定
四面体过渡态的形成
底物的敏感键断裂，其中胺成分通过氢键与酶的His57咪唑基连接，底物的羧基部分酯化到Ser195的羟基上。
电荷转接系统从水中吸收一个质子，结果OH-立即攻击连在Ser195上的底物的羧基碳原子，释放产物。
胰凝乳蛋白酶催化机制总结
酶的活性部位Asp102 His57
Ser195
电荷转接系统
对肽键的亲核进攻
产物
氧阴离子洞
四面体过渡态
复合物的形成
肽键断裂
水解。
基因工程的酶学基础
切割方式
Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’ 位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。
粘性末端(cohesive ends):因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。
第二章 基因工程的酶学基础
从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶 从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内切核酸酶
按水解断裂核酸分子的方式:
核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。 特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase） 特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase） 非专一性酶，底物或者为DNA或者为RNA
主要特性
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点
双功能（具甲基化） 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列1kb处 随机性切割
单一功能 同源二聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列 识别序列内或附近特异切割
双功能（具甲基化） 异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游 24-26bp处 随机性切割
01
大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示
01
限制性内切酶的命名
如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。
第三讲 酶学基础
酶蛋白的结构
酶蛋白的结构和特征
酶的化学本质是蛋白质，因此也有一、二、三、四级结构 一级结构：化学结构，酶分子中氨基酸的排列顺序 肽键、二硫键 二、三、四级结构称为空间结构 二级结构：多肽链主链原子的局部空间排列，没有考虑它的 侧链的构象或与其他部分的相互关系。 螺旋结构（α,γ）和β-折叠 作用力为氢键，C＝O和NH均参与形成氢键
三级结构
在二级结构的基础上，肽链进一步转曲折叠而成。它是指单 一的多肽链或共价连接的多肽链中，所有原子在空间上的排 列。具有下述特征： a. 一条肽链往往通过螺旋结构、β-折叠、转角结构和无规卷 曲而形成紧密的三维球状结构。 不同分子可能有不同的螺旋度 一个分子可能含有不同的螺旋结构 螺旋结构之间、 β-折叠之间或螺旋结构和β-折叠之间是 无规卷曲 三维球状结构有利于把位于肽链各部分的活性基团密集在 一起形成酶的活性中心，赋予酶以催化活性和专一性
酶的辅助因子
有些酶仅由蛋白质组成：尿酶，溶菌酶等 有些酶不仅含有蛋白质组分，还含有非蛋白质组分，只有酶 蛋白和辅助因子结合形成的复合物（全酶）才有活性 酶蛋白：决定酶反应的专一性 辅助因子：传递电子或某些化学基团 酶的辅助因子主要是金属离子（如Fe2+, Fe3+, Cu+, Cu2+, Mn2+,Mn3+,Zn2+,Mg2+,K+,Na+,Mo6+,Co2+等） 以及有机化合物
酶活性中心的各基团在空间构象上的相对位置对酶 活性是至关重要的。 活性中心构象的维持依赖于酶分子空间结构的完整 性
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3. 二者的功能
酶蛋白
辅助因子
决定反应的专一性 决定反应的类型
种类多
种类少
如：乳酸脱氢酶 乳酸脱氢、NAD＋ 苹果酸脱氢酶 第1苹0页/果共86酸页 脱氢、NAD＋
二、酶的活性中心 （active center） 1.必需基团
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2.活性中心概念： 酶分子上必需基团在空间结构上彼此靠近，
③ 动力学特征 斜率不变、Vm减小、Km减小
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各种可逆性抑制作用的比较
作用特征 无抑制剂 竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制
与I结合的组分
动力学参数 表观Km 最大速度
林-贝氏作图 斜率 纵轴截距 横轴截距
Km Vmax
Km/Vmax 1/Vmax -1/Km
E
增大 不变
增大 不变 增大
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一、酶的分子组成 蛋白质部分＋非蛋白质部分＝结合酶 酶蛋白 ＋ 辅助因子 ＝ 全 酶
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1. 全酶的概念 酶蛋白与辅助因子结合形成的复合物，
只有全酶才有催化活性。
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2. 辅助因子（cofactor）
二者结合程度
辅基： 结合紧密 辅酶： 结合疏松
金属离子：维持构象、传递e、E和S
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一、酶促反应的特点 酶与一般催化剂共同点
❖反应前后没有质、量的改变 ❖用量少，催化效率高 ❖不改变化学反应的平衡点
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㈠ 高催化效率
活化分子：达到或超过反应能阈的分子 活化能：使低能分子达到活化状态所 需要的能量
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能 量
3、基因克隆的酶学基础-01
7、完全酶切和部分酶切
3.2 DNA连接酶与DNA 分子的体外连接 3.2.1 DNA连接酶：大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶
动物细胞和噬菌体
缺口（nick)
裂口（gap)
大肠杆菌及其它细菌
3.2.2 粘性末端的连接
用碱性磷酸 酶的脱磷酸 作用阻止线
S1 核酸酶在分子生物学研究中的主要用途是给RNA定位。
3.6.2 Bal 31 核酸酶与限制位点的确定 具有单链特异的核酸内切酶活性和双链特异的核酸外切酶活性。
应用Bal 31 核酸酶诱发 DNA分子的缺失突变
（a）质粒DNA分子，A区段是准 备诱发缺失突变的序列
（b）用Bal 31核酸酶不同时间长 度分别消化线性DNA分子 S1 核酸酶与RNA分子定位 反应条件：低水平Zn2+、最适pH值：4.0~4.3、NaCI浓度：
100mmol/L
S1 核酸酶的主要功能： ① 催化RNA和单链DNA分子降解成5′单核苷酸； ② 作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子 （单链区可小到一个碱基对）。
T4 多核苷酸激酶的交换活性
3.4.2 碱性磷酸酶（BAP、CIP)与 DNA脱磷酸作用
3.5 DNA 外切酶
核酸外切酶（exonucleases）：是一类从多核苷酸链的一 头开始按序催化降解核苷酸的酶。按作用特性的差异可分为 单链核酸外切酶（如exo I、 exo VII等 ）和双链核酸外切酶 （如exo III、λ exo等）。
（c）将带有另一种限制性内切酶 识别序列的衔接物连接到这些缺 失分子上并将它们环化起来
（d）新形成的环状质粒分子具有 新的限制性内切酶（Hind III）的 切点，其A区段有缺失
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习惯单位： 在实际使用中，结果测定和应用都比 较方便、直观，规定的酶活力单位，不 同酶有各自的规定，如：
①α-淀粉酶活力单位：每小时分解1g可溶性淀粉的酶 量为一个酶单位。（QB546-80），也有规定每小时 分解1mL2%可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一
②糖化酶活力单位：在规定条件下，每小时转化可溶性 淀粉产生1mg还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一
亲核基团攻击底物分子中具有部分正 电性的原子，并与之作用形成共价键 而产生不稳定的过渡态复合物，活化 能降低。
2）亲电催化 亲电基团：Zn2+ 、Fe3+ 、Mg2+ 等
(5) 金属离子催化作用
提高水的亲核性能 • 金属离子可以和水分子的OH-结合，使
水显示出更大的亲核催化性能。
电荷屏蔽作用
酶学基础三
1.1.5 酶促反应的机制 1. 酶－底物复合物的形成
(1)中间产物学说：
E+S k1
ES k2
E+P
k-1
(2) 酶与底物结合特点：
1）可逆的、非共价的结合；
2）底物只与酶的活性中心结合；
3）酶与底物结合是通过一种称为诱导契 合模式进行的。
定向效应
(2) “张力”和“形变”
1.3.酶活力的概念及其测定
（一）酶活力的概念及表示方积、浓度）来 表示，而常用酶催化某一特定反应的 能力来表示酶量，即用酶的活力表示 。
酶催化一定化学反应的能力称酶活 力，酶活力通常以最适条件下酶所催
2.酶活力的表示方法
活力单位：规定条件（最适条件）下
❖ 电荷屏蔽作用是酶中金属离子的一个重要功能。
• 多种激酶(如磷酸转移酶)的底物是Mg2+-ATP复合 物。
O
O
O
-O
POPO
-
-
O 2+ O
PO O-
CH2
O
A
Mg
H HH
H OH OH
1.1.6.酶催化机理的实例
(一)E的特点
胰凝乳蛋白酶: (EC3.4.4.5)
1.241个AA残基组成，分子量25000
形
成
共
结合底物
价
ES
复 合 物
His57 质子供体
C-N键断裂
水
氨基产
亲
物释放
核
攻
R-NH2
击
羧基产 物释放
四面体中间 物的瓦解
H2O
胰凝乳蛋白 酶催化反应 的详细机制
后续酶催化反应的某些缺点
1、 酶催化反应只能得到一种构型（L-型或D-型） 的光学产物；
• 2、酶常常存在着底物或产物抑制现象，造成反 应转化率降低，生产能力低等问题；
-N -SHH,
-CO - O..2 ,, ---S N,H
+
OHHN NH
广义氢的供体
O- :N NH
广义氢的受体
组氨酸的咪唑基：
（1） pI值约为6.7-7.1，在接近中性的 条件下，一半以广义酸的形式存在，另 一半以广义碱的形式存在，因而它既能 作为质子供体，又能作为质子受体，有 效地进行酸碱催化。
［总活力=比活力×总体积（总重量）］
（二）酶活力的测定
终点法: 酶反应进行到一定时间后 终止其反应，再用化学或物理方法测 定产物或反应物量的变化。
动力学法:连续测定反应过程中产 物\底物或辅酶的变化量，直接测定出 酶反应的初速度。
[P]
• 3、极端的pH、较高的温度和高盐浓度的反应体 系都可能使酶钝化，失去部分甚至大部分催化活 性；
• 4、大量的氧化还原酶、转氨酶等需要等计量反 应物的辅因子存在才能表现催化活性，从而限制 了它们在许多有机合成反应中的应用；
• 5、酶通常在水溶液中实施其催化活性，对于大 多数有机化学反应来说，使用的溶剂是非水溶性 的有机溶剂。
，一定时间内催化完成一定化学反应量所
需的酶量。
国际单位（U）:指在最适条件下，1
分钟内催化1微摩尔(umol)底物的酶量，或
是转化1微摩尔(umol)底物中的有关基团的
酶量。
1Kat = 6×107 U
Katal：指在最适条件下，每秒钟催化
1mol底物转化所需的酶量。简称Kat。
注意： 以上的酶单位定义中，如果底物（S） 有一个以上可被作用的化学键，则一 个酶单位表示1分钟使1μmol有关基 团转化的酶量。如果是两个相同的分 子参加反应，则每分钟催化2μmol底 物转化的酶量称为一个酶单位。 在“U”和“kat”酶活力单位的定 义和应用中，酶催化底物的分子量必 须是已知的，否则将无法计算。
（2）咪唑基供出和接受质子的速度很 快，其半衰期短，小于0.1毫微秒。所 以许多酶活性中心都有组氨酸残基。
酶分子中可作为酸碱催化的功能基团
(4) 共价催化
某些酶在催化过程中，能通过共价 键与底物结合成不稳定的酶-底物复 合物，这个中间产物很容易变成过渡 中间物，反应的活化能大大降低。
1）亲核催化 指酶分子中具有非共用电子对的
总活力单位
比活力=
= U(或IU) / mg蛋白
总蛋白mg数
实际应用中也用每单位制剂中含有的酶 活力数表示（如：酶单位/mL（液体制 剂），酶单位/g（固体制剂）），对同一 种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度 越高（含杂质越少）。
在评价纯化酶的纯化操作中，还有一个 概念就是回收率。
回收率=某纯化操作后的总活力/某 纯化操作前的总活力
③蛋白酶：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生 1μg
④DNA限制性内切酶：推荐反应条件下，一小时内可 完全消化1μg纯化的DNA所需的酶量。
3.酶的比活力
酶的比活力：是指单位重量的蛋白质 中所含的某种酶的催化活力，即每mg 蛋白所含的酶活力单位或每kg蛋白中 所含的Kat数。比活力是表示酶制剂纯 度的一个指标。
底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变 化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力” 甚至“形变” ，从而促使酶－底物中间产物进
入过渡态。
(3) 酸碱催化：
一般都是广义的酸－碱催化方式。
广义酸－碱催化是指通过质子酸提
供部分质子,或是通过质子碱接受部分
质子的作用，达到降低反应活化能的
过程。
+
-COOH3,,
2.专一性
AA－AA－AA－AA1 AA2－AA－AA－AA
N端
芳香族AA
C端
3.活性中心
Ser195, His57, Asp102，构成一个氢键
体系, His57成为桥梁。
（二）作用机理 1.通过电荷转移，使Ser有更强的亲核力； 2. 放出产物P1,N末端； 3. 形成产物P2， C 末端；
底物