二氢叶酸还原酶和谷氨酰胺合成酶双基因筛选扩增系统对外源基因表达的影响

drug pressure in dual selection system was an efficient and simple method to increase the expression of foreign gene
in mammalian cells. 【 Key words】 Tetrahydrofolate dehydrogenase ; Glutamine synthetase ; Gene amplification ; Methotrex2
因筛选扩增系统〔2〕。谷氨酰胺合成酶在 ATP 水解 提供能量时 ,利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰 胺 ,在缺乏细胞外谷氨酰胺的培养条件下 ,加入谷氨 酰 胺 合 成 酶 的 抑 制 物 ( methionine sulphoximine , MSX) ,可使 GS 基因及与之相连的目的基因扩增 ,达 到提高目的基因表达水平的目的 。在病毒所遗传室 的研究工作中发现〔3 ,4〕, GS 系统表达水平高 ,但细胞 长期连续培养时 ,生长状况不佳 ,而 DHFR 系统表达 水平较 GS 系统低 ,但细胞生长状况良好〔4〕。所以 , 建立一个既能高效表达目的基因 ,又能保持良好细 胞形态的筛选扩增系统 ,对于获得具有生产价值的 基因工程细胞系很有意义 。我们使用 DHFR 和 GS 双基因筛选扩增系统 ,研究了不同药物选择方式对 外源基因表达和细胞生长状态的影响 。
gene as target gene ,two plasmidsre were constructed :pDC2T184 and p GC2T184 where DHFR and GS gene were used respectively as the selective amplification marker. They were cotransfected into CHO dhfr’cells to establish dual
氢叶酸还原酶 (dihydrofolate teductase ,DHFR) 系统〔1〕。 二氢叶酸还原酶能够被叶酸类似物氨甲喋呤 (meth2 otrexate ,MTX) 所抑制 ,用含有目的基因及与之相连 的 DHFR 基因的重组质粒转化 CHO dhfr - 细胞 ,利用 浓度不断提高的 MTX 选择抗2MTX 的细胞系 ,其中 DHFR 基因及与之相连的目的基因一起扩增 ,从而 使目的 基 因 高 水 平 表 达 。谷 氨 酰 胺 合 成 酶 ( glu2 tamine synthetase , GS) 系统是近年来新发展的一种基
gene amplification and selection system of DHFR plus GS gene and respectively transfected to establish single gene
amplfication and selection system of DHFR or GS gene. Three selective methods in dual selective system to compare expression efficiency of hTPO were designed :the first method (DG) was to use drug pressure of MTX ,then use MSX; the second method ( GD) was reversed ; the third method was simultanetously to use MTX and MSX as drug pessure. Results DHFR + GS dual system had not only higher gene amplification efficiency but also higher level expression. There was no distinct affect in different method of drug pressure. Conclusion MTX plus MSX dual
ate dehydrogenase
基因扩增是提高外源基因在哺乳动物细胞表达 的重要途径 ,目前最常用的基因筛选扩增系统是二
基金项目 “: 八六三”高科技发展计划资助项目 (863202207202201 , 8632102207201202) ;国家杰出青年基金资助课题 (39525001)
作者单位 :710061 西安 ,西安交通大学 (王志云 、楚雍烈) ;中国 预防医学科学院病毒学研究所 (魏博 、田淑芳 、阮力) ;石家庄华北制 药厂 (张玉倩)
1 材料和方法
111 质粒 pDCT184 与 p GCT184 两种质粒均由中国预 防医学科学院病毒学研究所遗传免疫 室 构 建〔4〕 , 前 者含 DHFR 基因 ,后者含 GS 基因 ,均以 T184 基因 (hT2 PO N 端 184 个氨基酸基因片段) 为靶基因 ,除筛选 基因不同外两质粒结构完全相同 。 112 细胞株与培养基 CHO dhfr - 细胞 ,由中国预 防医学科学院病毒学研究所遗传免疫室保存。 DMEM 培养基为 Gibco BRL 产品 。 113 DHFR 和 GS 双基因及单基因筛选扩增系统的 转染与 筛 选 用 磷 酸 钙 沉 淀 法 同 时 将 pDCT184 和 p GCT184重组质粒转染 CHO dhfr - 细胞〔9〕,用无谷氨 酰胺 ,也无次黄嘌呤和胸腺嘧啶 ,但含有 25 μmolΠL MSX 的 DMEM 培养液稀释培养 ,混合细胞集落 ,用 于不 同 药 物 加 压 的 研 究 。同 样 方 法 将 pDCT184 和 p GCT184 重组质粒单独转染 CHO dhfr2细胞 ,使用无次 黄嘌呤和胸腺嘧啶的 DMEM 或含次黄嘌呤 、胸腺嘧 啶和 25μmolΠL MSX ,但无谷氨酰胺的 DMEM 分别筛 选 DHFR 和 GS 系统转化细胞 。 114 DHFR 和 GS 双基因及单基因筛选扩增系统不 同的药物加压方式 将双基因系统的混合细胞集落 分成三组 ,按以下三种方法加压 : ①DG方式 :在细胞 传代过程中 ,先分别以 MTX 1 ×10 - 7 ,5 ×10 - 7 和 1 × 10 - 6 molΠL 浓度逐步培养 ,然后以 MSX 50 ,100 和 200 μmolΠL 浓度逐步培养 ; ②GD 方式 : 先加 MSX ,然后 加 MTX ,其相应药物浓度与 DG方式相同 ; ③共加压 方式 :同时增加 MTX 与 MSX 浓度 ,相应药物浓度与
【主题词】 四氢叶酸脱氢酶 ; 谷氨酰胺合成酶 ; 基因扩增 ; 甲氨喋呤
Dual gene amplification and selection system with dihydrofolate reductase and glutamine synthetase genes effectively increase the foreign gene expression WANG Zhiyun 3 , WEI Bo , TIAN Shuf ang , ZHANG Yuqian , WANG Xiuping , CHU Yonglie , RUAN Li . 3 Xi’an Jiaotong University , Xi’an 710061 ,China
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中华实验和临床病毒学杂志 2002 年 3 月第 16 卷第 1 期 Chinese J Exp Clin Virol ,March 2002 ,Vol 16 ,No. 1
【摘要】 目的 研究二氢叶酸还原酶 (DHFR ,D) 与谷氨酰胺合成酶 ( GS , G) 单基因和二氢叶酸还 原酶与谷氨酰胺合成酶 (DHFR + GS ,DG) 双基因筛选扩增系统对外源基因表达的影响 。方法 选择 N 端部分 TPO 基因 (T184 ) 作为靶基因 ,以 DHFR 和 GS 基因作为筛选及扩增基因构建重组质粒 pDCT184 与 p GCT184 ,将两种质粒分别转染 CHO dhfr - 细胞形成单基因筛选扩增系统 ,两种质粒共转染 CHO dhfr 细胞形成双基因筛选扩增系统 。在双基因筛选扩增系统中设计三种药物加压方式 。第一种为 DG方 式 :先用 DHFR 系统压力 (MTX) 筛选 ,再用 GS 系统压力 (MSX) 筛选 ;第二种为 GD 方式 :先用 GS 系统 压力筛选 (MSX) ,再用 DHFR 系统压力筛选 (MTX) ;第三种为共加压方式 :同时利用 DHFR 与 GS 系统 压力筛选 (MTX + MSX) 。通过比较 T184 基因拷贝数及表达水平来研究 DHFR 和 GS 双基因筛选扩增系 统对外源基因表达的影响 。结果 T184 基因拷贝数及表达水平在 DG 双基因筛选扩增系统不同药物 加压方式中 ,均比 DHFR 或 GS 单基因筛选扩增系统高 ,但不同药物选择方式没有明显差异 。结论 采用 DHFR + GS 双基因筛选扩增系统共加压方式是提高 CHO dhfr - 细胞表达外源基因的有效途径 。
中华实验和临床病毒学杂志 2002 年 3 月第 16 卷第 1 期 Chinese J Exp Clin Virol ,March 2002 ,Vol 16 ,No. 1
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·论著·
二氢叶酸还原酶和谷氨酰胺合成酶双基因 筛选扩增系统对外源基因表达的影响
王志云 魏博 田淑芳 张玉倩 王秀平 楚雍烈 阮力
DG方式相同 。单基因系统分别使用 MTX 或 MSX , 相应药物浓度递增同上 。 115 染色体中 T184 基因的检测 11511 表达 T184 基因 CHO 细胞染色体 DNA 的提取 应 用 Gibco BRL 公 司 基 因 组 DNA 分 离 DNA ZOLTM ,进行 CHO 细胞染色体 DNA 的提取 。 11512 表达 T184 基因的 CHO 细胞染色体 DNA 的打 点杂交 CHO 细胞染色体以 5 ,215 ,1125 和 01625μg 点样于 NC 膜上 ,含有 T184 基因的质粒以 50 ,10 ,2 和 014 ng 作对照点于膜上 ,根据一定量细胞染色体与 T184针杂交颜色深浅度的比较 ,通过质粒数量确定 外源基因拷贝数 。CHO 细胞基因组 DNA 量为 3 pgΠ 细胞 ,pUC182T184 质粒相对分子质量为 118 ×106 。 11513 促 TPO 依赖细胞生长活性的测定 Baf 3Π mpl 细胞系是以基因工程技术将 TPO 受体基因 mpl 导入而构建的 TPO 依赖细胞株 ,其增殖依赖于 TPO 活性蛋白 。在 96 孔板中将 TPO 标准品与待测样品 均做 5 倍稀释 (5 - 1 ～5 - 10 ) ,同时设阴性对照及空白 对照 。进行 MTS 显色 , 测吸光度 值 A490 nm , 以刺激 TPO 依赖细胞最大增殖的半数效应量 EC50 标定 TPO 活性蛋白 。