鸡胚培养
鸡胚细胞的原代培养
2.塑料篮子内：无菌袖套
操
1. 2. 3. 4. 5. 6.
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中清洗。
标记气室示意图
操
• • • • • •
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中用 Hank’s液清洗。
鉴定各种细胞产物的程序。
无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某
种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞 株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。
无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶
段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养 基使用时还需添加血清
人间充质干细胞无血清培养基:上海依科赛公司 CHO无血清培养基：维森特公司 树突状细胞无血清培养基：达优公司
肺
肝
腿部 肌肉
肾脏
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
注 意
清理台面,用品洗净,交回。酒பைடு நூலகம்灯和酒精棉球瓶要补 加酒精。 实验报告：这次的原代培养与细胞传代和冻存的实验 一起写一份细胞报告。 重点：要对实验结果进行分析和讨论。 实验考核：本次实验的实验结果记入一次实验课成绩 考核内容。无菌实验操作记入实验考核。
鸡胚细胞的原代培养
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
细胞培养的用途
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
提
纲
1.培养基的类型及配制 2.原代培养的过程 3.原代培养的注意事项 4. 本次实验操作要点 5.实践操作
鸡胚成纤维细胞的制作及培养
鸡胚成纤维细胞培养1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。
用碘酒、酒精消毒蛋壳。
用镊子打开气室。
4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。
5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。
7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。
8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
消化10－15分钟。
一般约12分钟。
视鸡胚日龄大小而定。
越小消化时间越短。
见组织松软即可。
一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。
9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。
（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。
使细胞分散，脱落。
然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。
10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
病毒的鸡胚培养
实验九病毒的鸡胚培养
一、目的
掌握病毒鸡胚接种、收获、HA试验方法和原理
二、实验内容
1、种蛋选择、消毒与孵化：种蛋为健康未免疫ND疫苗、受精率为90﹪以上的新鮮种蛋。
15g高锰酸钾、30mL甲醛/m3熏蒸消毒30分钟，气室向上38.5-39℃孵化，相对湿度60-70%。
每2小时翻番一次。
2、画蛋与打孔：孵化9-11日龄鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置。
于胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打孔。
3、接种与封孔：NDV Lasota种毒以灭菌生理盐水作一定倍数稀释,尿囊腔内接种0.1ml/胚，以融化的石蜡封孔，继续孵化，不翻蛋。
每日照蛋一次，弃去72h内死亡鸡胚。
至120h全部取出于4℃冰箱过夜。
4、收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化。
5、HA效价测定：原理。
1%鸡RBC制备：采取3只青年公鸡血液，抗凝，以生理盐水离心洗涤3次，制成1%RBC悬液。
血凝试验按下表操作。
1 2 3 11 12
稀释倍数212223 (211)
1
振荡混匀15秒，37C感作10-20分钟。
三、实验报告内容
1、病毒鸡胚培养的注意事项。
2、鸡胚尿囊液NDV HA效价结果，原理，并用原理说明HA效
价测定结果含义与意义。
2。
鸡胚
鸡胚培养法的缺点：
1. 一般的病毒通常不使鸡胚产生特异性的感染指 征。 2. 卵黄中常常含有抗家禽病原体的母体抗体。 3. 某些细菌、衣原体和病毒能够从感染的母鸡传 递到鸡胚。 4. 通常鸡胚常常含有白血病病毒。 5. 在鸡食物中加入抗菌素，母鸡吃后会传递给鸡 胚，鸡胚就会产生对立克次体和衣原体感染的抵 抗。
五、注意事项
鸡胚为一活的有机体，因此要严格 无菌操作，同时动作要仔细，以免造成 物理死亡。接种后24小时内死亡应不计 结果。
Thank
you !
流感病毒鸡Байду номын сангаас培养法
福建省疾病预防控制中心 杨式芹
一、概况
1911年Rous和Murphy首先应用鸡胚 培养研究肉瘤病毒(Rous肉瘤)的繁殖。 1938年Goodpasture和Burnet等应用 鸡胚繁殖病毒、Cox应用卵黄囊培养立克 次氏体。
鸡胚培养法的优点：
1. 它的组织分化程度低，可选择适当途径 接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体 含大量病毒。 2. 是个整体，有神经血管的分布及脏器的 构造。 3. 来源充足，操作简单，通常是无菌的， 对接种的病毒不产生抗体。
二、鸡胚的结构与生理
鸡胚是由三个胚层发育起 来的，即外胚层，中胚层和内 胚层，它们构成胚胎的组织与 器官。
（约10日龄鸡胚的结构见图）
三、材料
（一）7~11日龄鸡胚
（二）孵卵箱
（三）检卵灯、开卵钻和卵盘 （四）其它
四、接种技术
（一）活胚检查
1.血管：活胚可见清晰的血管，有时可见血管搏 动，死胚血管模糊成淤血带或淤血块。 2.胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其在转动 胚胎时，死胚见不到任何胎动，胚胎发红像出血样， 有的呈现黑块。 3.血管网是否丰满：发育好的鸡胚可见密布丰满 的血管网，也就是绒毛尿囊膜，死胚则见不到这一 现象。
病毒的鸡胚培养
扬州大学兽医学院 成大荣
2009年5月4日星期一来自一、目的要求1. 掌握鸡胚接种的常规方法； 2. 学习NDV的分离培养及其鉴定方法。
二、背景知识介绍
1. 病毒的鸡胚培养
① 鸡胚是正在发育的活体：
• 组织分化程度低； • 细胞代谢旺盛； • 适于许多病毒的生长增殖， 尤其是禽类病毒。
④ 血凝性：可凝集人、鸡、豚鼠和小白鼠的红细胞。 ⑤ 病毒分离培养：9~11日龄鸡胚尿囊腔接种。
三、实验材料
1. 2. 3. 4. 5. 常规接种工具：注射器、打孔器、酒精灯等； 待接种的新城疫病毒材料； 9~11日龄鸡胚（1个/人）； 灭菌生理盐水； 其他： • 镊子、照蛋器； • 酒精棉球、碘酊棉球； • 固体石蜡； • 灭菌瓶子、灭菌吸管 等。
④ 鸡胚接种的方法：
• 尿囊腔接种 • 绒毛尿囊膜接种 • 卵黄囊接种 • 羊膜腔接种 • 静脉接种 ：
2. 新城疫病毒
① 副粘病毒科/副粘病毒亚科/禽腮腺炎病毒属。 ② 新城疫的病原体。 ③ 形态： • • • • • 病毒子多呈球形； 单股负股RNA； 核衣壳螺旋形对称； 有囊膜； 囊膜表面有纤突。
7. 病毒的收获与鸡胚的观察
① 收集24h后死亡鸡胚，置4℃冰箱过夜，以免收获时流血; ② 取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面； ③ 用镊子击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜； ④ 以眼科镊镊住绒毛尿囊膜，用吸管吸取 尿囊液，置无菌容器中保存备用。 一般能尿囊液6-10mL。 ⑤ 取出鸡胚胎，于平皿内观察胚胎有无病 理变化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。
4. 注入病毒材料
• 用1mL注射器抽取接种物； • 针头垂直刺入注射部位1-1.2cm即达尿囊腔内； • 注入待接种的新城疫病毒：接种量为0.1~0.2mL。
鸡胚培养
鸡胚培养前言：鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，用牛痘病毒（vaccinia virus）和鸡新城疫病毒（Newcastle-disease virus）接种鸡胚。
牛痘病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长，经培养后，产生肉眼可见的白色痘疱样病变，似小结节或白色小片云翳状。
鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。
基本原理鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。
鸡胚培养的技术比组织培养容易成功，也比接种动物的动物来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，同时它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，是常用的一种培养动物病毒的方法。
器材牛痘病毒液，鸡新城疫病毒液；白壳受精卵（自产出后不超过10天，以5天以内的卵为最好）；孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加 1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。
操作步骤1．准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45—60%），孵育三日后，鸡卵每日翻动1—2次。
孵至第4日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。
活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。
生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
2．接种1）绒毛尿囊膜接种（a）将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。
（b）用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5—6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。
病毒的培养方法哪几种
病毒的培养方法哪几种病毒的培养方法是研究和了解病毒特性、生命周期以及对人类和生态系统的影响的重要手段。
通过培养病毒，科学家可以进一步研究病毒的基本特征、复制和传播机制，以及开发疫苗和药物。
本文将介绍几种常见的病毒培养方法。
一、细胞培养法细胞培养法是常见的病毒培养方法之一。
病毒在体内是依赖于宿主细胞才能生存和复制的，因此通过培养感染体细胞的方式，可以实现病毒的大规模培养。
这种方法需要选取合适的细胞系，如HeLa细胞、Vero细胞等，将病毒接种在细胞培养基中，让病毒感染细胞并进行复制。
通过观察细胞的形态学变化、病毒颗粒释放和细胞死亡等现象，可以判断病毒的感染情况和生命周期。
二、鸡胚培养法鸡胚培养法常用于培养禽类和一些昆虫病毒。
在鸡胚培养技术中，科学家会将病毒接种到受精鸡蛋的卵黄囊或坏死胚中，利用卵黄囊提供的营养和鸡胚的生长环境，促进病毒的复制和生产。
通过观察鸡胚的发育情况和病变症状，可以判断病毒感染的程度和效果。
三、动物模型法动物模型法常用于病毒研究的初期，用于检测病毒分离和扩增的能力。
科学家会选择合适的动物种类，如小鼠、大鼠、兔子或猴子等，将病毒接种到动物的体内。
通过观察动物是否出现病征、病毒在体内的分布和病理变化，判断病毒的毒性和致病能力。
然而，由于动物模型法具有伦理和实验条件限制，现在越来越多的科学家转向细胞培养法和分子生物学技术。
四、感染性核酸和蛋白质培养法感染性核酸和蛋白质培养法是一种近年来发展起来的新技术。
通过利用已经纯化的病毒核酸或蛋白质，将其与适当的宿主细胞或胚胎培养在一起，使其感染并继续生长。
这种方法可以绕过病毒的复制步骤，直接利用病毒的核酸或蛋白质进行培养，从而更快地得到病毒产物。
然而，由于该方法无法复制整个病毒生命周期，可能会影响病毒的完整性和活性。
总结起来，病毒的培养方法有细胞培养法、鸡胚培养法、动物模型法和感染性核酸和蛋白质培养法等。
不同的方法适用于不同类型的病毒和研究目的。
鸡胚的实验报告
一、实验目的1. 了解鸡胚培养的基本原理和操作步骤；2. 掌握鸡胚培养过程中细胞的分离、培养和传代技术；3. 观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。
二、实验原理鸡胚培养是一种在体外培养鸡胚细胞的方法，主要用于研究细胞生物学、分子生物学和发育生物学等领域。
通过将鸡胚组织中的细胞分离出来，并在特定的培养条件下进行培养，可以观察到细胞的生长、形态和增殖情况，从而研究细胞的生物学特性。
三、实验材料1. 新鲜鸡蛋：选用新鲜鸡蛋，确保蛋壳完整，无破损；2. 实验器材：解剖刀、剪刀、镊子、解剖盘、培养皿、移液枪、培养箱、显微镜等；3. 培养基：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶等；4. 其他：消毒剂、无菌操作台、无菌棉签等。
四、实验步骤1. 鸡胚的获取：将新鲜鸡蛋在37℃温水中浸泡10分钟，使蛋壳软化，然后用解剖刀在鸡蛋的一端切开，取出鸡胚。
2. 鸡胚的解剖：将鸡胚放在解剖盘上，用剪刀剪开卵黄囊，取出卵黄囊膜，用镊子取出鸡胚成纤维细胞。
3. 细胞的分离：将鸡胚成纤维细胞放入装有DMEM培养基的培养皿中，用胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆后加入胎牛血清终止消化，然后用移液枪吹打细胞，使细胞分散。
4. 细胞的接种：将分散的细胞接种到培养皿中，放入培养箱中培养。
5. 细胞的观察：在显微镜下观察鸡胚成纤维细胞的生长、形态和增殖情况。
6. 细胞的传代：待细胞生长到一定密度后，用胰蛋白酶消化细胞，将细胞分离成单个细胞，再进行接种。
五、实验结果1. 鸡胚成纤维细胞在培养过程中，呈扁平梭形，细胞质丰富，细胞核明显。
2. 随着培养时间的延长，细胞逐渐增多，细胞密度逐渐增大。
3. 在显微镜下观察，细胞形态规则，生长旺盛。
4. 经过传代培养，细胞仍保持良好的生长状态。
六、实验讨论1. 鸡胚培养过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
2. 培养基的质量对细胞的生长和增殖有重要影响，需选用优质培养基。
3. 细胞传代次数过多，可能导致细胞生长缓慢、形态发生变化，影响实验结果。
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鸡胚培养
前言：鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，用牛痘病毒（vaccinia virus）和鸡新城疫病毒（Newcastle-disease virus）接种鸡胚。
牛痘病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长，经培养后，产生肉眼可见的白色痘疱样病变，似小结节或白色小片云翳状。
鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内，生长后，鸡胚全身皮肤出现出血点，以脑后最显著。
基本原理
鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。
鸡胚培养的技术比组织培养容易成功，也比接种动物的动物来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，同时它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，是常用的一种培养动物病毒的方法。
器材
牛痘病毒液，鸡新城疫病毒液；
白壳受精卵（自产出后不超过10天，以5天以内的卵为最好）；
孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加 1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。
操作步骤
1．准备蛋胚
孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45—60%），孵育三日后，鸡卵每日翻动1—2次。
孵至第4日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。
活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可
以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。
生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
2．接种
1）绒毛尿囊膜接种
（a）将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。
（b）用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5—6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。
在气室顶端钻一小孔。
（c）用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛屑囊膜，此时生理盐水自破口处流至绒毛屑囊膜，以利两膜分离。
（d）用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室
（e）用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴 0．05— 0．1ml牛痘病毒液于绒毛尿囊膜上。
（f）在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，作成堤状，立即盖上消毒盖玻片。
也可用揭下的卵壳封口，则将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。
将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行37℃培养，48—96小时观察结果。
⑵尿囊腔接种
用孵育10—12天的蛋胚，因这时尿囊液积存得最多。
（a）将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出气室与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。
（b）将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。
用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。
（c）用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0．1ml病毒液（图Ⅻ-5）。
（d）用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72小时。
⑶羊膜腔接种
（a）将孵育10—11天的蛋胚照视，画出气室范围，并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。
（b）用碘酒消毒气室部位的蛋壳。
用齿钻在气室顶端磨一三角形，每边约1cm的裂痕。
注意勿划破壳膜。
（c）用灭菌镊子揭去蛋壳和壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察，若将蛋胚放在检卵灯上，则看得更清楚。
（d）用灭菌尖头镊子，两页井拢，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方，并夹住羊膜从刚才穿孔处拉出来（图Ⅻ-6）。
（e）左手用另一把无齿镊子夹住拉出的羊膜，右手持带有26号针头的注射器，刺入羊膜腔内，注入鸡新城疫病毒液 0．1ml。
针头最好用无斜削尖端的钝头，以免刺伤胚胎。
（f）用绒毛尿囊膜接种法的封闭方法将卵壳的小窗封住，于37℃孵卵器内孵育48—72小时，保持蛋胚的钝端朝上。
3．收获
⑴绒毛尿囊膜
（a）用碘酒消毒人工气室上的卵壳，去除窗孔上的盖子。
（b）将灭菌剪子插入窗内，沿人工气室的界限剪去壳膜，露出绒毛尿囊膜，再用灭菌眼科镊子将膜正中夹起，用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状。
然后或用于传代，或用50%甘油保存。
⑵尿囊腔接种法收获尿囊液
（a）将蛋胚放在冰箱内冷冻半日或一夜，使血管收缩，以便得到无胎血的纯尿囊液。
（b）用碘酒消毒气室处的卵壳，并用灭菌剪刀除去气室的卵壳。
切开壳膜及其下面的绒毛尿囊膜，翻开到卵壳边上。
（c）将鸡卵倾向一侧，用灭菌吸管吸出尿囊液。
一个蛋胚约可收获6ml左右尿囊液。
若操作时损伤了血管，则病毒会吸附在红细胞上，尿囊液成为无用。
收获的尿囊液经无菌试验后可在4℃以下的温度中保存。
（d）观察鸡胚，看有无典型的症状。
⑶羊膜腔接种法收获羊水
（a）按收获尿囊液的方法消毒、去壳，翻开壳膜和尿囊膜。
（b）先吸出尿囊液。
（c）再用镊子夹出羊膜，以尖头毛细吸管插入羊膜腔，吸出羊水，放入灭菌试管内，每蛋胚可吸0．5—1．0ml。
经无菌试验后，保存于低温中。
（d）观察鸡胚的症状。
写鸡新城疫病毒接种鸡胚培养后，鸡胚所出现的变化。
附：鸡胚培养法
一、.实验材料
（一）7—11日龄鸡胚
（二）孵卵箱：孵卵箱要有两个，一个39℃，放正常鸡胚用，另一个33—35℃，放接种病毒后的鸡胚。
（三）照明灯，打孔器和卵盘。
（四）其它：注射器，针头，消毒剂（2.5%碘酒和75%酒精），镊子，酒精灯，试管架，蜡和胶布等。
二、接种技术
（一)活胚检查
鸡胚使用前必须进行检查，可根据以下三方面来判断其活死：
⒈血管：活胚可见明显的血管，有时可见血管搏动；死胚血管模糊，成淤血带或淤血块。
⒉胎动：活胚可见明显的自然运动，尤其用手轻轻转动卵时。
但胎龄大于14天胚胎，胎动则不明显，甚至无胎动；死胚见不到任何胎动，胚发红像出血样，有的呈现黑块。
⒊绒毛尿囊膜发育之界线：生活良好之胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成较明显的界线。
必须把上述三方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张或折断沉落，绒毛尿囊膜界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。
(二）接种途径
尿囊腔接种
通常选9一11日龄鸡胚，照检后画出气室边界，在气室交界边缘以上约1mm 处并避开血管作一标记此即为注射点。
在点周围用先用2.5%碘酒消毒，再用75%酒精脱碘。
用打孔器在注射点处打一小孔，勿损伤壳膜。
用注射器注入样品0.2ml，然后用石蜡溶化封口，置33—35℃培养。
于接种后24h内死亡者为非特异性死亡应弃去。
培养72h后进行收获。
收获前鸡胚须置4℃冰箱6h或过夜，不能置时间过长，过长会引起散黄。
如急于收获亦可置-20℃冰箱1h左右，但不能过长，过长会引起鸡胚结冰，再融化时卵黄膜就破碎，卵黄就流出。
预冷的目的是，将鸡胚冻死使血液凝固，避免收获时流出红细胞并同尿液或羊水里的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。
收获时，用碘酒或75%酒精消毒气室部卵壳，用消毒镊子轻轻敲碎气室部卵壳并取走，再用另一无菌镊子撕去气室部壳膜，然后用无菌注射器通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔，吸取尿囊液，置西林瓶内4℃或低温保存待用。
血凝试验
一．仪器设备
一次性注射器，微量血凝板（V型、96孔），微型振荡器，移液器
二．所需试剂
⑴稀释液10×PBS（磷酸缓冲液pH7.0～7.2）
氯化钠8.5g，磷酸二氢钾0.68g，氢氧化钠0.15g，上述成分溶于100ml蒸馏水后高压灭菌，于4℃保存，使用时作10倍稀释。
⑵红细胞保存液（阿氏液）
葡萄糖20.5克，氯化钠4.2克，柠檬酸0.55克，柠檬酸钠8.0克，溶于1000毫升蒸馏水中，调PH值6.8~7.2，分装，115℃15分钟灭菌，低温保存备用。
⑶1%红细胞悬液
用一次性注射器吸取2ml阿氏液，再直接采成年公鸡翅下静脉血液2ml，混匀，转移到离心管中，用1×PBS洗涤红细胞三次，头两次以1500rpm离心5min，
最后一次以2000rpm离心10min。
将1ml离心压积后红细胞加入到100mlPBS中或阿氏液中即配成。
三．操作方法
⑴于微量血凝板的每孔中滴加稀释液1×PBS 50μL，根据被检样品数量定所加排数。
⑵吸取被检尿囊液分别滴加于第一列孔，每个样品50μL，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸取50μL弃之。
最后一列不加样品作空白对照。
⑶于每孔中加入1%红细胞悬液25μL。
⑷置微型振荡器上振荡1min，或手持血凝板绕圆圈混匀。
⑸放室温下（18～20℃）30min，观察结果。
《发育生物学》结课实验设计
鸡胚的病毒培养
姓名：王宇
班级：生科09 2班
学号：2009061671。