酶学基础
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2基因工程的酶学基础
GCGC NarI BsaHI
GGCC
BbeI HaeII XbaI Bcl I
FspI
ApaI BanII
Bsp1286
T****A T****A NruI T****A T****A
EaeI MscI
GTAC **** **** **** **** A****T A****T A****T A****T A****T
② 不完全同裂酶： 识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
Xma I
Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
（6）同尾酶(Isocaudamers）
识别的序列不同，但能切出相同的粘性末 端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
特性 I类内切酶 II类内切酶 III类内切酶
限制和修饰 单一多功能的酶 活性 内切酶和甲基 共同亚基的双 化酶分开 功能酶
内切酶的蛋 3种不同的亚基 白结构 限制作用所 ATP、 Mg2+和SAM 需要的辅助 因子 寄主特异性 EcoB： 位点识别序 TGA(N)8TGCT 列 EcoK： AAC(N)6GTGC
BamH I Bgl Ⅱ
Bcl I Xho Ⅱ
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
U代表嘌呤；Y代表嘧啶。
Sau 3A
BfaI
DpnI
HinpI
HaeIII HhaI
生物化学中的酶学和代谢调节
生物化学中的酶学和代谢调节在生物化学中，酶是生物体内分子转化的催化剂。
酶的活性和稳定性对于维持生命活动至关重要。
生物体内的代谢作用也受到多种因素的调节，包括酶的磷酸化、酶的合成和降解等。
本文将对酶学和代谢调节进行探究。
1. 酶学基础酶是一种大分子催化剂，它能够加速化学反应的发生，但本身在反应过程中不被消耗。
酶结构多样，根据其化学性质和催化机理可分为如下几类：（1）氧化还原酶，如乳酸脱氢酶，它能够催化乳酸向丙酮酸的反应；（2）水解酶，如淀粉酶，它能够催化淀粉向糖的反应；（3）加合酶，如胰岛素，它能够催化葡萄糖向糖原的反应；（4）转移酶，如转移酶，它能够催化酰基向另一个化合物转移的反应。
酶的活性受到多种因素影响，包括温度、pH值、底物浓度等。
温度过高或过低均会影响酶的活性，常温下酶的活性最佳。
pH值也会对酶的活性产生影响，不同酶的最佳pH值也各不相同。
底物浓度的增加能够促进酶的活性，但过高的底物浓度反而会抑制酶的活性。
2. 酶的代谢调节酶的活性和稳定性受到多种因素的调节，包括酶的磷酸化、酶的合成和降解等。
（1）磷酸化磷酸化是常见的酶的调节方式之一。
磷酸化后的酶结构发生变化，从而影响其活性。
举例来说，当肝细胞内糖原的水解后，储存在细胞内的糖原酶会被磷酸化，从而失去活性。
当血糖水平降低时，胰岛素分泌减少，体内糖原水解停止，其储存的糖原酶脱磷酸还原至活性状态，这样可以保证糖原的储存。
（2）酶的合成和降解新的酶可以通过蛋白质合成过程进行合成。
当细胞内需要某种酶时，核酸可以被转录成相应的RNA，RNA再通过转译合成相应的蛋白质酶。
同时，当体内不需要某种酶时，可通过降解分解酶来维持体内代谢平衡。
例如，当饥饿状态下蛋白分解较大时，酪氨酸酶可以被分解，从而起到降解蛋白质的作用。
3. 酶缺失症酶缺失症是一种常见的代谢性疾病，其特点是体内缺乏某种酶，从而导致代谢异常。
常见的酶缺失症包括苯丙酮尿症和半乳糖血症等。
苯丙酮尿症是体内苯丙氨酸代谢缺陷造成的，如果不及时治疗，可能会导致智力低下和神经系统损伤，严重的甚至可能危及生命。
酶学与酶工程重点总结
酶学与酶⼯程重点总结第⼆章酶学基础⼀、酶的活性中⼼(active center，active site)（⼀）活性中⼼和必需基团1、与酶活性显⽰有关的，具有结合和催化底物形成产物的空间区域，叫酶的活性中⼼，⼜叫活性部位。
2、活性中⼼可分为结合部位和催化部位。
3、结合部位决定酶的专⼀性，催化部位决定酶所催化反应的性质。
4、酶结构概述（1）活性中⼼是⼀个三维实体。
（2）是有⼀些⼀级结构上可能相距较远的氨基酸侧链基团组成，有的还包含辅酶或辅基的某⼀部分基团。
（3）在酶分⼦表⾯呈裂缝状。
（4）酶活性中⼼的催化位点和结合位点可以不⽌⼀个。
（5）酶活性中⼼的基团都是必需基团，但必需基团还包括活性中⼼以外的基团。
5、酶分⼦中的氨基酸残基或其侧链基团可以分为四类1．接触残基2．辅助残基3．结构残基4．⾮贡献残基（⼆）酶活性中⼼中的化学基团的鉴别1．⾮特异性共价修饰：某些化学试剂能使蛋⽩质中氨基酸残基的侧链基团反应引起共价结合、氧化或还原修饰反应，使基团结构和性质发⽣变化。
如果某基团修饰后不引起酶活⼒的变化，就可初步认为此基团可能是⾮必需基团；反之，如修饰后引起酶活⼒的降低或丧失，则此基团可能是酶的必需基团。
2．亲和标记共价修饰剂是底物的类似物，可专⼀性地引⼊酶的活性中⼼，并具有活泼的化学基团(如卤素)，可与活性中⼼的基团形成稳定的共价键。
因其作⽤机制是利⽤酶对底物类似物的亲和性⽽将酶共价标记的，故称为亲和标记。
3．差别标记在过量底物或可逆抑制剂遮蔽活性中⼼的情况下，加⼊共价修饰剂，使后者只修饰活性中⼼以外的有关基团；然后去除底物或可逆抑制剂，暴露活性中⼼，再⽤同位素标记的向⼀修饰剂作⽤于活性中⼼的同类基团；将酶⽔解后分离带有同位素的氯基酸，即可确定该氨基酸参与活性中⼼。
4．蛋⽩质⼯程这是研究酶必需基闭和活性中⼼的最先进⽅法，即将酶蛋⽩相应的互补DNA(cDNA)定点突变，此突变的cDNA表达出只有⼀个或⼏个氨基酸被置换的酶蛋⽩，再测定其活性，可以知道被置换的氨基酸是否为活⼒所必需。
酶改性基本理论
蛋白类酶的分类原则
氧化还原酶(oxidoreductases) 转移酶(transferases) 水解酶(hydrolases) 裂合酶(lyases) 异构酶(isomerases) 连接酶(ligases)或合成酶(synthetases)
★★ 国际系统分类法及编号（EC编号）
Sidney Altman Yale University New
Haven, CT, USA
Cech和Altman各自独立地发现了RNA 的催化活性，并命名这一类酶为 ribozyme（核酶），2人共同获1989年 诺贝尔化学奖。
具有催化作用的 一类蛋白质 ——蛋白质酶类
有自剪切或催 化功能的核酸
※Koshland将酶分子的氨基酸残基分为四类： (1)接触残基：它们与底物接触、参与底物的 化学转变。此类氨基酸残基的一个或几个原 子与底物分子中一个或几个原子的距离都在 一个键距离 (1.5～2埃)之内。它们的侧链，起 与底物结合作用的称为结合基团；起催化作 用的称为催化基团。有时结合基团也参与催 化作用，不能绝对区分。这些残基中的一些 有时可能也起辅助残基的作用。
(4)非贡献残基： 除了上述三类酶的必需基团外，酶分 子上其余的氨基酸残基都可称为非贡献残基或非必需 基团。它们对酶活性显示不起作用，可以由其它氨基 酸残基代替，且在酶分子中占很大比例。
例如，木瓜蛋白酶的三分之二的氨基酸残基是非贡献
残基。当然，它们也可能在免疫、酶活性调节、运输
转移、防止降解、种系发育的物种专一性等方面起作
活性中心以外 的必需基团
结合基团
底物 催化基团 活性中心
酶活性中心示意图
S-S
底物
肽链
活性中心外 必需基团
酶学基础---酶的分子结构与催化功能
第二篇
酶学基础
第四章 酶的分子结构与催化功能
第一节 酶分子组成
单纯酶 酶 结合酶 （全酶）= 酶蛋白 + 辅因子
辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。 辅因子 辅基 与酶蛋白结合得紧密的小分子有机物。
金属激活剂 金属离子作为辅助因子。 蛋白质具有一级、二级、三级、四级结构以及大分子组 织形式。 酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分。 辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。
牛胰核糖核酸酶(RNA酶) 有4对二硫键及很多氢键维持 其空间构象; 活性中心中有两个组氨酸（His12及 His119）。用枯草杆菌蛋白酶处理，被水解成为N端的 ⒛肽(S肽)和其余的104肽(S蛋白)两个片段，分别含有 His12和His119，两者单独存在时均无活力，但在pH7.0的 介质中，将两者1:1混合，并使S肽与S蛋白间形成氢键 及疏水键连接，则20与21位之间的肽键虽不能恢复，但 活力能恢复。这是因为S肽上的His12又与s蛋白上的 His119互相靠近，恢复了原来活性中心的空间构象。
(二)必需基团
酶活性中心的一些化学 基团为酶发挥催化作用 所必需，故称为必需基 团。 在酶活性中心以外的区 域，也有不和底物直接 作用的必需基团，称为 活性中心外的必需基团。 这些基团与维持整个酶 分子的空间构象有关， 间接地对酶的催化活性 发挥作用。
Koshland将酶分子中的氨基酸残基或其侧 链基团分成四类：
第三节 酶催化作用的基本理论
有过各种酶催化学说。早期学说的中心思想是 底物的活化，到⒛世纪60年代，随着新技术的 发展，从而亦考虑到在催化反应中，酶本身功 能基团的作用。 酶在进行催化反应时，首先和底物形成ES络合 物，这样分子间的催化反应就变为分子内的催 化反应。
酶学基础
第四章 酶的分子结构与催化功能
第一节 酶分子组成
单纯酶 酶 结合酶 （全酶）= 酶蛋白 + 辅因子
辅酶 与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。 辅因子 辅基 与酶蛋白结合得紧密的小分子有机物。
金属激活剂 金属离子作为辅助因子。 蛋白质具有一级、二级、三级、四级结构以及大分子组 织形式。 酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分。 辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。
牛胰核糖核酸酶(RNA酶) 有4对二硫键及很多氢键维持 其空间构象; 活性中心中有两个组氨酸（His12及 His119）。用枯草杆菌蛋白酶处理，被水解成为N端的 ⒛肽(S肽)和其余的104肽(S蛋白)两个片段，分别含有 His12和His119，两者单独存在时均无活力，但在pH7.0的 介质中，将两者1:1混合，并使S肽与S蛋白间形成氢键 及疏水键连接，则20与21位之间的肽键虽不能恢复，但 活力能恢复。这是因为S肽上的His12又与s蛋白上的 His119互相靠近，恢复了原来活性中心的空间构象。
(二)必需基团
酶活性中心的一些化学 基团为酶发挥催化作用 所必需，故称为必需基 团。 在酶活性中心以外的区 域，也有不和底物直接 作用的必需基团，称为 活性中心外的必需基团。 这些基团与维持整个酶 分子的空间构象有关， 间接地对酶的催化活性 发挥作用。
Koshland将酶分子中的氨基酸残基或其侧 链基团分成四类：
第三节 酶催化作用的基本理论
有过各种酶催化学说。早期学说的中心思想是 底物的活化，到⒛世纪60年代，随着新技术的 发展，从而亦考虑到在催化反应中，酶本身功 能基团的作用。 酶在进行催化反应时，首先和底物形成ES络合 物，这样分子间的催化反应就变为分子内的催 化反应。
酶工程第一章 酶学基础知识
（2）相对专一性 一种酶可作用于一类化合物或一种化 学键，这种不太严格的专一性称为相对专 一性（relative specificity）。 例如： 脂肪酶可水解多种脂肪，而不管脂肪 分子是由哪些脂肪酸组成； 磷酸酯酶对一般的磷酸酯的水解反应 都有作用。
（3）立体异构专一性 酶对底物的立体构型的特异要求，称 为立体专一性（stereo specificity）。 如α-淀粉酶只能催化水解淀粉中α-1，4糖苷键，不能催化水解纤维素中的β-1， 4-糖苷键； L-乳酸脱氢酶的底物只能是L-型乳酸，而 不能是D-型乳酸。
3．酶活性的可调节性 酶是细胞的组成成分，和体内其他物 质一样，在不断地进行新陈代谢，酶的催 化活性也受多方面的调控。
例如，酶的生物合成的诱导和阻遏、 激活物和抑制物的调节作用、 代谢物对酶的反馈调节、 酶的变构调节及酶的化学修饰等， 这些调控作用保证了酶在体内的新陈 代谢中发挥其恰如其分的催化作用，使生 命活动中的种种化学反应都能够有条不紊、 协调一致地进行。
4．酶的不稳定性 酶的本质是蛋白质，酶促反应要求一 定的pH、温度等温和的条件。 因此强酸、强碱、有机溶剂、重金属 盐、高温、紫外线等任何使蛋白质变性的 理化因素都可使酶的活性降低或丧失。
第二节 酶的化学组成和结构
（－）酶的化学组成 1．酶的化学本质和化学组成 酶的化学本质是蛋白质，最直接的证 据是对所有已经高度纯化和结晶的酶进行 一级结构分析，结果都表明酶是蛋白质。
缬氨酸(Valine,Val,V)),
异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I),
苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F),
色氨酸(Tryptophan,Trp,W),
基因工程的酶学基础
DNA甲基化对酶活性的影响 •大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶 和Dcm甲基化酶。 •Dam可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上 引入甲基 •Dcm在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5 位置上引入甲基。 •部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切 割，如FbaI和MboI等。
通常有两种方法： ①选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA 识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化 影响； ②利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA 的制备，如E. coli & nbsp; JM110和链霉菌 等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲除，而 后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细 胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。
CATG
SAGE Tag 5
CATG
SAGE Tag 2
SAGE Tag 4
SAGE Tag 6
•II型限制性内切酶的酶切位点位于识别位点之中或
附近，产生以下4种情况。 ① 5’粘性末端；② 3’粘性末端；③ 平末端和 ④ 非互补的粘性末端 •无论DNA的来源如何，只要是使用同一种限制性内 切酶，所留下的残端都是一样的。 •经酶切后，5’端总是保留一个磷酸根；3’端总是 保留一个OH
第二讲 基因工程的酶学基础
本节内容
•限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 •DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 •核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 •核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 •核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 •核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 •其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、 检测等。
Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性
1.具有高度特异性的识别位点与酶切位点。 2.辅基： Mg++。 特定识别序列一般长4 - 8对碱基； 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；
酶的基础知识
团）。如胰蛋白酶，只专一的水解赖氨酸或精氨酸的羧基形成的
肽键。
—NH--CH—CO--NH—CH—CO—NH
R1
R2
Lys,Arg
立体异构（化学）专一性
１、旋光异构专一性 当底物具有旋光异构体时，酶只能作用于其中
的一种。
例如：淀粉酶只能选择性地水解D－葡萄糖形成的1，4 －糖苷键； L-氨基酸氧化酶只能催化L-氨基酸氧化.
2、酶作为生物催化剂的特性*
③酶易失活，要求温和的反应条件
凡能使蛋白质变性的因素如强酸、强碱、高温 等条件都能使酶破坏而完全失去活性。所以酶 作用一般都要求比较温和的条件如常温、常压 和接近中性的酸碱度。
酶促反应一般在pH 5-8 水溶液中进行，反应 温度范围为20-40C。
2、酶作为生物催化剂的特性*
寡聚酶中亚基的聚合，有的与酶的专一性有关，有的与 酶活性中心形成有关，有的与酶的调节性能有关。
3、 多酶复合体 multienzyme system
▪ 由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成，其中每一个 酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个 代谢途径或代谢途径的一部分。
▪ 分子量很高，在几百万以上。如丙酮酸脱氢酶复 合体、脂肪酸合酶复合体等。
国际生化学会酶学委员会根据酶所催化的反 应性质将酶分为六大类*：
氧、转、水、裂、异、合
分别用1、2、3、4、5、6表示
六大类酶*
国 1. 氧化-还原酶类
际 2. 转移(移换)酶类
系 统
3. 水解酶类
分 4. 裂合（裂解）酶类
类 5. 异构酶类
法 6. 合成酶类
1. 氧化-还原酶类 Oxido-reductases
(2)诱导契合学说(induced-fit hypothesis)
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3.若酶活性太高，底物全变清，则将血清用 Tris-HCL缓冲液做稀释再重做。 4.标准曲线绘制：
加入物 橄榄油（ml） Tris-HCL缓冲 液（ml） 1管 1.0 3.0 2管 2.0 2.0 3管 3.0 1.0 4管 4.0 0.0
浓度(umol)
0.17
0.34 0.51
0.68
计算：A1-A2之值查标准曲线，得水 解底物的umol数。 脂肪酶活性（U/L）=酶水解底物的量 （umol）×100÷0.05×稀释倍数 参考区间：≤7.9U
试剂： 1.纯化橄榄油：层析纯氧化铝（70-325筛孔） 10g，置于2cm×15cm层析拄中，使呈疏松 状及平整状态，缓缓加入AR级橄榄油18ml， 用橡皮球加压，层析除去游离脂肪酸，得到 无色透明的橄榄油约10ml,而氧化铝转成黄 色。 2.橄榄油乙醇液：2g橄榄油加入200ml乙醇。 3.Tris-HCL缓冲液（pH8.8）:称取Tris3g， 去氧胆酸钠6g，溶于蒸馏水中，稀释到1L， 用浓盐酸调至pH8.8。
酶分为结合酶和单纯酶，单纯酶由约 100~1000个氨基酸组成，结合酶由酶蛋 白（apoenzyme）,辅因子（cofactor）。 按结合的紧密程度分为辅酶（coenzyme 为结合疏松的辅酶）和辅基（prosthetic group,与酶结合紧密）。 酶的结构分一、二、三级，有些 还有四级结构。酶的催化能力与辅酶和 其本身的结构有关。
【试剂】 试剂成分和在反应液中的参考浓度： 咪唑 100mmol/L PH(37。) 6.5±0.05 肌酸激酶 30mmol/L ADP 2mmol/L EDTA 2mmol/L 醋酸镁 10mmol/L N-乙酰-L-半胱氨酸 20mmol/L
AMP 5mmol/L AP5A 0.01mmol/L D-葡萄糖 20mmol/L NADP 2mmol/L 己糖激酶（37。） 4000U/L 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（37。） 2800U/L 血清体积分数 0.0435(1:23)
已经证明，在测定CK开始时，当向反应混 合液加入底物（CrP）后，反应速率呈现一 个缓慢上升的延滞时相。在优化测定系统 中，典型的延滞时间为：25。C110s,39。 C90s,和37。C60s。这种现象具有重要的 实用意义，因为测定时间的不适当将引起 反应速率测定的不准确或测定值偏低。
生物发光方法比分光光度法更加灵敏，已 用于CK活性测定。在这些方法中，逆向反 应与荧光素或荧光素酶反应连接，反应如 下： 肌酸激酶+ADP→肌酸+ATP ATP+荧光素→AMP+氧化型荧光素+ppi+ 荧光 反应中所产生荧光的强度是测定酶活性的 依据。
原理：血清或血浆中α-淀粉酶催化分子中 α-1.4糖苷键水解，产生葡萄糖、麦芽糖 及含有α-1.6糖苷间支链的糊精。在底物 充足的情况下，反应后加入碘液与未被 水解的淀粉结合，生成蓝色的复合物。 其兰色的深浅与空白管比较，可计算出 淀粉酶的活力单位。
试剂： 1.0.4g/L缓冲淀粉液：9g氯化钠+22.6g无水磷酸 氢二钠+12.5g无水磷酸二氢钾，溶于500ml蒸馏 水中，加热煮沸。取0.4g可溶淀粉溶于10ml蒸馏 水，加入上述沸腾液体中，水洗小烧杯，一并倒 于沸腾液体。再加入5ml37%甲醛，蒸馏水调节 至1L。 2.0.1mol/L碘储存液：1.7835g碘酸钾+22.5g碘 化钾溶于400ml蒸馏水中，缓慢加入4.5ml浓盐酸， 边加边搅拌。蒸馏水稀释至500ml，充分摇匀。 棕色瓶储存2~4℃冰箱。 3.0.01mol/L碘应用液：取碘储存液，蒸馏水稀释 10倍。
【原理】 CK催化CrP 转变成Cr,同时ADP磷酸化成 ATP, 然后进行酶偶联反应。反应式如下： 肌酸激酶+ADP →肌酸+ATP ATP+葡萄糖 →葡萄糖-6-磷酸+ADP 葡萄糖-6-磷酸+NADP++→6-磷酸葡萄糖 +NADPH+H+ 上述反应式中，第一步CK反应产生ATP，用 HK/G6PD(己糖激酶/葡萄糖--磷酸脱氢酶)偶 联反应，最终使NADPH，可在340nm波长进 行监测。
【计算】 CK(U/L)=△A/min ×106/6220×2.3/0.1=△A/min×3698 式中，2.30为反应液的总体积;0.10为血清用量， 血清占反应液的体积分数为0.04348；6220为 NADPH在340nm波长的摩尔吸光度；△A/min为 平均每分钟吸光度变化值。 【参考区间】 性别不同，参考区间有差别。37。C，健康成年 男性：38～174U/L;健康成年女性：26～140U/L。
2.本法线性至少可达3000U/L，高于此值的 标本应用150mmol/L氯化钠溶液稀释后再 测，但是，由于血清中的抑制物质也被稀 释，稀释后标本的测定结果较高，如1：2 稀释血清的测定结果比原血清的测定结果 约高10%。所以，最好用已知CK值得正常 血清作稀释剂。
3.试剂空白速率(△A/min)应小于0.001，即 小于3.7U/L。所谓试剂空白速率，即用蒸 馏水代替血清，按照CK测定操作步骤进行 测定所得的测定值。 4.EDTA可防止NAC由于二价离子催化发生 的氧化，有利于试剂的稳定。 5.血清Ca2+ 是Mg 2+ 的竞争性抑制剂， 加入2mmol/L的EDTA可消除Ca2+ 的影响； 当Mg 2+ 为10mmol/L时，虽与EDTA结合， 但不影响对CK的激活。
2.3mmol/LNADP,4000U/L HK,2300U/L G6PD,pH6.5,37。C)取128mmol/L咪唑醋酸盐缓 冲液90ml，加98mgADP，211mgAMP， 1.1mgAP5A,414mgD-葡萄糖，181mgNADP(二 钠盐)及375mgN-乙酰半胱氨酸（ NAC）溶于适 量蒸馏水中，用1mmol/L醋酸调节至pH6.7(25。 C)或pH6.59（37。C),再加260～290U的HK及 175U的G6PD，以蒸馏水稀释到100ml。2溶液在 340nm波长，比色杯光径1.0cm，吸光度应小于 0.350A。在6。C可稳定5天，室温仅稳定30h。
6.红细胞及几乎所有组织中含有腺苷酸激酶(AK), 催化如下反应。 2ADP→ATP+AMP 上式反应中所生成的ATP，可导致表现CK活性增 加。氟化物、AMP及AP5A抑制AK活性。氟离子 与镁离子形成不溶性的MgF2,故不宜用氟化物作 为抑制剂。AMP是AK的竞争性抑制剂。AP5A竞 争性抑制肌肉及红细胞的AK,对肝及肾的AK抑制 很小。5mmol/L AMP与10umol/L AP5A合用，能 有效地抑制红细胞和肝细胞的AK。
【操作】 主要分析参数： 温度 37。C 波长 340nm 比色杯光径 1.0cm 孵育时间 180s 延滞时间 120s 监测时间 120s 吸光度读数点 ≥6 取适量的应用试剂I和应用试剂II置于37。C水浴 中，使温度达到37。C，按照下表所示操作。
CK测定操作步骤 2.00ml 应用试剂I(温度平衡至37。C) 0.10ml血清（充分混匀，孵育180s，反应 温度必须达到37。C） 0.20ml应用试剂II(反应启动试剂)，充分混 匀，等待120s(延滞时间)，检测吸光度变化 120s，吸光度读数点≥6
酶的作用是通过与底物结合形成一种 或几种中间复合物来减低反应的活化能 来实现的。酶的反应可用米-曼氏方程表 示： k1 k2 E + S
→
ES
→
E + P
k-1 酶 底物 酶底物复合物 酶 产物 酶促反应的因素主要有酶浓度、 底物浓度、PH、电解质、辅酶、激活剂、 抑制剂。
临床上主要测定的酶多存在于血清， 故习惯于称血清酶，包括ALT、AST、 GGT（r-GT） 、ALP、CHE、CK、LDH、 AMY、LPS等。 淀粉酶（amylase，AMS）测定
3、应用试剂II(345mmol/LCrP) 称取1.25gCrP(二 钠盐)，用蒸馏水溶解并稀释到10ml。此溶液在 340nm波长，比色杯光径1.0cm，吸光度应小于 0.150，在4。C可稳定3个月。 【仪器】 全自动生化分析仪或窄带宽分光光度计，具有 （37±0.2）。C恒温比色杯室，波长可调至339 或340nm，并可自动监测吸光度的变化和计算酶 活性单位等功能。
湖南省人民医院检验科——吴意
以前一直认为，酶（enzyme）是能 催化生物体内化学反应的一类特殊的蛋 白质，除蛋白质的一些性质外，它还有 高催化效率、高特异性、可调节性的显 著特点。 现在的研究表明，酶除有绝大部 分由蛋白质组成外，还有少量由核酸分 子组成，这些核酸分子称为核酶 （ribozyme）,主要参与RNA的加工和成 熟。
淀粉酶操作步骤：
加入物（ml） 缓冲淀粉液 37℃预温5分钟 测定管（U） 1.0 空白管（B） 1.0
稀释血清
0.2
混匀，37℃水浴7.5分钟 碘应用液 蒸馏水 1.0 6.0 1.0 6.0
混匀，660nm波长比色，读取各管吸光度。
计算： 淀粉酶单位=（AB-AU）×800÷AB 参考区间： 血清:80-180U/L；尿液:100-1200U/L。 临床意义： 急性胰腺炎8-12小时血清AMS升高，1224小时达高峰，2-5天下降，超过500U/L 有诊断意义。达350U/L是可疑。
1、128mmol/L咪唑醋酸盐缓冲液（PH8.0，25。 C ,内含12.8mmol/L醋酸镁，2.55mmol/L EDTA） 称取8.72g咪唑，溶于约950ml蒸馏水中，加 0.95gEDTA2Na及2.75g醋酸镁，待完全溶解后， 用1mmol/L 醋酸调节至pH8.0(25。C),稀释至1L， 置4。C可稳定2个月。 2、应用试剂I(115mmol/L咪唑醋酸， 2.3mmol/LEDTA,11.5mmol/L醋酸镁，23mmol/L N-乙酰半胱氨 酸,2.3mmol/LADP,5.8mmol/LAMP,11.5umol/L Ap5A,23mmol/LD-葡萄糖，