病毒的分离培养与动物接种、鸡胚接种法
鸡胚接种实验步骤
鸡胚接种实验步骤
鸡胚接种实验是一种常用于研究病毒感染和疫苗研发的方法。
以下是一般的鸡胚接种实验步骤：
1. 准备工作：
- 确保实验室卫生条件良好，并进行必要的消毒处理。
- 准备所需材料，包括鸡蛋（受精后的鸡蛋）、病毒样品或疫苗、适当的培养基等。
2. 取出鸡蛋：
- 使用无菌器具将鸡蛋从孵化器中取出。
- 用消毒剂擦拭鸡蛋表面，确保表面无菌。
3. 制备操作区域：
- 在实验室台面上准备一个无菌操作区域。
- 使用无菌器具将所需工具（如注射器、刀片）摆放在操作区域上。
4. 接种操作：
- 在无菌操作区域上，使用无菌器具在鸡蛋的空气室区域确定一个合适的接种点。
- 使用无菌注射器将病毒样品或疫苗注入鸡蛋内。
- 注意避免对鸡蛋内的胚胎造成机械损伤。
5. 封蛋：
- 使用无菌聚乙烯封膜或其它适当的封蛋材料将接种点封住，以防止污染和脱水。
6. 孵化：
- 将接种后的鸡蛋放回孵化器中，并根据所研究的病毒或疫苗的特性设定合适的温度和湿度。
- 根据实验需求，确定孵化时间，通常为数天至数周。
7. 结果观察：
- 在孵化结束后，取出鸡蛋，观察胚胎的发育情况。
- 根据研究的目的，可以进行进一步的分析、检测和测量。
需要注意的是，鸡胚接种实验需要在合适的实验室条件下进行，严格遵守实验室安全操作规范，并获得相关机构的许可和伦理审批。
此外，具体的实验步骤可能会因研究目的和病原体的不同而有所变化，所以在进行实验前最好参考相关的专业文献或咨询专业人士。
病原学检查技术
3.绒毛尿囊膜接种
接种：去除卵膜，于绒毛尿囊膜上滴上病毒 封口：用胶布封口，胶布事先用碘酒消毒，并通 培养：放入温箱培育4天，然后收获病毒。
0.1~0.2ml。
过火焰烧去余碘。
3.绒毛尿囊膜接种
收获：
收获前检卵，看人工气室是否仍然存在，如果不存在， 轻轻地吸气室上的孔。用碘酒消毒人工气室上的卵壳，去掉 壳和壳膜至人工气室的边缘，尽量最大范围地暴露绒毛尿囊 膜，用无菌剪子沿人工气室的边缘将接种病毒的绒毛尿囊膜 剪下，低温保存。同时做无菌培养。
4.卵黄囊接种
卵黄囊接种常用于分离和繁殖立克次体，也可用于 分离和传代衣原体。这些大的病原微生物易于在沿卵黄排 列的内胚层细胞中生长
。
4.卵黄囊接种
接种方法：
选用 5 － 6 日龄鸡胚，因为卵黄囊在这个阶段比较大，易 于接种，并为病毒的繁殖提供了一个比较大的表面。检卵后， 用碘酒消毒气室端卵壳，在气室中心的卵壳上钻一孔，再次 用碘酒消毒钻孔处，将注射器的针头经钻孔沿卵的纵轴刺入 3cm左右，进入卵黄囊中，通常注入0.5－1ml接种物。用蜡 熔化封口，35℃－37℃孵育3－8天，视接种的病毒或立克次 体而定。
细胞培养的基本概念
传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被 分开接种到新的培养器皿中。 原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件 下生长的细胞在传代之前称为原代培养。
原代细胞培养
概念：从供体获取组织细胞后在体外进行的首 次培养。 优点：生物学特性未发生很大变化，细胞染色 体仍为二倍体，接近和反映体内生长特性，适 合做药物测试、细胞分化及病毒学方面的实验 缺点：传代次数较多细胞就会衰亡。
注意事项
病毒的鸡胚接种技术
病毒的鸡胚接种技术目的要求掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用。
仪器及材料受精卵、恒温箱、照蛋器、接种箱、蛋架、一次性注射器（1～5ml）、中号镊子、眼科剪和镊子、毛细吸管、橡皮乳头、灭菌平皿、试管、吸管、酒精灯、试管架、胶布、蜡、锥子、锉、煮沸消毒器、消毒剂（5%碘酊棉、75%酒精棉、5%石炭酸或3%来苏儿）、新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗。
方法与步骤（尿囊接种为例）1．选择9～12日龄的健康鸡胚，最好是SPF鸡胚。
为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。
选好后用孵化箱孵化，要注意温度、湿度和翻蛋。
孵化最低温度为36℃，一般为37.5℃，相对湿度为60%。
每日最少翻蛋3次。
健康鸡胚：照蛋时可见清晰的气室、血管及鸡胚的活动。
2．病毒材料的处理怀疑污染细菌的液体材料：加抗生素（青霉素1000IU和链霉素1000μg/ml）置室温1h或4℃冰箱12～24h→高速离心，取上清液→细菌滤器滤过除菌若用新城疫Ⅰ系或Ⅳ系疫苗，则无菌操作用生理盐水将其稀释100倍。
3．照蛋以铅笔划出气室、胚胎位置及接种的位置，标明胚龄及日期气室朝上立于蛋架上。
4．消毒先碘酊后酒精，由内向外呈同心圆状消毒5．打孔用灭菌小锥子在在气室中心或远离胚胎侧气室边缘，避开大血管进行打孔，孔径以1ml注射器针头容量刺入为宜。
6．注入病毒材料用一次性1ml注射器吸取新城疫病毒液垂直或稍斜插入气室，刺入尿囊，向尿囊腔内注入0.1～0.3ml。
7．封孔并继续孵化注射后，用熔化的石蜡封孔，置温箱中直立孵化3～7d。
孵化期间，每6h照蛋一次，观察胚胎存活情况。
弃去接种后24h内死亡的鸡胚，24h以后死亡的鸡胚应置0～4℃冰箱中冷藏4h或过夜（气室朝上直立），一定时间内不能致死的鸡胚也放冰箱冻死。
8．收毒收毒原则：（1）先冷藏再收毒。
（2）接种什么部位，收集什么部位。
（3）固液分开收集。
（4）无菌收集。
（5）冷冻保存。
收毒方法：无菌操作轻轻敲打并揭去气室顶部蛋壳及壳膜，用灭菌镊子夹起并撕开或剪开气室中央的绒毛尿囊膜，然后用灭菌吸管从破口处吸取尿囊液，注入灭菌青霉素瓶或试管内。
《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验
《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验实验动物在病原微生物中的研究上占有重要地位。
利用实验动物可以进行病原菌的分离鉴定、毒力的检测、制备免疫血清等生物制品；进行各种皮肤试验；建立人工感染的动物模型；进行发病机制、疾病防治以及免疫机制的研究等。
一、实验动物的管理1．实验室常用的动物：家兔、豚鼠、小白鼠、大白鼠、地鼠、绵羊、鸡等，根据实验的目的选择最适宜的动物。
2．实验动物必须与正常动物分开饲养，动物室内要经常保持清洁和空气畅通，并应有防蚊、防蝇、防逃跑及保暖设备。
3．实验动物要精心饲养，喂以适当的饲料并给以充足的水，任何动物也不要断水。
4．实验动物要有详细的记录，包括性别、体重、体表特征(如毛色等)、接种材料、接种日期、接种途径、剂量、次数以及接种变化等。
5．实验动物应做好标记，对较大动物如家兔、豚鼠等可用金属号码牌固定于耳朵上，对较小动物如大白鼠、小白鼠等可用复红(或苦味酸等染料)涂于身体的不同部位，以资识别。
盛装动物的笼具等，也应付以标签。
6．接种后的动物应每天观察1～2次，注意动物的精神状态，活动能力、饮食和大小便情况，体温、注射部位的反应以及全身反应，如不安、耸毛、震颤、弓背、麻痹及死亡等，并应详细记录之。
7．感染动物死亡后，应立即剖检或暂时冻存。
动物的排泄物及使用的笼具等必须严格消毒。
任何用过的动物，不宜再做其他试验。
二、实验动物的选择选择实验动物应注意以下几点：1．易感性：是选择实验动物的首要条件。
2．动物健康：体质健康、发育正常、体重适宜；最好使用自己繁殖的动物，由市场购买的动物至少经过一周的隔离观察，证明无隐性感染方可使用；某些特殊实验应需选用专门喂养繁殖的无菌动物；实验动物应容易获得，便于喂养和管理。
3．动物大小：同一实验应选用大小一致的动物，通常以年龄或体重为标准。
4．性别：某些实验最好选用同一性别，特别是免疫的动物和需要观察较长时间的实验动物。
5．动物品系：某些实验要求使用纯系动物，纯系小鼠用于免疫学、杂交瘤及病毒感染等研究。
第五章_病毒的培养
系列稀释的病毒液
单层细胞
接种病毒
10-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 -11 -12
观察CPE
37℃培养
1. Reed法 lg TCID50 = CPE>50%稀释度对数 + 距离比例×稀释倍比数对数
距离比例 = CPE>50%百分数-50% CPE>50%百分数-CPE<50%百分数
lg TCID50 = CPE>50%稀释度对数 + 距离比例×稀释倍比数对数
= -3 + 0.29 ×(-1) = -3.29
TCID50 = 10-3.29,0.1mL 含义：该病毒稀释至10-3.29,每孔细胞接种0.1mL，半数细胞孔
出现CPE。 病毒毒价:通常以每mL含多少TCID50表示.
4.微载体培养
是在悬浮培养的基础上，结合微载体的细胞培养技术。
微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培 养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收 培养液和化学反应，细胞可贴附其上长成单层。
由于微载体数量较大，所获得的细胞数也比上述常规方法大 为增加，对规模化的细胞或疫苗生产很有吸引力，但增高了 生产成本。微载体有若干型号，已商品化。
0
10-3
5
3
10-4
1
7
10-5
0
8
累计 CPE孔数 无CPE孔数
22
0
14
0
出现CPE孔 比例
100(22/22)
100(14/14)
6
3
1
10
0
18
66.7(6/9) 9.1(1/11)
0(0/18)
鸡传染性贫血―诊断
鸡传染性贫血―诊断本病根据流行病学特点、症状和病理变化可作出初步诊断，血常规检查有助诊断，但最终的确诊需要作病原学和血清学等方面的工作。
（一）病毒分离：病毒的分离培养是CIAV鉴定中最常用的方法。
肝脏含有高滴度的病毒，是分离CIAV病毒的最好材料，可将肝脏制成匀浆，离心取上清液，加热70℃5min或用氯仿处理去除或灭活可能的污染物，用于雏鸡、鸡胚或细胞培养接种。
1.接种雏鸡：1日龄SPF雏鸡是初次分离CIAV最特异、最可靠的动物实验方法。
用肝脏病料1∶10稀释肌肉或腹腔接种1日龄SPF 雏鸡,每只0.1ml，观察典型症状和病理变化。
2.接种鸡胚：用肝脏病料卵黄囊接种4～5日龄鸡胚，无鸡胚病变，孵出小鸡发生贫血和死亡。
3.接种细胞培养物：MDCC-MSB1常被作为体外分离鉴定CIAV的主要细胞。
病鸡的肝、脾、胸腺、骨髓等均可作为分离病毒用的病料。
初次接种病料的细胞看不到细胞病变，一般须经过5～6次盲传后，可见感染细胞肿胀、边缘破裂，死亡细胞逐渐增多，最后细胞大部分死亡，表明有CIAV感染。
(二)血清学诊断：目前已建立的CIAV血清学诊断技术有VN、IFN、ELISA，可用于检测感染鸡血清中的抗体。
其中，ELISA是检测CIAV 抗体的一种良好的血清学方法，其敏感性高，操作简便、快速，所需血样少，可以同时检测大量样品，利于大规模普查。
近年来以重组VP1、VP2、VP3做为包被抗原建立的ELISA技术取得了重大进展，可用以检测CIAV抗体。
与传统的全病毒抗原相比，重组抗原更具优势。
可用免疫荧光抗体试验和免疫过氧化物酶试验检测发病鸡组织或细胞培养物中的病毒抗体。
(三)分子生物学诊断：目前有许多分子生物学方法，如核酸探针技术和PCR等技术，用于组织或细胞中病毒的检测，其敏感性和特异性都比较高。
(四)鉴别诊断：该病应该与成红细胞引起的贫血、MDV和IBDV感染、腺病毒感染、球虫病以及高剂量的磺胺类药物和真菌毒素中毒进行区别。
病毒的培养方法哪几种
病毒的培养方法哪几种病毒的培养方法是研究和了解病毒特性、生命周期以及对人类和生态系统的影响的重要手段。
通过培养病毒，科学家可以进一步研究病毒的基本特征、复制和传播机制，以及开发疫苗和药物。
本文将介绍几种常见的病毒培养方法。
一、细胞培养法细胞培养法是常见的病毒培养方法之一。
病毒在体内是依赖于宿主细胞才能生存和复制的，因此通过培养感染体细胞的方式，可以实现病毒的大规模培养。
这种方法需要选取合适的细胞系，如HeLa细胞、Vero细胞等，将病毒接种在细胞培养基中，让病毒感染细胞并进行复制。
通过观察细胞的形态学变化、病毒颗粒释放和细胞死亡等现象，可以判断病毒的感染情况和生命周期。
二、鸡胚培养法鸡胚培养法常用于培养禽类和一些昆虫病毒。
在鸡胚培养技术中，科学家会将病毒接种到受精鸡蛋的卵黄囊或坏死胚中，利用卵黄囊提供的营养和鸡胚的生长环境，促进病毒的复制和生产。
通过观察鸡胚的发育情况和病变症状，可以判断病毒感染的程度和效果。
三、动物模型法动物模型法常用于病毒研究的初期，用于检测病毒分离和扩增的能力。
科学家会选择合适的动物种类，如小鼠、大鼠、兔子或猴子等，将病毒接种到动物的体内。
通过观察动物是否出现病征、病毒在体内的分布和病理变化，判断病毒的毒性和致病能力。
然而，由于动物模型法具有伦理和实验条件限制，现在越来越多的科学家转向细胞培养法和分子生物学技术。
四、感染性核酸和蛋白质培养法感染性核酸和蛋白质培养法是一种近年来发展起来的新技术。
通过利用已经纯化的病毒核酸或蛋白质，将其与适当的宿主细胞或胚胎培养在一起，使其感染并继续生长。
这种方法可以绕过病毒的复制步骤，直接利用病毒的核酸或蛋白质进行培养，从而更快地得到病毒产物。
然而，由于该方法无法复制整个病毒生命周期，可能会影响病毒的完整性和活性。
总结起来，病毒的培养方法有细胞培养法、鸡胚培养法、动物模型法和感染性核酸和蛋白质培养法等。
不同的方法适用于不同类型的病毒和研究目的。
鸡胚接种实验报告
一、实验目的1. 掌握鸡胚接种病毒的方法和步骤。
2. 了解病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
3. 学习病毒分离和培养的基本原理。
二、实验原理鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法。
病毒接种于鸡胚后，能够在鸡胚中繁殖，从而便于观察和分析病毒的生物学特性。
本实验主要采用尿囊腔接种法，将病毒接种于鸡胚尿囊腔内，观察病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
三、实验材料1. 实验动物：9-11日龄的鸡胚。
2. 实验试剂：新城疫病毒悬液、生理盐水、碘酒、酒精、消毒棉球等。
3. 实验仪器：照蛋器、无菌手术刀、镊子、注射器、剪刀、平皿等。
四、实验方法1. 鸡胚准备：取9-11日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒鸡胚蛋壳，用手术刀在鸡胚气室处划一小孔，用注射器吸取适量新城疫病毒悬液。
2. 尿囊腔接种：将鸡胚置于卵盘上，气室端向上，用注射器将病毒悬液注入鸡胚尿囊腔内，注入量约为0.1-0.2ml。
3. 孵育：将接种后的鸡胚放入37℃孵卵箱中孵育48-72小时。
4. 观察：定期观察鸡胚的生长发育情况，记录死亡、畸形等现象。
5. 病毒分离：取出死亡鸡胚，无菌操作下取出尿囊液，进行病毒分离和培养。
五、实验结果1. 接种后，部分鸡胚出现死亡现象，死亡时间集中在接种后24-48小时。
2. 死亡鸡胚的尿囊液中检测到新城疫病毒。
3. 成活鸡胚生长发育正常，未出现明显异常。
六、实验讨论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法，适用于多种病毒的研究。
2. 尿囊腔接种法是一种常用的鸡胚接种方法，适用于新城疫病毒、流感病毒等多种病毒。
3. 本实验结果表明，新城疫病毒能够在鸡胚中繁殖，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
七、实验结论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法。
2. 尿囊腔接种法适用于新城疫病毒等多种病毒的分离和培养。
3. 本实验成功分离和培养了新城疫病毒，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
八、实验心得1. 实验过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
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【方法】
1．1毫升注射器抽取脑炎病毒悬液0.1毫升，去除注射器
内的气泡。 2 ．取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指 和食指握住小白鼠的头部，左手掌轻轻按住小白鼠的 体部。 3．右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右颊部皮毛 4 ．右手拿住注射器在小白鼠眼与耳根连线的中点略偏 耳朵的方向注入，进入颅腔，进针2—3毫米，不要插 得太深，注射量为0.02—0.03毫升。 5 ．注射完毕，将用过的注射器煮沸消毒，动物一般在 3—4天开始发病，食欲减退，活动迟纯、耸毛、振颤、 慢慢发展为麻痹瘫痪而死亡。
一、标本采取的原则
1. 病毒标本的采取应尽早为好. 2.由于大多数病毒对热不稳定，应该立 即接种，如果不能及时接种或需保存， 一般置50％甘油盐水4℃或一20℃以下 保存。
二、标本的处理
• （一）除菌处理 粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位 /毫升，置4℃过夜。 鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/ 毫升，置4℃作用4小时。 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、 呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入 等量的乙醚4℃过夜除菌。
尿囊腔接种
• 【材料】 • 新城鸡瘟病毒10毫升稀释液，10—12日 龄鸡胚，卵垫， 1 毫升无菌注射器及 14 号针头，小锉了刀，橡皮乳头、大头针， 眼科镊子及小镊子，无菌培养皿、无菌 生理盐水，碘酒，酒精棉球。
• 【方法】 选9—11日龄鸡胚，照检后划出气室和胎 位，在气室边缘上2—8毫米处避开血管 作一标记，将碘酒在此消毒后，用蛋钻 钻一小扎（勿损伤壳膜），用注射器注 入病毒0.1—0.2毫升，然后用溶化石蜡 封口，置33—35℃孵育（时间见表12— 6）。
病毒的分离培养与动物接种、 鸡胚接种法
练习内容
• 1．小白鼠脑内接种法 • 2．小白鼠滴鼻感染法 • 3．鸡胚尿囊腔接种法Fra bibliotek目的要求
• 1．了解病毒分离的方法 • 2．了解病毒接种的实验途径 • 3．掌握鸡胚尿囊腔接种的方法与尿囊 液收获的方法
病 毒 的 分 离
• 一、标本采取的原则 • 二、标本的处理 • 三、病毒的分离方法
• 2．用左手取出小白鼠握在掌中，大拇指及食 指抓住耳部使其头部朝前并呈仰卧位 置，另 一手将吸有病毒悬液的滴管，慢慢滴于管口 而不使其自然掉落呈悬滴状，将悬滴 靠至动 物鼻尖，动物在呼吸时带人，一般滴入0.03— 0.05毫升，不宜过多，感染材料如被吸人肺内， 容易引起动物肺水肿，往往于接种后一天内 死亡。 • 3．动物慢慢苏醒，在罐中逐日观察，通常在 数日后开始发病，发病的症状常为耸毛，咳 嗽、不食、甚至死亡，解剖可观察到肺脏有 肺炎或出血性病灶。
• （2）剖检及收获 • 收获前鸡胚应置 4 ℃冰箱过夜，使鸡胚 内血液凝固。收获时，用碘酒将气室部 卵壳 消毒，将气室处卵壳剥去，（不 要将碎片落入壳膜）。然后用无菌手术 刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切勿压破 卵黄囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉 素小瓶内，于低温保存。
三、病毒的检查
• （一）直接检查法 1．痘疱的形成 2．鸡胚死亡 （二）间接检查法
• （三）检卵 鸡卵孵育 4 ～ 5 天后，即可用检卵器检查鸡胚发 育情况（二天一次）。 1．未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 2 ．活鸡卵：鸡胚发育 4 天后，在检卵器上就可 见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡 胚），有明显的自然转动。 3．死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎 活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎 频死或已经死亡，应将其挑捡出来。 鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和 胚胎的位置待用。
二、病毒的鸡胚接种、培养与 收获
• （一）接种 实验室经常应用的接种途径有四种： 绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔和卵黄囊 接种等。（见表12—6）
鸡胚培养及病毒的鸡胚接种法
• 一、鸡胚的孵育 （一）鸡卵的选择 一般都选新鲜、10天以内莱亨鸡（Leghorn bird）的受精卵以保证规格质量上的一致 （二）孵育 孵育时可将鸡卵放人卵箱内进行,气室向上， 孵育的最适温度为38--39℃，相对湿度为40— 70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次， 以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。
小白鼠滴鼻感染法（示教）
• 【材料】 • 小白鼠、流盛病毒的鼠肺适应株悬液、无消 毛细吸管、无菌小试管、乙醚、棉球及动物 罐等。 • 【方法】 • 1 ．首先将小白鼠 1 只投于带盖的，内放有浸 蘸乙醚的棉球的容器内行全身麻醉。注意麻 醉的深度，一般不宜太深或太浅，太深时易 遭致麻痹死亡或吸人性肺炎，太浅则易在滴 注时打喷嚏。
动物接种法
• 动物接种是最原始的病毒培养方法，常 用的动物有小白鼠、大白鼠、田鼠、豚 鼠、 家兔，有时也用猴、猿、猩猩等。 接种时要根据病毒对动物，组织细胞等 嗜性不同而选 择特定的部位，如鼻腔、 皮内、皮下、腹腔、脑内、静脉等（见 表12—2）。
小白鼠脑内接种法（示教）
• 【材料】 1. 脑炎病毒（小白鼠脑脊髓炎）悬液：脑 组织先用无菌生理盐水洗去血液，再加 100 ％脱脂奶水研磨成 10 毫升悬液，离 心沉淀30分钟，吸取上清液。 2.小白鼠：3周龄，体重6—8克。
• （二）研磨和稀释 对脑、脊髓等组织标本首先应经研 磨器或乳钵中充分研磨后，加稀释液 （PH7.6肉汤或10％脱脂牛乳生理盐水 或0.5％水解乳蛋白Hanks液）制成组织 悬液，然后经2000转／分离心20分钟。 必要时可加抗生素处理（同上）。
病毒的分离培养的方法
• 动物接种法 • 鸡胚培养及病毒的鸡胚接种法 • 组织培养与病毒的细胞感染法