病毒培养技术 (1)
新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第二版)
附件4新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第二版）为指导各级疾控部门和其他相关机构开展新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测工作，特制定本技术指南。
本指南主要介绍目前已经比较成熟、易于实施的核酸检测方法。
一、标本采集（一）采集对象。
新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者，其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者，或其他需要进一步筛查检测的环境或生物材料（如溯源分析）。
(二)标本采集要求。
1.从事新型冠状病毒检测标本采集的技术人员应经过生物安全培训（培训合格）和具备相应的实验技能。
采样人员专业防护装备（personal protective equipment，PPE）要求：N95口罩、护目镜、防护服、乳胶手套、防水靴套；如果接触患者血液、体液、分泌物或排泄物时，戴双层乳胶手套。
2.住院病例的标本由所在医院医护人员在当地疾控机构专业人员指导下采集。
3．密切接触者标本由当地疾控机构负责采集。
4．根据实验室检测工作的需要，可结合病程多次采样。
（三）标本采集种类。
每个病例必须采集急性期呼吸道标本和急性期血液标本；重症病例优先采集下呼吸道标本（如支气管或肺泡灌洗液等），可根据临床表现与采样时间间隔进行采集。
其他研究材料依据设计需求采集。
标本种类：1．上呼吸道标本：包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物。
2．下呼吸道标本：包括深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本。
3．血液标本：尽量釆集发病后7天内的急性期抗凝血。
采集量5ml，以空腹血为佳，建议使用含有抗凝剂的真空釆血管采集血液。
4.血清标本：尽量釆集急性期、恢复期双份血清。
第一份血清应尽早（最好在发病后7天内）釆集，第二份血清应在发病后第3～4周釆集。
采集量5ml，以空腹血为佳，建议使用真空釆血管。
（四）标本采集方法。
1．咽拭子：用2根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入含3ml采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。
病毒培养的原理和流程
病毒培养的原理和流程英文回答：Principle of Virus Culture.Virus culture is the process of growing viruses in a living host system, such as cell culture or animals. The purpose of virus culture is to isolate and propagate viruses for diagnostic, research, or vaccine development purposes.Viruses are obligate intracellular parasites, meaning they require a living host cell to replicate. In virus culture, viruses are introduced into a host system that is permissive to their growth. The permissive host system provides the necessary cellular machinery and nutrients for the virus to replicate.Process of Virus Culture.The process of virus culture typically involves the following steps:1. Specimen collection: A specimen containing the virus of interest is collected from the patient or the environment.2. Sample preparation: The specimen is processed to remove any contaminants or debris that could interfere with virus culture.3. Inoculation: The prepared sample is inoculated intoa permissive host system. This can be done by injecting the sample into the host, adding the sample to a cell culture, or exposing the host to the sample through the respiratory tract or other routes of infection.4. Incubation: The inoculated host system is incubated at a temperature and environment that is optimal for virus growth.5. Observation: The host system is monitored for signsof virus growth. This can include changes in cell morphology, the presence of viral inclusions, or the development of cytopathic effects (CPE).6. Harvesting: Once the virus has grown to a sufficient titer, it can be harvested from the host system. This can be done by collecting the infected cells or fluids from the host.7. Isolation: The harvested virus can be further isolated and purified using techniques such as plaque isolation or monoclonal antibody purification.中文回答：病毒培养的原理。
病毒培养方法
病毒培养方法病毒培养是研究病毒特性和生物学行为的重要手段，也是疫苗和抗病毒药物研发的基础。
正确的病毒培养方法能够保证病毒在细胞内稳定生长，为后续实验提供可靠的数据支持。
下面将介绍一般的病毒培养方法。
首先，选择合适的宿主细胞。
不同种类的病毒需要不同的宿主细胞进行培养，常用的宿主细胞有Vero细胞、HEK293细胞、MDCK 细胞等。
在选择宿主细胞时，需要考虑病毒对细胞的亲和性和感染能力，确保病毒能够有效地感染和复制。
其次，培养宿主细胞。
宿主细胞的培养条件对病毒的生长和复制起着至关重要的作用。
通常情况下，宿主细胞需要在无菌条件下培养，培养基的选择和配方也需要根据不同的宿主细胞进行调整。
在培养过程中，需要定期更换培养基，控制培养密度，以确保细胞的健康状态。
接着，感染宿主细胞。
将病毒悬液加入到培养基中，使病毒与宿主细胞发生感染。
感染后的细胞需要在适当的温度和湿度条件下进行培养，促进病毒的复制和扩散。
在感染后的一段时间内，可以观察细胞的形态变化和病毒效应，以判断感染情况。
最后，收获病毒。
当感染细胞出现明显的病毒效应并且病毒滴度达到一定水平时，可以收获病毒。
收获病毒时需要注意保持病毒的活性和纯度，通常采用离心、滤过等方法进行病毒精制。
收获的病毒可以用于后续的实验研究，也可以用于疫苗和药物的研发。
总之，病毒培养是病毒学研究中不可或缺的一环，正确的病毒培养方法能够保证病毒的活性和稳定性，为后续的实验提供可靠的数据支持。
在进行病毒培养时，需要严格控制培养条件，确保实验的可重复性和准确性。
希望本文介绍的病毒培养方法能够对研究人员有所帮助，促进病毒学研究的发展。
病毒性疫苗制造技术
病毒性疫苗制造技术任务一灭活苗的制造流程菌种的选择（强毒株) → 菌液培养→ 灭活↓↓配苗（5份菌液+1份铝胶配苗) ←浓缩工序一菌种与种子培养选取毒力强、免疫原性好的1～3个品系菌株，按规定定期复壮和鉴定，将合格菌种增殖培养并经无菌检验、活菌计数达到标准后作为种子液。
种子液保存于2～8℃冷暗处，在有效期内用于菌苗生产种子使用。
大肠杆菌病的菌种应采集动物心血、腹水、肝渗出物、气囊附着物或正常动物的肠道内容物作为接种物。
如用含大肠杆菌的病料，首先对大肠杆菌进行分离、鉴定，符合要求方可作为菌种使用。
工序二菌液的培养用于规模化细菌培养的方法很多，有手工式、机械化或自动化等方式。
可供菌体培养的方法有：固体表面培养法、液体静置培养法、液体深层通气培养法和透析培养法。
一般固体培养易获得高浓度细菌悬液，含培养基成分少，易稀释成不同的浓度，但生产量较小。
因此，大量生产疫苗时常用液体培养法。
实例大肠杆菌的菌液培养方法(1)．将生化结果典型的菌种接种于伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置37℃温箱中培养18～24h，挑取单个典型菌落接种于琼脂斜面，置37℃温箱中培养18～24h，经显微镜检查无杂菌污染者，即可作为种子培养物。
(2)．取5ml马丁肉汤加入琼脂斜面洗下菌苔作为一级种子，用灭菌吸管按5%的量将一级种子接种于马丁肉汤中，置37℃培养18～24h后作为二级种子。
(3)．二级种子可以接种到营养琼脂培养基或马丁肉汤中做进一步扩大培养。
如接种到营养琼脂培养基表面，37℃培养24～48h后，加入灭菌生理盐水，用灭菌接种环或特制的刮子将菌苔刮下，倾入灭菌的离心管中，低速离心5min (500r/min)，使其中可能掺杂的琼脂块下沉。
吸取上层细菌悬浮液加入盛有玻璃珠的灭菌瓶中，用手或振荡器振荡30min，使细菌均匀分散,取少量菌液装于灭菌试管中供计数用，其余细菌将灭活(强毒细菌须在杀菌后，再行计数)。
如接种于马丁肉汤培养基，经37℃培养24～48h后，直接取少量菌液供计数用，其余细菌则灭活。
《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验
《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验实验动物在病原微生物中的研究上占有重要地位。
利用实验动物可以进行病原菌的分离鉴定、毒力的检测、制备免疫血清等生物制品；进行各种皮肤试验；建立人工感染的动物模型；进行发病机制、疾病防治以及免疫机制的研究等。
一、实验动物的管理1．实验室常用的动物：家兔、豚鼠、小白鼠、大白鼠、地鼠、绵羊、鸡等，根据实验的目的选择最适宜的动物。
2．实验动物必须与正常动物分开饲养，动物室内要经常保持清洁和空气畅通，并应有防蚊、防蝇、防逃跑及保暖设备。
3．实验动物要精心饲养，喂以适当的饲料并给以充足的水，任何动物也不要断水。
4．实验动物要有详细的记录，包括性别、体重、体表特征(如毛色等)、接种材料、接种日期、接种途径、剂量、次数以及接种变化等。
5．实验动物应做好标记，对较大动物如家兔、豚鼠等可用金属号码牌固定于耳朵上，对较小动物如大白鼠、小白鼠等可用复红(或苦味酸等染料)涂于身体的不同部位，以资识别。
盛装动物的笼具等，也应付以标签。
6．接种后的动物应每天观察1～2次，注意动物的精神状态，活动能力、饮食和大小便情况，体温、注射部位的反应以及全身反应，如不安、耸毛、震颤、弓背、麻痹及死亡等，并应详细记录之。
7．感染动物死亡后，应立即剖检或暂时冻存。
动物的排泄物及使用的笼具等必须严格消毒。
任何用过的动物，不宜再做其他试验。
二、实验动物的选择选择实验动物应注意以下几点：1．易感性：是选择实验动物的首要条件。
2．动物健康：体质健康、发育正常、体重适宜；最好使用自己繁殖的动物，由市场购买的动物至少经过一周的隔离观察，证明无隐性感染方可使用；某些特殊实验应需选用专门喂养繁殖的无菌动物；实验动物应容易获得，便于喂养和管理。
3．动物大小：同一实验应选用大小一致的动物，通常以年龄或体重为标准。
4．性别：某些实验最好选用同一性别，特别是免疫的动物和需要观察较长时间的实验动物。
5．动物品系：某些实验要求使用纯系动物，纯系小鼠用于免疫学、杂交瘤及病毒感染等研究。
人工培养病毒的方法
人工培养病毒的方法
人工培养病毒是一项重要的实验技术，它在病毒学研究以及疫苗生产等领域具有重要意义。
下面将介绍人工培养病毒的方法。
首先，选择合适的宿主细胞是人工培养病毒的关键。
不同的病毒对宿主细胞有不同的选择性，因此需要根据病毒的特性选择合适的宿主细胞。
常用的宿主细胞包括Vero细胞、MDCK细胞、HEK293细胞等。
其次，培养基的选择也是至关重要的。
培养基中的营养物质和生长因子对病毒的生长和繁殖起着至关重要的作用。
一般来说，培养基中需要含有足够的营养物质和生长因子，以满足病毒的生长需求。
接着，病毒的接种和感染是人工培养病毒的关键步骤。
在选择好宿主细胞和培养基之后，需要将病毒接种到宿主细胞中，使其感染并开始复制。
这一步需要严格控制感染的条件，以确保病毒能够有效地感染宿主细胞。
随后，对感染后的细胞进行培养和观察。
在感染后，需要将细
胞继续培养，并观察病毒的生长情况。
这一步需要耐心和细心，以
确保病毒能够充分地复制和繁殖。
最后，收集和提取病毒。
当病毒充分复制后，需要进行病毒的
收集和提取。
这一步需要使用适当的方法，如离心、超声波破碎等，将病毒从细胞中提取出来，并进行纯化和浓缩。
总之，人工培养病毒是一项复杂而重要的实验技术，它需要在
选择宿主细胞、培养基、感染和观察等方面进行严格控制，以确保
病毒能够充分复制和繁殖。
只有这样，我们才能更好地理解病毒的
生物学特性，为疫苗研发和病毒学研究提供重要的支持。
制备乙肝疫苗关键技术
制备乙肝疫苗关键技术乙肝疫苗是预防乙型肝炎的主要手段之一，它通过引入乙肝病毒表面抗原（HBsAg）来激发人体免疫系统产生特异性抗体，从而达到预防乙型肝炎的效果。
乙肝疫苗的制备主要包括以下几个关键技术：1. 病毒培养技术：乙肝疫苗的制备需要大量的乙肝病毒，因此首先需要通过细胞培养技术来大量培养乙肝病毒。
常用的乙肝病毒培养细胞包括CHO细胞和酵母细胞等。
这些细胞能够提供足够的细胞质环境，使乙肝病毒能够进行正常的生长和复制。
2. 病毒纯化技术：在病毒培养完成后，需要对培养液进行纯化处理，以去除杂质和非病毒成分。
常用的纯化方法包括超速离心、膜过滤和柱层析等。
通过这些技术，可以将乙肝病毒从培养液中分离出来，并获得相对纯净的乙肝病毒样品。
3. 抗原提取技术：乙肝疫苗的关键成分是乙肝病毒表面抗原（HBsAg），因此需要将从纯化的乙肝病毒中提取出HBsAg。
一般采用酸沉淀法或柱层析法来提取HBsAg。
提取后的HBsAg可以用于制备乙肝疫苗的主要原料。
4. 适应性毒株培养技术：为了提高乙肝疫苗的免疫效果和安全性，研究人员常常会通过传代培养等技术来培养适应性毒株。
适应性毒株是指经过多次传代培养后，乙肝病毒的毒性和免疫原性均得到增强的病毒株。
使用适应性毒株制备的乙肝疫苗可以更好地激活人体免疫系统，从而提高疫苗的免疫效果。
5. 疫苗制剂技术：乙肝疫苗的最终制剂通常是液体制剂或冻干粉剂。
制备乙肝疫苗的过程中，需要加入一定的辅助成分，如防腐剂、稳定剂和缓冲剂等。
这些辅助成分可以提高疫苗的稳定性和保存性能，保证疫苗在贮存和使用过程中的效果。
总结起来，制备乙肝疫苗的关键技术包括病毒培养、病毒纯化、抗原提取、适应性毒株培养和疫苗制剂等。
这些技术的应用使得乙肝疫苗的制备更加高效和安全，为预防乙型肝炎提供了有力的保障。
未来，随着生物技术的不断进步和创新，乙肝疫苗的制备技术也将不断完善，为乙型肝炎的防控工作做出更大的贡献。
第十二章病毒的培养
第十二章病毒的培养一、实验动物二、鸡胚三、组织培养(一)组织（块）培养(二)器官培养(三)细胞培养(四)组织和细胞的培养方法(五)细胞克隆技术(六)细胞的保存四、病毒的组织培养五、病毒蚀斑技术病毒缺乏完整的酶系统,又无核糖体等细胞器,所以不能在任何无生命的培养液内生长。
因此,实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞就成为人工增殖病毒的基本工具。
而大量病毒的培养,又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断制剂的先决条件。
培养病毒最早应用的方法是实验动物和鸡胚,但从50年代简便适用的细胞培养广泛应用于病毒培养以来,前两种方法已降到次要地位,但至今仍有部分病毒的分离鉴定还离不开实验动物或鸡胚,特别是在免疫血清制备以及病毒致病性、免疫性、发病机理和药物效检等方面。
在禽类病毒病和流感、副流感类等病毒病的研究方面,鸡胚(含其它禽胚)仍具有重要的应用价值。
一、实验动物实验动物是长期以来分离和增殖病毒、制造病毒抗原和病毒疫苗以及病毒病实验研究的常用材料和工具。
但是后来发现,实验动物经常自身带有病毒,常常混淆试验结果,并给病毒疫苗的生产带来严重的潜在危险,例如被某些致瘤病毒所污染等等。
为了克服这个缺陷,目前已通过微生物控制手段,培育出无菌动物(Germ Free Animal, 简称GF)、已知菌动物或称悉生动物(Gnotobiotics, 简称GN)和无特定病原动物(Specific Pathogen Free Animal,简称SPF)。
GF动物体内和体外均检不出任何微生物、寄生虫或其它生命体。
GN是确知所带微生物的动物。
只带一种菌的叫单菌动物,其次为双菌和三菌动物,四菌以上则称多菌动物。
SPF是指体内无特定微生物和寄生虫感染的动物。
从微生物控制的程度讲,SPF动物虽是这三类中最低的,但它无人畜共患病,无主要传染病,无对实验研究产生干扰的微生物,所以能满足病毒学一般实验的需要,比应用普通实验动物取得的结果更为科学与可靠。
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悬浮培养
通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内 的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细 胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。
微载体培养
微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培 养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收 培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞 吸 附 在 表 面 ， 如 DEAE—SephadexA-50 、 Cytodexl 、 Cytodex2、Cytodex3等。
3．接种技术
不同病毒的增殖有不同的接种途径， 同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同。 •接种日龄：鸡胚13～14日龄。鸭胚15～16日龄，尿囊液含
量最高，平均约6～8ml，羊水约1～2ml。 •接种部位：不应伤及胚体和血管，以免影响其发育 •严格防止禽胚污染
①鸡胚接种时严格无菌操作； ②定期清扫消毒孵化室，保持室内空气新鲜； ③种蛋入孵前先用温水清洗，消毒，凉干。
二、禽胚增殖病毒技术
（一）禽胚的选择 • SPF鸡胚
据国家标准，无22种特定病原体 • 非免疫鸡胚
应无特定病原的母源抗体， • 普通鸡胚
可能带有鸡的多种病原体，不适用于疫苗生产 异源性性疫苗：鸭胚和鸽胚
（二）禽胚接种途径与收获
• 绒毛尿囊膜接种法
• 尿囊腔接种法 • 卵黄囊接种法 • 羊膜腔接种法 • 静脉接种法 • 脑内接种法
• 血清选择：同种动物优于异种动物血清；人和牛血清优于 马血清；马血清优于兔血清和鸡血清。
• 血清使用：目前国内多用犊牛血清，使用前须经56℃灭活 30min ， 并 进 行 细 胞 毒 性 试 验 。 生 长 液 血 清 含 量 一 般 为 5 ％～20％。维持液中血清量为0%～5％。
• 血清替代因子：激素和生长因子（如胰岛素、上皮生长因 子）、结合蛋白（如转铁蛋白）、贴壁因子（如鱼精蛋白、 聚赖氨酸）和微量元素（如硒）四类几十种，多数无血清 培养液须补加3～8种血清替代因子。
三、细胞增殖病毒技术
1．细胞培养的概念
细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化学方法使动物 组织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团悬液进行培养。
细胞分类：根据细胞染色体和繁殖特性 • 原代细胞(primary cell) • 细胞株(cell strain) • 传代细胞（continued cell line） 细胞系(cell line)
能在体外无限传代，应用方便，其染色体数目及增殖特性 均类似于恶性肿瘤细胞，且多来源于癌细胞，如HeLa细胞系
2．细胞培养方法
• 静置培养 • 转瓶培养 •悬浮培养(suspension cell culture ) •微载体培养(microcarrier cell culture) • 中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture) • 微囊化细胞培养
微载体培养的容器为特制的生物反应器，有自动化装置。细 胞产量达106～107个/m1，每升培养液可加微载体2～5g，每 克有8000～9000个珠子，培养面积约为2～5万cm2，比常规 培养面积大10～25倍。
中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture)
•组成:中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵
病毒增殖技术
动物增殖病毒技术 禽胚增殖病毒技术 细胞增殖病毒技术
一、动物增殖病毒技术
选择动物的标准：
①大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗、 青壮年和健康(经临床检查、检疫)； ②对相应病毒易感，并十分敏感； ③经隔离饲养和观察检查证明健康； ④家兔、小鼠、大鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标 准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬和猫应品种明确， 并符合普通级实验动物标准； ⑤体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大。
细胞接种量
细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少， 这些物质分泌量少，而作用也小。 接种细胞数量越大，细胞生长为单层的速度越快，但细胞过多 对细胞生长也不利。 鸡胚成纤维细胞为100万／m1 小鼠或地鼠肾细胞为50万／m1 猴肾细胞量为30万／ml 传代细胞为10～30万／m1
4．细胞培养污染问题
有些病毒不产生CPE。 病毒收获：CPE达80％时收获，反复冻融多次使病毒释放，
然后离心除去细胞碎片，上清病毒液-20℃保存。 病毒毒价：TCID50、中和试验、AGP效价、HA
疫苗制造工艺流程
病毒性细胞疫苗制造工艺流程
病毒性组织疫苗制造工艺流程
细菌疫苗和类毒素制造工艺流程
寄生虫疫苗制备的工艺流程
一般按维持液的1％～10％(V／V)量接入。 接种量小，细胞不能完全发生感染，会影响毒价； 接种量过大，会产生大量无感染性缺陷病毒。 (5) 病毒接种方法：异步接毒和同步接毒。
6. 病毒增殖指标与收获
细胞病变(CPE)： ①细胞圆缩，如痘病毒和呼肠孤病毒等； ②细胞聚合，如腺病毒； ③细胞融合形成合胞体，如副粘病毒和疱疹病毒； ④轻微病变，如正粘病毒、冠状病毒等。 包涵体和血凝性：也可作为检查病毒增殖的指标。
（1）原代细胞(primary cell)
指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。
（2）细胞株(cell strain) 又称二倍体细胞
指自继代培养的细胞中选育出具有特殊生物学性质和标记的 细胞。这类细胞且能保持原来的二倍染色体数目，能连续传很 多 代 (50 ～ 100 代 ) ， 但 为 有 限 生 命 ； 没 有 肿 瘤 原 。 如 PKl5 、 BHK21和Vero （3）传代细胞（continued cell line）\ 细胞系(cell line)
•中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯－丙烯复合物或多聚碳酸硅 等材料制成，外径50~100µm，壁厚25~75µm，壁呈海绵状， 上面有很多微孔。
•中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，允许营养物质 和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单克隆抗体）有 滞留作用。
•培养液能有效地分布，细胞培养维持时间可达数月，保持高 度活性，培养的细胞密度大，细胞分泌的蛋白质浓度高，纯度 可达60％～90％；占用空间小，适于各类细胞，但设备昂贵。
3. 细胞培养要素
•培养液 •血清 •细胞接种量 •pH •温度 •无菌条件 •培养器皿清洁度
RPMI-1640、199、 DMEM、F12
血清
• 成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。α-珠蛋 白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、 a2-球蛋白和β脂蛋白G2能促进细胞贴壁。
(1) 细菌污染 (2) 真菌污染：念珠菌或酵母菌。
培养液中可见黄白色小点状悬浮物 镜检时可见菌丝结构。 (3) 支原体污染：污染率为50％～60％ (4) 病毒污染 ①组织带毒 ②培养液带毒
5. 细胞培养病毒要素
（1）血清 ：维持液内犊牛血清含量一般不超过2％。 （2）温度：狂犬病病毒32℃，犬疱疹病毒36℃。 （3）pH： （4）病毒接种剂量：应以TCID50为依据
鸡胚绒毛尿囊膜接种法
尿囊腔接种法
Hale Waihona Puke 尿囊液收获方法鸡胚卵黄囊接种法
（三）影响禽胚增殖病毒的因素
1．种蛋质量
①病原微生物：垂直传递，如白血病、脑脊髓炎、腺病毒、 支原体及传染性贫血因子等。 ②母源抗体： ③抗生素：立克次氏体和鹦鹉热衣原体
2．孵化技术
①温度：37～39.5℃。传染性支气管炎病毒37℃ ②湿度：鸡胚53％～57％，水禽胚比鸡胚高5％～10％。 ③通风：氧气，二氧化碳。 ④翻蛋：