经典 PCR 技术
PCR技术的原理与方法
PCR技术的原理与方法PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，用于在体外扩增DNA序列。
它由美国生物化学家科里斯·莫利什（Kary Mullis）在1983年发明，并于1993年获得诺贝尔化学奖。
PCR技术能够快速、高效地扩增DNA，因此广泛应用于基因工程、疾病诊断、法医学和生物学研究等领域。
PCR的原理基于DNA的体外扩增，需要以下几个关键的成分和步骤：1.DNA模板：PCR需要一段待扩增的DNA模板，可以是从细菌、植物、动物或人类的细胞中提取的DNA。
2.引物：PCR需要两个短的DNA引物，用于标记待扩增的DNA序列的起始和终止点。
引物是通过序列特异性的DNA合成的，与待扩增的DNA序列在起始和终止点上有互补配对。
3. DNA聚合酶：PCR需要一种DNA聚合酶，可以是常用的热稳定的DNA聚合酶Taq聚合酶。
聚合酶能够将新的DNA链合成到已有的DNA链上。
PCR的方法步骤如下：1.反应体系准备：将PCR反应所需的试剂和溶液组装在一起。
包括DNA模板，两个引物，聚合酶，缓冲液和反应液添加剂（如dNTPs和镁离子）等。
2. Denaturation（变性）：将反应体系加热到92-98摄氏度，使DNA双链解开为两条单链。
这个步骤可以通过热循环反应器中的高温来实现。
3. Annealing（退火）：将反应体系降温至50-65摄氏度，使引物与待扩增的DNA序列的起始和终止点互补配对。
这个温度较低可使引物在模板上定向结合。
4. Extension（延伸）：将反应体系升温至72摄氏度，使聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这个步骤需要在确保聚合酶活性的情况下进行，不同的DNA聚合酶需要不同的温度和时间。
5.重复反应循环：以上三个步骤组成了一次PCR循环，在一个PCR反应中，可以执行数百到数千个循环，每个循环将DNA扩增一倍。
这样重复循环可以扩增出大量的DNA。
通过PCR，可以在几小时内从极少量的DNA模板中扩增出足够的DNA。
pcr技术有几种
PCR技术有几种PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，其原理和过程都非常重要。
PCR技术可以迅速复制DNA片段，并在实验室中进行分析和研究。
PCR技术有几种不同的变体，每一种都有其特定的应用领域和优势。
1. 标准PCR标准PCR，也被称为常规PCR或传统PCR，是PCR技术最常用的形式。
在标准PCR中，需要使用DNA模板、一对引物、四种核苷酸和DNA聚合酶。
PCR反应从一段DNA的两端引导酶链的扩张，通过多次循环反复进行，最终产生大量的DNA复制产物。
标准PCR可用于多种应用，如基因克隆、基因表达定量分析、基因突变检测等。
它是分子生物学研究中最重要且最常用的工具之一。
2. 实时定量PCR实时定量PCR（qPCR）是PCR技术的一种改进形式，可以在PCR反应过程中实时监测扩增产物的积累量。
该技术利用荧光染料或探针标记扩增产物，通过测量荧光信号的强度来确定反应体系中的DNA量。
实时定量PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、药物研发等领域。
由于其高灵敏度、准确性和快速性，成为许多实验室和医学机构的首选技术。
3. 逆转录PCR逆转录PCR（RT-PCR）是用于将RNA转录为相应的DNA的技术。
逆转录PCR结合了逆转录酶的作用和标准PCR的扩增机制，可以从RNA中合成DNA，进而进行进一步的分析。
逆转录PCR在研究基因表达和分析RNA病毒等方面发挥着重要作用。
它可用于确定基因是否转录为RNA，并量化RNA的表达水平。
4. 梯度PCR梯度PCR是一种对PCR反应条件进行逐步优化的技术。
通过在反应管中创建不同温度的梯度，可以在一个PCR实验中测试多个不同条件下的扩增效果。
这有助于确定最佳的PCR条件，以提高扩增效率和特异性。
梯度PCR在优化引物和降低非特异引物扩增的干扰方面非常有用。
对于特定的PCR 反应，梯度PCR可以提供更准确和高效的结果。
综上所述，PCR技术有多种不同的变体，每一种都有其特殊的应用领域。
快速鉴定dna和rna的方法
快速鉴定dna和rna的方法
1. PCR (聚合酶链反应)
PCR是一种经典的基因组DNA扩增技术。
通过不断的循环反应，PCR可以从极少量的DNA样本中扩增出数百万倍的DNA片段。
这种技术可用于从血液、组织和其他来源的样品中扩增出特定的DNA序列，例如用于疾病诊断或DNA 纯度检测。
2. 蛋白质酶消化检测
该方法用于韧链反应和测序，比PCR更高效。
在DNA和RNA聚合酶酶消化后，产生的片段可用于检测。
3. RNA测序
RNA测序可以用来检测RNA的存在并确定其序列。
利用现代测序技术，RNA 样品中的成千上万个RNA分子可以被同时测序，这可用于研究基因表达、信号传导和其他RNA相关的过程。
4. 胶体电泳检测
胶体电泳是一种将DNA、RNA或蛋白质按大小分离的分析方法。
通过将DNA
或RNA样本置于电场中，聚合物分子会在聚丙烯酰胺凝胶上移动，根据其大小分离。
该方法可用于检测基因重组、变异和缺失。
5. 亚细胞定位
亚细胞定位可以用于检测DNA和RNA基因的位置。
通过标记染色质或细胞器等标记，可以确定DNA和RNA在细胞中的位置，从而确定它们可能扮演的角色。
PCR技术的原理及方法
PCR技术的原理及方法PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种用于扩增DNA序列的重要方法，它的原理基于DNA的聚合酶链式反应。
第二步是退火，即降低温度使引物（primer）与DNA模板序列互补结合。
引物是一段较短的单链DNA分子，长度通常为18-25个核苷酸。
引物的选择至关重要，因为它们决定了扩增片段的起始和终止位置。
第三步是DNA的延伸，即在适温下，用DNA聚合酶引导两条引物分别在DNA模板序列的两个方向上进行扩增。
这个过程是由DNA聚合酶催化下的核苷酸加入，以形成新的DNA链。
上述三个步骤被称为一个PCR循环，一个PCR反应通常包含多个循环，每个循环可以产生几千万到几十亿个DNA复制子序列。
随着PCR循环的进行，目标DNA序列将指数级增加。
PCR方法通常包括以下几个步骤：1.DNA提取：从样品中提取目标DNA，例如从血液、组织或培养物中提取DNA。
2.引物的设计：根据目标DNA序列的信息设计特异性的引物。
引物应该与目标DNA序列互补，并且具有适当的退火温度。
3.PCR反应混合物的准备：制备PCR反应的混合物，包括引物、DNA模板、核酸酶抑制剂、核苷酸混合物和DNA聚合酶等。
4.PCR程序：PCR反应需要经历多个循环，每个循环包含变性、退火和延伸。
PCR程序需要根据目标DNA序列的长度和引物的特性进行优化。
5.分析扩增产物：扩增反应结束后，可以通过凝胶电泳、定量PCR或其他方法来检测和分析PCR产物。
凝胶电泳可以根据扩增片段的大小进行分离和检测。
PCR技术的应用非常广泛，包括基因检测、疾病诊断、遗传学研究、人类起源研究、病原体鉴定等。
PCR技术的高灵敏度、高特异性和简单易行的特点使其成为现代分子生物学和医学领域中不可或缺的工具之一、此外，PCR技术还催生了许多相关技术的发展，如实时PCR、逆转录PCR、多重PCR等，进一步拓展了其应用范围。
PCR方法的原理及应用
PCR方法的原理及应用1. PCR方法的简介PCR方法（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种在体外体系中，通过核酸的特异性引物和热稳定DNA聚合酶的作用，对DNA分子进行体外扩增的技术。
该方法具有高效、灵敏、特异性强等特点，因此在分子生物学领域中得到广泛应用。
1.1 PCR方法的步骤PCR方法主要包括以下三个步骤：1.变性（Denaturation）：将DNA样本加热至94-98°C，使DNA双链解链并转变为单链。
2.退火（Annealing）：将温度降至50-65°C，使引物与目标DNA序列的互补部分结合。
3.延伸（Extension）：将温度升至72°C，利用DNA聚合酶酶活性，合成目标DNA序列的互补链。
1.2 PCR方法的原理PCR方法利用DNA聚合酶酶活性的特点，通过循环反应来扩增目标DNA序列。
通过反复进行以上三个步骤，每个循环都会产生新的DNA分子，从而指数级扩增目标DNA序列的数量。
PCR方法中的引物是一对特异性的DNA片段，它们能够与目标DNA序列的两个互补部分结合。
在退火步骤，引物与目标DNA序列结合，为DNA聚合酶提供起始合成新链的位置。
延伸步骤中，DNA聚合酶沿着目标DNA序列合成新的DNA链。
2. PCR方法的应用PCR方法由于其高灵敏度和特异性，广泛应用于以下领域：2.1 分子诊断PCR方法在临床诊断中具有重要的作用。
通过PCR方法可以检测病原微生物的DNA序列，快速准确地进行疾病的检测与诊断。
例如，PCR方法可以用于检测传染病的病原体，如病毒、细菌、真菌等。
此外，PCR方法还可以用于检测基因突变和遗传疾病的相关基因变异。
2.2 基因克隆PCR方法在基因克隆中起到了重要的作用。
通过PCR方法可以从DNA样本中扩增目标基因序列，获得足够的DNA量用于后续的克隆实验。
PCR方法还可以在目标基因的两端引入特定的序列，用于亚克隆、定点突变等操作。
pcr技术
pcr技术PCR技术简述PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学领域中广泛应用的技术，它通过扩增DNA序列，使得微量的DNA可被放大到足够进行分析和检测。
PCR技术的发明者是美国生物化学家凯瑟琳·穆利斯和基瑞克·穆利斯，他们在1983年首次描述了PCR技术的原理和应用。
PCR技术的原理基于DNA的双链结构以及DNA聚合酶的酶活性。
首先，需要将DNA样本经过解链处理，使得DNA的两条链分离。
然后，通过引物（primers）的引导，DNA聚合酶在适当的温度下，将碱基按序合成新的DNA链。
在这个过程中，由于DNA聚合酶的高保真性，其错误复制的错误率非常低。
PCR技术的应用非常广泛。
一方面，PCR技术可以用于DNA的克隆，即通过扩增特定目标序列，大量复制所需的DNA片段。
这项技术在基因工程、遗传学、疾病诊断以及法医学中有着重要的应用。
另一方面，PCR技术还可用于DNA的测序，即通过大量扩增DNA片段的方法，快速获取准确的DNA序列信息。
这项技术在基因组学、进化生物学等领域具有重要意义。
PCR技术具有许多优点。
首先，PCR技术具有高效快速的特点。
在PCR反应中，只需几个小时就能从微量的DNA样本扩增出大量的DNA。
其次，PCR技术的扩增过程是在体外进行的，不依赖于生物体，也不受DNA序列的限制。
第三，PCR技术对DNA样本的要求较低，只需微量的DNA就可以进行扩增。
最后，PCR技术的扩增结果可以被检测和分析，从而实现对特定DNA序列的定量和定性研究。
然而，PCR技术也存在一些限制。
首先，由于PCR技术的扩增过程是指数型增长，因此存在扩增产物的竞争问题，这可能导致非特异性扩增。
其次，PCR技术对引物的设计和选择要求较高，如果引物选择不当，可能会导致扩增失败或非特异性扩增。
此外，PCR技术还存在杂交、污染和抑制等问题，这可能对结果的准确性产生影响。
为了解决PCR技术的一些限制，研究人员对PCR技术进行了改进和创新。
pcr技术原理实验步骤和应用过程
pcr技术原理实验步骤和应用过程引言聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是在分子生物学领域中广泛应用的一种技术。
它能够通过无限次地扩增目标DNA片段，从而获得大量的目标DNA。
PCR技术不仅在遗传病的筛查、基因克隆和DNA测序等方面具有重要应用，还广泛应用于法医学、农业科学和生物技术等领域。
PCR技术原理PCR技术是通过连续进行三个核酸酶切循环，将目标DNA片段扩增至大量数量。
具体步骤如下：1. 反应准备将待扩增的DNA样本和引物（用于导向扩增的寡核苷酸链）添加到一个反应管中，并混合均匀。
2. Denaturation（变性）将反应管加热至95°C，使DNA双链解开成两条单链。
3. Annealing（退火）将反应管从95°C的高温状态快速冷却至50-60°C，并使引物与DNA单链结合。
4. Extension（延伸）将反应管温度提高至72°C，此时Taq DNA聚合酶开始引导DNA合成，从引物的末端开始延伸，并合成一条新的DNA链。
5. 延伸循环重复第2-4步骤，使得DNA的复制呈指数增长，产生大量扩增的DNA。
PCR技术应用过程PCR技术在科学研究和实际应用中有着广泛的应用，以下是几个典型的应用过程：1. 分子诊断PCR技术可以检测疾病相关基因的突变，用于遗传性疾病的早期诊断。
通过提取患者的DNA样本，通过PCR扩增技术可以检测出目标基因的突变，从而帮助医生确定诊断并制定合适的治疗方案。
2. 基因克隆PCR技术可以用于基因克隆。
通过设计合适的引物和使用PCR反应，可以在短时间内扩增出目标基因的DNA片段。
这些扩增的DNA片段可以被插入到表达载体中，进而在大量体外表达中使用。
3. 物种鉴定PCR技术在物种鉴定中也有应用。
通过选择一些特定的基因序列作为分子标记，我们可以通过扩增和测序这些序列来确定物种的身份。
这对于动植物的保护和种群遗传学研究非常重要。
PCR技术基本原理及相关知识
PCR技术基本原理及相关知识PCR（聚合酶链式反应）是一种分子生物学技术，用于扩增DNA分子。
PCR技术革命性地改变了分子生物学的研究和应用领域，并且在医学、农业、环境科学等领域具有广泛的应用。
以下是PCR技术的基本原理及相关知识。
1. 变性（Denaturation）：将目标DNA融合成两条单链，使其成为单股DNA。
在PCR反应开始时，样本中的DNA经过高温处理（通常为95°C），使其双股DNA分离，形成单股DNA。
2. 退火（Annealing）：通过引入两个特异性引物，使其与目标DNA的靶序列互补结合。
延伸引物是由短的DNA或寡核苷酸片段（18-24个核苷酸）组成的特定DNA序列，它与目标序列的两端相互补。
在PCR反应温度较低时（通常为50-65°C），引物结合到目标DNA的两端。
3. 延伸（Extension）：通过DNA聚合酶的催化，将引物与目标DNA形成的复合物延长，生成新的DNA分子。
在PCR反应中，引物延长所需要的二倍体DNA将通过DNA聚合酶的催化作用来实现。
DNA聚合酶能够识别引物与模板DNA之间的同源性，并在引物的3'末端开始合成新的DNA链。
以上三个步骤组成一个PCR循环，每个循环将扩增目标DNA的数量。
通常，在30-40个PCR循环后，目标DNA的量将扩增到百万级。
1.DNA模板：DNA模板是PCR反应的起点，它可以是基因组DNA、cDNA或已知序列的DNA片段。
2.引物设计：引物的选择非常重要，引物应该与目标DNA序列的两端相互补，以确保引物的有效结合和延长。
3. DNA聚合酶：DNA聚合酶是PCR反应的催化剂，通常使用热稳定聚合酶（如Taq聚合酶）。
热稳定聚合酶能够在高温下保持稳定，并且具有较高的DNA聚合活性。
4.PCR缓冲液：PCR反应需要在特定的pH和离子浓度条件下进行，PCR缓冲液可以提供适宜的反应环境。
5.循环条件：PCR反应需要在特定的温度条件下进行循环反应。
PCR技术及原理
PCR技术及原理PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种在医学、生物学和法医学等领域广泛应用的技术，它可以在短时间内扩增特定DNA片段。
PCR技术的原理基于DNA的复制过程，通过PCR可以在不进行其他复制方式的情况下在试管中复制DNA序列。
本文将详细介绍PCR技术的原理以及相关的步骤和应用。
PCR技术的原理是通过DNA的聚合酶链式反应来扩增特定DNA片段。
PCR的反应体系通常包含DNA模板、引物、聚合酶和四种不同的核苷酸。
PCR的过程分为三个不同的步骤：变性、退火和延伸。
下面将对每个步骤进行具体说明。
1. 变性（Denaturation）：在此步骤中，PCR反应混合液中的DNA模板加热至94-98℃，使其双链DNA断裂成两条单链DNA。
DNA的双链断裂是由于高温使DNA中的氢键断裂，从而使两条链分开。
这一步骤通常持续约30秒至1分钟。
2. 退火（Annealing）：在此步骤中，PCR反应混合液的温度被降低至48-72℃，引物与目标DNA序列互补结合。
引物是一对特异性的寡核苷酸序列，通常由20-30个核苷酸组成，其两端分别与目标DNA序列的两端互补。
当引物与目标DNA序列互补结合时，它们的3'末端会朝向DNA的中心延伸。
这一步骤的时间通常为30-60秒。
通过多轮的PCR反应，可以在短时间内产生大量特定的DNA片段。
每一轮PCR循环会产生数量翻倍的DNA，这使得PCR具有很高的扩增特异性。
PCR技术有许多应用。
在医学领域，PCR可以用于检测和诊断病毒、细菌和基因突变等。
在法医学中，PCR可以用于DNA鉴定。
在生物学中，PCR可以用于克隆和表达基因，研究基因调控机制等。
此外，PCR技术还可以用于DNA测序、产前诊断、人类遗传学研究等领域。
总而言之，PCR技术是一项重要而广泛应用的分子生物学技术。
其原理基于DNA的复制过程，通过变性、退火和延伸三个步骤，可以在短时间内扩增特定DNA片段。
pcr技术的原理及应用
PCR技术的原理及应用1. PCR技术概述PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种基因工程技术，用于在体外扩增DNA片段。
它是由美国生物化学家Kary B. Mullis于1983年发明的，已经成为现代分子生物学和生物医学研究中最基础和最重要的技术之一。
PCR技术的原理是通过逐渐增加DNA双链的方法，在体外扩增某一特定DNA片段，使之达到可以测定和分析的水平。
PCR技术的基本原理包括DNA的变性、引物的结合和DNA合成。
2. PCR技术的步骤PCR技术通常包括以下三个主要步骤：2.1 变性（Denaturation）PCR反应开始时，DNA样本被加热至高温（通常是94-98℃），使DNA双链变性，即将两个DNA链分离成两条单链。
2.2 引物结合（Annealing）PCR反应温度下降时，引物与目标DNA片段中的互补序列结合。
引物是短的DNA片段，以逆向互补的方式与目标DNA序列的两端配对。
引物的选择是PCR反应成功的关键，需要根据目标序列的特性进行设计。
2.3 DNA合成（Extension）在PCR反应过程中，酶（通常是热稳定的DNA聚合酶）通过引物作为起始点，沿着DNA模板合成新的DNA链。
该过程通常在高温下进行，使酶能够稳定在DNA链上进行复制。
每个PCR循环会产生两条新的DNA链，其中一条是目标序列的补充链。
3. PCR技术的应用PCR技术广泛应用于各个领域，包括基因检测、遗传学研究、医学诊断和法医学等。
3.1 基因检测PCR技术可以用于检测和鉴定各种基因突变、插入、缺失等基因变异。
通过PCR技术可以扩增出需要检测的基因片段，并可以通过其他技术（如DNA测序）对扩增产物进行分析和验证。
3.2 遗传学研究PCR技术在遗传学研究中起着重要的作用，可以用于DNA指纹鉴定、基因组重组、基因表达调控研究、基因治疗等方面。
例如，PCR技术被广泛应用于DNA 指纹鉴定，通过对DNA样本进行PCR扩增和电泳分析，可以确定个体之间的遗传关系。
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23
缓冲液Buffer Ⅰ
M g2+: M g2+与负离子或负离子团（PO43-)结合
PO43-来源：dNTP(2.5mmol/L), 引物, 模板
M g2+浓度比dNTP高出0.5-1.0mmol/L • • 浓度偏高 浓度偏低 酶活性 , 特异性 产量
PCR
08/02
24
缓冲液Buffer Ⅱ
PCR
08/02
3
2. PCR的原理
A. PCR的循环反应参数
B. PCR靶序列的指数增加
C. PCR反应的前四步详解
D. PCR扩增的平台效应
PCR 08/02 4
A. PCR的循环反应参数
PCR
08/02
5
C. PCR反应的前四步详解
PCR
08/02
6
3. PCR方案所需成分
PCR Reagent Components
or
Repeat the PCR with the same sample and
PCR reagents.
Template too low
concentration Increase concentration of template.
Primer concentration or sequence not optimal
PCR 08/02 47
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析
Lane 1 : PCR fragment is approximately 1850 bases long.
Lane 2 and 4 :the fragments are approximately 800 bases long. Lane 3 : no product is formed, so the PCR failed.
PCR 08/02 16
二聚
F. 引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性
3’末
引 物Ⅵ
引物设计：
H. 5’末端: 靶序列的长短由5’末端决定,不影响 特异性, 5’末端可以不与模板DNA匹 配而游离,可被修饰: 附加核酸序列：— 酶切位点
— 噬菌体启动子
修饰功能集团: — 突变位点
— 荧光素,同位素,生物素
Optimize primer concentration. Verify primer sequences. If necessary, redesign primers.
Multiple contributing factors
PCR
Test reaction with positive control template and primers of known performance. Start over, using freshly made solutions of reaction buffer components, template, primers, and enzyme.
08/02 50
疑难解析
· primers that amplify smaller genomic sequences. Use
Template quality poor (degraded, contaminated, contains inhibitors) Reaction buffer not optimized
PCR
08/02
19
DNA聚合酶Ⅲ
Taq DNA聚合酶： 来源： 从嗜热水生菌YT-1菌株中分离提纯， 1969年从美国70-80℃的火山温泉中发 现的。 特性：
基因全长2496bp,编码832个氨基酸，酶 蛋白分子量94KD。
在70-80℃具有最高的生物学活性，每 分钟延长1000bpDNA
PCR
08/02
12
引 物Ⅱ
引物设计：
总原则：提高扩增的效率和特异性 一般原则： A. 引物长度：15-30bp
过短 过长 特异性 特异性 ，成本
B. G+C含量：40-60%
PCR
08/02
13
引 物 Ⅲ
Melting Temperature,Tm
引物设计：
PCR
08/02
14
引 物 Ⅳ
No product
Unbalanced reaction
Check
final concentrations of your components.
Cycle conditions
Check cycle conditions.
Product is smeared
Pipetting errors omission of a reagent
PCR
08/02
38
B.有效性 Ⅱ
PCR扩增的平台效应
1012
12
30
30
PCR
08/02
39
C.忠实性
PCR
08/02
40
6. PCR扩增产物的分析
— — — — 凝胶电泳分析法 点杂交 微孔板杂交法 PCR-ELISA法
41
TAE琼脂糖凝胶电泳分析法
TAE Agarose Gel Electrophoresis Analysis — PCR琼脂糖凝胶电泳注意事项 — 污染
27
PCR
08/02
28
/℃ ℃
PCR
08/02
29
5. PCR扩增效率的指标 特异性 只产生靶序列 效率高，产量高 有效性 忠实性 错配率低，
30
A. 特异性Ⅰ
PCR
08/02
31
A. 特异性 Ⅱ
PCR
08/02
32
A. 特异性 Ⅲ
有利于增加特异性的条件:
Mg2+:增幅0.5 mmol/L，从0.5-5.0mmol/L的反应 退火温度 升降温速度 dNTP Taq DNA聚合酶 循环中各部分的时间 循环数 引物浓度
7
PCR
08/02
8
模 板
来源：A .待扩增的质粒DNA
B .含有待扩增序列DNA的细菌 C .预先扩增的PCR靶序列
浓度：102~105个拷贝（pg,ng)
PCR
08/02
9
dNTP
浓度：dCTP，dGTP，dATP，dTTP各10μmol/μl等体
积混合
浓度过高
反应速度 错配率 成本 快 高 高
污染物与污染源 减少污染的方法
44
污染物与污染源
—
外源基因组 其他样品的质粒 前一次的PCR产物
污染物
—
手
污染源
实验室表面 实验器材：枪头，离心机，试管架
PCR 08/02 45
减少污染的方法
把PCR的各个部分在区域上分为样品制 备，前PCR区，后PCR区 II. 使用UNG，并用dUTP代替dTTP,但只防 止dUTP标记的PCR污染 III. 紫外线
Taq酶
Pfu酶 + + + （校正）
7.0×10-7
5` 3`聚合活性 5` 3`外切酶活性 3` 5`外切酶活性
+ + --
错配率（错误/掺入碱基对） 2.1×10-4 循环效率
PCR
88 %
08/02
60 %
22
PCR缓冲液
PCR Buffer
__
__ __
__
Mg2+ Tris-Cl KCL BSA
浓度过低
慢 低 低
体积不同
慢(过早终止延伸） 高 损失
决定因素：靶序列的数量 靶序列的长短
PCR 08/02 10
引 物
PRIMER
— 浓度 — 引物设计
11
引 物Ⅰ
浓度:25μmol/μl
错配率
浓度过高
非特异性带
形成引物二聚体
竞争聚合酶、 dNTP、引物 扩增的特异性
浓度过低
PCR的效率 PCR的特异性
PCR
08/02
25
缓冲液Buffer Ⅲ
Tris-Cl: 调pH值,浓度10-50mmol/L KCl: 浓度50mmol/L,浓度偏高影响酶活性 BSA: 100μmol/L
PCR
08/02
26
4. PCR反应的优化
Optimization of PCR
__
__
生化提示 缓冲液的优化
Lane 5 : multiple bands are formed because one of the primers fits on different places.
PCR 08/02 48
7. 疑 难 解 析
Troubleshooting Standard PCR
PCR
08/02
49
疑 难 解 析
经典PCR技术
1
前言
PCR概念 PCR原理 PCR方案所需成分 PCR反应的优化 PCR扩增效率的指标 6. PCR扩增产物的分析 7. 疑 难 解 析
1. 2. 3. 4. 5.
PCR 08/02 2
1. PCR概念
PCR：聚合酶链式反应
即通过引物延伸核酸的某个区域而
进行的重复双向DNA合成，在设计上 十分简单并且似乎有无限的应用方 式。
— 起始密码ATG
PCR 08/02 17
DNA聚合酶
DNA polymerize
___
Enzyme Choice
Different PCR Enzymes for Different Applications