高通量筛选和鉴定具ACC脱氨酶的细菌

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滨海盐碱地产ACC脱氨酶细菌的筛选及根际促生研究

滨海盐碱地产ACC脱氨酶细菌的筛选及根际促生研究作者：姚强董晓霞宫志远辛寒晓孙中涛王梅韩建东刘盛林黄春燕张元祺来源：《山东农业科学》2020年第02期摘要：为探究山东省滨海盐碱区生态环境改良方式，从盐碱土壤中筛选具有耐盐活性的产ACC脱氨酶菌株。

以ACC为唯一氮源富集筛选目标菌株并对其产酶活力、耐盐碱性、生理生化特性、对小麦种子发芽的促生作用等方面进行检测研究。

结果显示，zhs2和zhs3菌株酶比活力分别可达0.3167 U/mg和 0.2800 U/mg。

筛选出的5个菌株均可耐受pH=9的环境，抗盐碱特性比较突出。

初步鉴定，zhs1和zhs3与假单孢菌属Pseudomonas特征相符，zhs2、zhs4、zhs5菌株与芽孢杆菌属Bacillus特征相符。

用5个菌种悬浮液浸种对盐胁迫下的小麦种子发芽有良好的促生作用，其中zhs2的小麦相对根长、相对芽长分别比对照平均提升26.19、20.08个百分点;zhs3比对照分别提升22.29、24.77个百分点。

关键词：ACC脱氨酶;耐盐碱;筛选;分离;酶活中图分类号：S154.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2020）02-0054-05Abstract In order to explore the ecological environment improvement methods of the coastal saline-alkali area in Shandong Province， the active salt-tolerant bacteria strains with ACC deaminase production were screened from saline-alkali soil. The target strains were screened with ACC as the only nitrogen source， and their enzyme activity， salt and alkali resistance， physiological and biochemical characteristics， and promotion on wheat germination were studied. The results showed that the specific activities of zhs2 and zhs3 strains were 0.3167 U/mg and 0.2800 U/mg， respectively. All the five screened strains could withstand the environment of pH=9， so their salt and alkaliresistant characteristics were more prominent. Preliminary identification showed that zhs1 and zhs3 belonged to Pseudomonas， and zhs2， zhs4 and zhs5 belonged to Bacillus. The five strains had better promoting effects on the germination of wheat seeds under salt stress. The relative root length and sprout length of wheat averagely increased by 26.19 and 20.08 percentage points if soaked with zhs2， while those increased by 22.29 and 24.77 percentage points if soaked with zhs3.Keywords ACC deaminase; Salt tolerance; Screening; Separation; Enzyme activity土壤中存在許多种微生物菌群，它们对自然生态环境的资源分配、转换和循环起着不可替代的作用[1]。

ACC脱氨酶基因的检测和有ACC脱氨酶细菌的应用研究(可编辑)

ACC脱氨酶基因的检测和有ACC脱氨酶细菌的应用研究（可编辑）ACC脱氨酶基因的检测和有ACC脱氨酶细菌的应用研究洳专:、硕士学位论文指导教师塞土里亘熬拯’,独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得浙婆太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

日学位论文作者签名: 签字目期: 年月学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解有关保留、使用学位论文的规定,浙江太堂有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。

本人授权逝鎏太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

保密的学位论文在解密后适用本授权书导师签名:学位论文作者签字日期:?乃年厂月巧日签字日期:易学位论文作者毕业后去向:电话:工作单位:通讯地址: 邮编:致谢这篇论文是在导师安千里副教授的悉心指导和热情关怀下完成的。

回顾攻读硕士学位的这三年的时间,安老师对我的学和生活给予了极大的关怀和帮助。

他为我的研究工作创造了良好的条件,从论文的选题、实验设计、实验进展、开题报告、读书报告到论文的撰写与修改,无不凝聚了安老师辛勤的汗水和心血。

安老师为人平易近人,豁达开朗,治学严谨,具有高尚的人格情操。

对待学术工作更是兢兢业业,一点业不马虎。

这种精神使我终生受益,时刻鞭策和激励着我。

在这三年的时间当中,我的各方面能力都得到了提高。

我相信安老师对我的积极影响将会一直陪伴着我。

值此论文完成之际,谨向我的导师安千里表示由衷的敬意和谢意同时,我还要感谢生物所的各位老师的教导和帮助,尤其是梁五生副教授和毛碧增副教授。

感谢我的德育导师谢艳老师和刘小红老师,你们在我攻读学位期间对我提供了诸多帮助和关照,是我顺利完成学业的坚强后盾。

盐穗木根际产ACC脱氨酶耐盐菌株的筛选及鉴定

doi：10.11838/sfsc.l673-6257.20057盐穗木根际产ACC脱氨酶耐盐菌株的筛选及鉴定王伟楠，兰智勇，喻文丽，孙庆培，李佩琪，樊永红”（新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046）摘要：从新疆五家渠103团盐碱地盐穗木根际的3份土样中筛选出10株产ACC脱氨酶的菌株，通过对这10株菌株的ACC脱氨酶活性和耐盐能力的测定，结果显示其中有4株菌株ACC脱氨酶活性较高，且能在盐（NaCl）浓度12%生长。

根据ACC脱氨酶活性以及耐盐性能的测定结果，选择W5、W8、W9这3株菌株进行鉴定，通过生理生化实验、Biolog鉴定、16S rDNA测序分析后，鉴定结果显示W5、W8为乳酪短杆菌（Brevibacterium casei）, W9为普沙根瘤菌（Rhizobium pusense）o关键词：盐穗木；耐盐细菌；ACC脱氨酶；植物根际促生菌；菌种鉴定盐穗木（Halostachys caspica）是藜科盐穗木属的一类盐生、旱生多汁半灌木，对盐分适应性极强，贮水组织发达，是荒漠、半荒漠的主要植物之一［1］O1-氨基环丙烷-1-竣酸（ACC）是乙烯生物合成的直接前体。

ACC脱氨酶可以将根部的ACC 分解成a-丁酮酸和氨，降低了在高盐碱度⑦a、旱［5一6］、水涝⑺、重金属污染⑻等非生物胁迫条件下植物所产生乙烯的含量。

因此，用产ACC脱氨酶的植物根际促生菌（PGPR）接种可促进在胁迫条件下的植物生长。

目前，国内外关于产ACC脱氨酶细菌的研究,主要集中在产ACC脱氨酶菌株的筛选及鉴定［9-11］,产ACC脱氨酶微生物对促进植物在逆境胁迫（盐碱胁迫、干旱胁迫、重金属污染等）下生长的能力和定殖情况炉釘，以及控制ACC脱氨酶合成的基因及相关转基因技术的应用［⑵等方面。

独特的自然地理环境，使新疆成为了典型的干旱地区和盐碱地的重发区。

如何更有效地利用并治理盐碱地，已成为新疆农业发展的重要任务。

贵州喀斯特地貌具ACC脱氨酶活性细菌种群资源的研究

贵州喀斯特地貌具ACC脱氨酶活性细菌种群资源的研究贵州喀斯特地貌是中国西南喀斯特区的中心部位,其土壤发育独特、生态环境也很脆弱。

独特的生态系统使其可能蕴藏着对环境胁迫适应性更强的有益微生物种群,这些微生物对喀斯特土壤的退化修复有着重要作用。

1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶能够降解乙烯前体,从而有助于植物生长,具有ACC脱氨酶活性的细菌具有植物促生作用。

本研究采集了贵州省5个典型喀斯特地貌区域的159份土壤。

首先,测定了土壤的各项理化性质并用稀释涂布法统计土壤可培养细菌数量,并探究土壤性质对土壤可培养细菌的影响。

然后,从土样中分离鉴定具ACC脱氨酶活性的细菌,从数量分布、种属特征、菌落形态、革兰氏染色、生理生化和酶活等方面对这些有益微生物资源进行了研究。

最后,初步探究酶活最高菌株AL30ADF120对不同水分条件下苗期玉米的促生效果。

结果如下:(1)5个地区的矿质元素含量表现相似,最多的都是铁元素,其次是钙和钛;土壤酸碱度都基本呈中性;土壤含水量整体偏低,均值为16.9%,具体表现为织金>坡岗>安龙>兴义>清水河;土壤有机质含量,有机质含量均值为14.8%,具体表现为坡岗>安龙>兴义>清水河>织金;细菌数量坡岗、清水河、安龙、织金、兴义的细菌数量依次为 6.88×106 cfu/g、2.89×105cfu/g、4.47×109cfu/g、9×104cfu/g、4.44×108cfu/g;坡岗地区土壤P元素和有机质含量与土壤细菌数量呈显著正相关,总体而言,土壤Rb元素含量和海拔对土壤的细菌数量呈显著正相关。

(2)分离纯化保存了 500株产ACC脱氨酶细菌,其中188株测得了16S rDNA 序列,NCBI比对显示分属14个属,共63个种。

具有ACC脱氨酶活性的绞股蓝内生细菌的分离鉴定及其抑菌促生作用

张缇，吾鲁木汗・那孜尔别克，龚凤娟，恩特马克・布拉提白，
４１６０００；２伊犁师范学院化学与生物科学学院，新疆伊宁８３５０００）
（１．吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首
摘
要
采用富集筛选法从绞股蓝根中筛选得到６株具有ＡＣＣ脱氨活性的细菌，其中茵株ＪＤＧ－６、ＪＤＧ－７、
Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａｐｅｎｔａｐｈｙｌｌｕｍａｄｏｐｔｅｄｗｉｔｈｅｎｉｒｃｈｍｅｎｔｍｅｔｈｏｄ，ａｍｏｎｇｔｈｅｍｓｔｒａｉｎｓＪＤＧ－６，ＪＤＧ－７，ＪＤＧ一１４，ＪＤＧ・１６ａｎｄＪＤＧ一２３ｈａｄｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｔｏｅｘｃｒｅｔｅｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ，ｂｕｔｓｔｒａｉｎＪＤＧ一３２ｈａｄｎｏｔ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｍｉｃｒｏｂｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｓｓａｙ
ｔｅｓｔｅｄｏｒｇａｎｉｓｍ，ａｍｏｎｇｔｈｅｍｓｔｒａｉｎＪＤＧ一１４ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＥ．ｃｏｌｉ，Ｓａｒｃｉｎａｌｕｔｅｓ，ａｕｎｄＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｓ．ＴｕｈｅｒｏｇｗｔｈｅｘｐｅｉｒｍｅｎｔｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔａｌｌｓｔｒａｉｎｓＪＤＧ－６，ＪＤＧ－７，ａｎｄＪＤＧ一１４ｃｏｕｌｄｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｒｏｏｔｅｘｔｅｎ — ｓｉｏｎｏｆｒｉｃｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓ，ｅｓｐｅｃｉｌｌａｙｓｔｒａｉｎＪＤＧ－１４ｔｈｅｇｒｏｔｈｗｐｒｏｍｏｔｉｏｎｗａｓａｍｏｎｇｔｈｅｍｏｓｔ，ｗｉｔｈｔｈｅｒｏｏｔｌｅｎｇｔｈｉｎ —

具有ACC脱氨酶活性促生细菌的筛选、鉴定及其接种效应研究

具有ACC脱氨酶活性促生细菌的筛选、鉴定及其接种效应研究本研究从西北地区旱地成年枣树植株根际土壤以及根内分离筛选出具有ACC(1-氨基环丙烷-1羧酸)脱氨酶活性的促生细菌,采用形态学特征、生理生化指标和16S rDNA基因序列同源性分析等方法对菌株进行鉴定,并将具有高效ACC 脱氨酶活性的促生菌回接至1年生红枣(Zizyphus jujuba)嫁接苗,研究干旱胁迫下菌株对植株生长和生理特性的影响,探讨菌株提高植株耐旱的作用机制,获得的主要研究结果如下:1.利用以ACC为唯一氮源的培养基,对西北地区旱地成年枣树植株根际及根内细菌进行分离、筛选,获得18株具有较高ACC脱氨酶活性的细菌,其ACC脱氨酶活性在4.13~2820μmolα-KA/(mgPr·h)之间。

同时,分别以比色法、液体振荡培养法和固氮培养基对所得菌株进行促生特性的测定,表明所得菌株产生的IAA的浓度为0~41.51μg/mL,有效磷含量为3.13~534.86μg/mL,且基本均具有固氮能力。

2.根据菌落形态、生理生化及其16S rDNA分子鉴定,确定所得菌株分别为普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、Pseudomonas koreensis、Pseudomonas brassicacearum、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、Pseudomonas lini、Pseudomonas taiwanensis、Bacillus filamentosus。

3.采用天然耐药性标记法对筛选出的促生菌株G3(Pseudomonas koreensis)、G8(Pseudomonas brassicacearum)和N5(Bacillus filamentosus)进行标记,得到稳定的抗药性突变菌株。

通过盆栽试验,研究3株标记菌株在枣树根际的定殖情况。

具ACC脱氨酶活性大豆根瘤内生菌的筛选、抗性及促生作用

DF盐培养基(1 L): MnSO4·7H2O 0.2 g, KH2PO4 4.0 g, Na2HPO4 6.0 g, 柠檬酸2.0 g, 葡萄糖 2.0 g, 葡萄糖酸钠2.0 g, 组分一与组分二溶液各取 0.1 mL, H2O 1000 mL, pH 7.2。(组分一的配方： CuSO4·5H2O 78.22 mg, MoO3 10 mg, H3BO3 10 mg, ZnSO4·7H2O 124.6 mg, MnSO4·H2O 11.9 mg, 以上溶解于100 mL无菌蒸馏水中。组分二的配方： FeSO4·7H2O 100 mg, 将其溶于10 mL已灭菌的蒸馏水中，充分振荡。注：组分一和组分二均置于4 °C保存备用。)
ADF培养基：把ACC溶于超纯水，用细菌过滤器过滤灭菌，加入到不含有(NH4)2SO4且预先灭菌的DF盐培养基中，pH 7.2。ACC添加的终浓度为3.0 mmol/L。
1.2 ACC 脱氨酶活性菌株的筛选
将冰箱中保藏的菌株活化后，参照文献[15–16]
ac16, 56(6)
关键词：ACC脱氨酶, 根瘤内生菌, 抗性, 系统发育, 促生作用
工业化肥大量施用和盐碱化面积不断扩增，造成我国农田大面积土壤板结、环境污染以及投资成本增大等系列问题，严重影响土壤微环境生态平衡和农作物健康生长[1]。植物根际蕴藏丰富的微生物资源，对这些资源进行开发和利用为解
决上述问题提供了新的思路。一些根际微生物代谢产物如ACC脱氨酶，可增强宿主植物吸收养分、提高抗逆性和促进植物生长，还兼有抗病原微生物效应及联合修复功能，达到农业增产、生物防治和环境治理效果[2]。因此，筛选和研究
1.3 ACC 脱氨酶活力测定
1.3.1 绘制α-丁酮酸标准曲线：利用0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液，配制100 mmol/L的α-丁酮酸母液。将该浓度的母液稀释为10 mmol/L的α丁酮酸溶液，将其加入试管中，用0.1 mol/L TrisHCl缓冲液(pH 8.5)补加至1 mL, α-丁酮酸浓度范围为0.024–0.293 µmol/mL。以吸光度值(OD540)为纵坐标，以α-丁酮酸的浓度(mmol/L)为横坐标绘制标准曲线。 1.3.2 ACC脱氨酶比活力计算：参照Bradford 法[17]比色测定细胞提取液中总蛋白质含量，以牛血清白蛋白作为标准物，绘制牛血清白蛋白标准曲线。参考Saleh等[18]的方法，以反应体系中每毫克菌体蛋白酶每小时催化ACC脱氨生成 α-丁酮酸

ACC脱氨酶基因的检测和有ACC脱氨酶细菌的应用的开题报告

ACC脱氨酶基因的检测和有ACC脱氨酶细菌的应用的开题报告一、研究背景ACC脱氨酶（1-Aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase，ACCD）是一种可以在细菌中产生的酶，它可以将植物引起的乙烯合成前体ACC转化为无害的α-氨基丙烷酸，从而减少植物中的内源性乙烯含量。

因此，ACCD可以被广泛应用于农业生产和环境保护领域。

近年来，研究人员对ACCD基因进行了广泛的研究和开发，开发了一些能产生ACCD酶的细菌，这些细菌可以应用于农业生产中，如提高作物产量、促进植物生长和增强植物的抗逆能力等。

因此，ACCD基因及其产生的酶在农业生产和环境保护中具有广泛的应用前景，对其进行研究、检测和开发具有重要的意义。

二、研究目的本研究旨在通过检测ACCD基因，筛选出可以产生ACCD酶的细菌，并探讨这些菌株在农业生产中的应用价值，为提高作物产量和保护环境提供有益思路和方法。

三、研究内容和方法（1）检测ACCD基因利用PCR技术检测细菌中的ACCD基因，提取菌株总DNA，PCR反应条件为：94℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min45s，共30周期。

PCR反应产物通过凝胶电泳检测，筛选出能够产生ACCD酶的细菌。

（2）制备ACCD酶对于检测出能够产生ACCD酶的菌株，可在含10 g/L酪蛋白、5 g/L 氯化钠、5 g/L酵母提取物的LB培养基中进行预培养，然后在含1mmol/L ACC的培养基中培养24~48 h，通过蛋白质电泳确认酶活性。

（3）应用实验将制备好的ACCD酶应用于番茄、辣椒、黄瓜和甜菜等作物的生长，观察作物的发育情况，比较应用ACCD酶前后的生长差异和产量变化。

四、研究意义和预期结果本研究通过检测ACCD基因和制备ACCD酶，筛选出能够产生ACCD 酶的细菌，并探讨这些菌株在农业生产中的应用价值。

预计结果将为提高作物产量和保护环境提供有益思路和方法，对于加强农业生产和环境保护有重要的推动作用。

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高通量筛选和鉴定具ACC脱氨酶的细菌
植物在遭受胁迫时产生乙烯。

高浓度乙烯抑制植物生长。

具1-氨基环丙烷-1羧酸(ACC)脱氨酶的细菌能通过降解乙烯合成前体ACC
而降低植物产生乙烯的水平。

在恶化的农田生态下,接种具ACC脱氨酶的细菌往往比接种具其他促植物生长特性的细菌,如固氮菌,更易产生促植物生长的效应。

于是,本研究致力于从固氮菌和能在无氮培养基上生长的细菌中筛选具ACC 脱氨酶的细菌并应用于农作物生产。

分离具ACC脱氨酶细菌通用的方法是用以ACC为唯一氮源的基本培养基来筛选,但对于能在无氮培养基上生长的细菌,这
种筛选方法显然不够灵敏。

而对于从大量能在无氮培养基上生长的细菌中筛选具ACC脱氨酶的细菌则需要新的高通量筛选方法。

本研究以乙二醇为溶剂加入抗坏血酸配制茚三酮试剂,在沸水浴上加热聚丙烯96孔烟囱型PCR板中的反应液,测定反应后液体在570 nm 处的吸光值计算ACC的浓度,建立了高通量的茚三酮-ACC比色法用于测定细菌对ACC的消耗。

接着,以43个从甘蔗分离的固氮菌和68个从玉米分离的能在无氮培养基上生长的菌株为材料,快速筛选到6个能消耗ACC的细菌,用2,4-二硝基苯肼比色法检测证实这6个菌株都具有ACC脱氨酶活性。

因此,高通量茚三酮—ACC比色法适合高通量筛选具ACC脱氨酶活性细菌。

用该法进一步从153个从甘蔗分离的能在无氮培养基上生长的菌株和268
个从水稻或东南景天分离的能在以ACC为唯一氮源的基本培养基上生长的菌株中筛选出52个具ACC脱氨酶活性的细菌。

在分子水平鉴定具ACC脱氨酶的细菌是通过用简并引物扩增ACC脱氨酶结构基因acdS或用DNA杂交检测acdS。

已发表的研究往往参考少数菌株的acdS序列设计了简并引物,扩增特异性差,还不如菌落杂交有效；而菌落杂交也需要针对不同类型的acdS用相应类型的探针,探针的广谱性弱。

本研究根据ACC脱氨酶的蛋白结构、氨基酸保守性分析及其与同源蛋白D-半胱氨酸脱巯基酶在结构上的区别,用CODEHOP法则设计了广谱特异的acdS简并引物：CodehopACCf1、CodehopACCf2、CodehopACCf3和CodehopACCr,并成功扩增得到所有58株具ACC脱氨酶细菌的acdS基因片段,实现了在分子水平高通量鉴定具ACC脱氨酶的细菌。

在这58株细菌的acdS基因片段中,有一些归于新的acdS类群。

而且,通过构建所有已知具有ACC脱氨酶活性细菌的acdS和相应16S rDNA的系统进化树揭示了acdS存在广泛的基因水平转移现象。

本研究还对从玉米和水稻分离筛选的43株具ACC脱氨酶细菌的多种促植物生长特性包括分泌IAA、固氮、溶磷、分泌嗜铁素和拮抗病原真菌做了分析,发
现这些细菌还具有一种以上其他促植物生长的特性,显示出促植物生长的应用潜能。

其中16株伯克氏菌不仅能解磷和分泌嗜铁素,而且具有广谱的拮抗病原真菌的能力,但这些伯克氏菌在亲缘关系上与包含机会致病菌的洋葱伯克氏菌群接近。

虽没有从这些伯克氏菌中检测到BCESM致病因子,但多数菌株对洋葱有害。

基因水平转移acdS有可能使病原菌具有了ACC脱氨酶。

因此,在应用具ACC脱氨酶活性细菌促植物生长时,要严格检测菌株可能存
在的致病性。