钙离子对体外培养皮肤角质形成细胞增殖与分化的调控作用
人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定
人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定何黎顾华昆明医学院第一附属医院皮肤性病科云南[摘要]目的：探索实验条件下人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定。
方法：利用细胞工程方法进行组织分离及细胞培养：通过免疫组化方法，利用角蛋白单克隆抗体对培养的角质形成细胞进行鉴定，并利用表皮干细胞的相对特异标识分子——CK19对其进行检测分析。
结果：表皮自真皮较完整分离，电镜及免疫组化证实培养细胞为角质形成细胞，免疫组化结果显示：CK反应阳性，部分细胞CK19阳性，表明有表皮干细胞存在。
结论：体外分离、培养角质形成细胞成功，且分离得到的角质形成细胞中有表皮干细胞存在。
[关键词]：角质形成细胞表皮干细胞细胞培养角蛋白——19对于烧伤、急性创伤、某些疾病导致的皮肤缺损，尤其是大面积烧伤一直以自体皮移植作为首选方案，而自体皮肤不足是临床遇到的主要问题。
随着细胞培养技术和组织工程的出现，使许多脏器或组织体外重建成为可能。
人工皮肤的研制就是一个典型例子。
在这一技术中，种子细胞——角质形成细胞的体外培养，以及体外分离到的角质形成细胞中是否有在体外能大量增殖的表皮干细胞决定了能否成功构建人工皮肤。
为此本课题采用组织分离方法及细胞培养方法进行角质形成细胞体外分离及培养；通过免疫组化方法，利用人广谱单克隆抗体对培养细胞进行鉴定；并利用CK19对体外培养细胞中是否有表皮干细胞进行检测。
材料和方法一、材料1、取材选择6-26岁健康男性，行包皮环切术切除的包皮。
2、主要培养基及试剂(1)磷酸盐缓冲溶液（PBS和D-Hank’s液）：（2）培养基：K-SFM（Gibco公司），编号：37010，内含2.5ug表皮细胞生长因子（EGF）和25mg小牛垂体(BPE)：（3）分离酶：dispase（4）胰蛋白酶；（5）抗人广谱角蛋白单克隆抗体；（6）CK19单克隆抗体；（7）SP 超敏免疫组化试剂盒。
二、方法1、取材将包皮环切术切除的健康包皮组织放入50ml离心管中（内装10mlDMEM培养基，含青、链酶素及硫酸庆大酶素）。
钙离子信号在细胞中的作用
钙离子信号在细胞中的作用细胞是生命的基本单位，所有的生命活动都在细胞中进行。
而钙离子作为一种重要的信号分子，在细胞内发挥着至关重要的作用。
在细胞内，钙离子通过不同的途径进入，并通过与各种蛋白质结合来调控细胞的生命活动，包括细胞分化、凋亡、代谢等多个方面。
一、钙离子信号在细胞分化中的作用钙离子信号在细胞分化过程中发挥着重要的作用。
研究表明，钙离子通路能够调控基因的表达，从而影响细胞的分化和功能。
比如，钙离子通路与调控心肌肌纤维的表达有关，调控胚胎发育、骨骼肌的分化和神经元的发育。
在分化过程中，钙离子能够调控转录因子的活性，进而调节基因的表达，从而控制细胞的命运，如分裂、增殖、分化等。
二、钙离子信号在细胞凋亡中的作用细胞凋亡是一种程序性死亡，它对于维持正常细胞的数量和功能十分重要。
钙离子通路在细胞凋亡中也发挥着关键性的作用。
经过多年的研究，发现钙离子通过调节蛋白酶的活性来诱导细胞凋亡。
当細胞內的钙浓度增高时，会使钙离子结合到促进凋亡的酶上，进而激活蛋白酶，引发凋亡过程。
三、钙离子信号在细胞代谢中的作用钙离子通路在细胞代谢过程中也起着关键性的作用。
细胞代谢分为两类：有氧代谢和无氧代谢。
有氧代谢在线粒体中进行，而无氧代谢则在细胞质中进行。
钙离子通过调节线粒体和细胞质内的酶活性来影响代谢。
通过钙离子通路的调节，可以促进或抑制葡萄糖代谢、脂肪代谢等代谢过程。
相比于无氧代谢，有氧代谢更为高效，这也从侧面证明了钙离子通路在细胞代谢中的重要性。
综上所述，钙离子通路在细胞中具有特别重要的作用。
通过调控细胞分化、凋亡、代谢等过程，它对细胞的功能和命运起着关键性的作用。
近年来，尽管在研究钙离子通路的生物学功能方面已经有了很大的发展，但我们在理解钙离子通路的生物学基础、调控和谐动态、疾病预防以及新药物研发等方面仍需深入探索。
细胞内钙离子浓度的调控与功能
细胞内钙离子浓度的调控与功能细胞内钙离子是细胞中最重要的信号分子之一。
钙离子在细胞中扮演着多种多样的角色，包括运动、分泌、增殖、凋亡等。
细胞内钙离子的浓度很大程度上决定了这些生物学过程的进行。
因此，钙离子浓度需要在细胞内得到精确的调控。
细胞内钙离子来源细胞内钙离子可以从细胞内部或外部来源。
其中，细胞内来源主要包括内质网和线粒体。
内质网与钙离子的关系是比较密切的，其中的钙离子可以通过内质网钙泵、内质网钙离子通道等通道进行释放或吸收，从而调控细胞内钙离子浓度。
线粒体则与细胞能量代谢有关，在细胞膜电位发生变化时，线粒体可以释放钙离子，进而影响ATP的产生。
细胞外来源主要包括来自细胞外液的钙离子，它可以通过胞外钙离子通道进入细胞内，从而影响细胞内钙离子浓度。
钙离子调控的机制钙离子的调控机制包括钙离子通道和钙离子泵的调控等。
细胞膜、内质网和线粒体等结构都存在相应的钙离子通道和钙离子泵。
钙离子通道是由膜糖蛋白组成的，可以形成离子通路，使钙离子进入或离开细胞。
有三种类型的钙离子通道：电压门控钙离子通道、配体门控钙离子通道和趋化药门控钙离子通道，它们在单个细胞内可以相互作用而发挥不同的生物学功能。
钙离子泵则是通过卡路里三磷酸(ATP)将钙离子从细胞内排出的一种细胞膜蛋白。
细胞内的钙离子泵主要有两种：ATP酶(directed Ca2+ATPase)和钙离子交换(antiport)膜蛋白。
钙离子的功能细胞内钙离子在生物学过程中有很多重要功能。
例如，在胚胎发育过程中，细胞内钙离子可以影响胚胎的结构与功能，影响细胞的分化和增殖。
此外，钙离子还可以调控分泌，使胰岛素分泌适量增加，促进新陈代谢的正常进行。
钙离子也在细胞黏着和迁移过程中发挥了重要作用，是细胞信号转导的重要组成部分之一。
在免疫系统中，钙离子的调控也非常重要。
淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞等均含有钙离子信号参与对外源性刺激的反应。
同时，在心血管系统、神经系统等多个生物学系统中，钙离子都起着重要作用。
钙离子对鼠角质细胞生长和分化的影响
ｌ 卷 ５ 期 ８ ２０ ０ ２年 ９月
生
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程
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Ｖｏ ． ８ １ １
Ｎｏ． ５
Ｃ ｉｅｅＪ ｕｎ ｌｏ Ｂｉｔ ｈ ｏｏ ｙ ｈｎｓ ｏ ｒａ ｆ ｏｅ ｎ ｌｇ ｃ
Ｓｅ ｔｍｂｅ ２ ０２ ｐｅ ｒ ０
钙 离 子 对 鼠 角 质 细 胞 生 长 和 分 化 的 影 响
细 胞 生 长 、 化 、 增 以 及 老 化 的影 响 。 分 扩
１ 材 料 与 方 法
１ １ 原 代 角 质 细 胞 的 分 离 ．
细 胞 以 ０ ８×１ ｅ ｓｃ ２的 密度 接 种 到 含 有 ０ ． ０ｃｌ ／ｍ ｌ 、
０． 、 ． 、 ．ｍｍ ｌＬ Ｃ ２ 浓 度 的 方 瓶 （ Ｕ Ｃ） ， ２ ０ ６ １０ ｏ ａ ／ Ｎ Ｎ 中 培
当细 胞 长 满 方２ ％胰 酶进 行 消 化 。 当细 胞 变 圆 、 落 后 加 入 ．５ 脱
等量 小 牛 血 清 终 止 胰 酶 活 性 。 细 胞 悬 液 用 ２０ ００ ｒ ｉ的 速 度 离 心 ５ ｉ ／ ｎ ｍ ｍ ｎ后 倒 去 上 清 ， Ｂ Ｐ Ｓ清 洗 ２遍 ， 加 入 无 血 清 培 养 基 。 该 角 质 细 胞 无 血 清 培 养 基 以
１２ 细 胞 传 代 培 养 ．
体外 培 养 过 程 中很 容 易 发 生 分 化 和 衰 老 ， 致 体 外 导 寿命 很 短 ， 因此 如 何 在 体 外 大 量 扩 增 具 有 活 性 和 功
能 的 角 质 细 胞 一 直 是 皮 肤 组 织 工 程 中亟 待 解 决 的课 题 。 表 皮 细 胞 中 的 钙 离 子 梯 度 （ 底 层 最 低 ， 粒 层 基 颗
钙离子对体外培养皮肤角质形成细胞增殖与分化的调控作用
钙离子对体外培养皮肤角质形成细胞增殖与分化的调控作用【摘要】目的观察无血清培养中不同钙离子浓度对皮肤角质形成细胞(Kc)增殖与分化的影响，为角质形成细胞的体外扩增和人工表皮形成提供依据。
方法取第二代新生兔背皮肤角质形成细胞，按0.5×104/cm2细胞密度接种于含不同浓度CaCl2角质形成细胞培养液的96孔板中，培养1周，每日观察细胞生长情况，至第7日以MTT法检测OD值。
结果当CaCl2浓度低于5mg/L时，细胞贴壁增殖缓慢，甚至无法贴壁；浓度为12.5mg/L 时Kc呈单层快速生长，并能保持较好的表型，是体外Kc培养扩增的最适钙离子浓度；当CaCl2的浓度达到25mg/L时，Kc 形成复层，集落中央出现大量分化程度较高的角化细胞和角化物，周边仍存在增殖能力较强的单层Kc，逐渐向四周扩展。
随着Ca2＋浓度的增高，细胞角化程度也随之增高。
结论 Ca2+浓度对体外培养的Kc贴壁、增殖、分化等不同阶段产生影响，通过控制无血清培养液中Ca2+浓度可以调控Kc的增殖和分化。
【关键词】钙离子角质形成细胞分化人工皮肤组织工程Calcium is one of the key factors adjusting proliferation and differentiation of epidermal keratinocytes cultured in vitro【Abstract】 Objective To explore the effects of calcium at different levels on proliferation and differentiation of epidermal keratinocytes cultured in serum free medium in vitro' which is the base of tissue engineering skin.Methods Second passage epidermal keratinocytes of neonatal rabbits were seeded into 96-poles plate according to the cell density of0.5×104/cm2'and cultured with serum free medium contained dif ferent levels of CaCl2 for 1 week.The cultured keratinocytes were observed' and identified with immunohistochemical test. Then' MTT test was used to detect the relative growth ratios(RGR) of keratinocytes cultured in K-SFM with different levels ofcalcium.Results The results showed that keratinocytes grown slowly inK-SFM at the level of 5mg/L CaCl2.As the concentration of CaCl2 was12.5mg/L' keratinocytes grown rapidly in mono-layer keeping its well phenotype. When it grown up to the level of 25mg/L' keratinocytes became stratum and differentiated apparently.Conclusion It is suggested that calcium is one of important factors to decide the growth'differentiation of epidermalkeratinocytes. Two suitable concentrations of calcium could be used to culture keratinocytes and artificial epidermis of tissue engineering in vitro respectively.【Key words】 calcium keratinocyte serum free cultureartificial skin tissue engineering1 材料与方法1.1试剂 K-SFM(GIBCO，不含钙，其完全培养液按说明书添加CaCl2)，大豆胰酶抑制剂(SIGMA)，CaCl2(分析纯，国产)，硫酸链霉素（SIGMA），角蛋白免疫组化试剂盒（武汉博士德公司），MTT（SIGMA），DMSO（AMRESCO），胰蛋白酶(HYCLONE)，中性蛋白酶（SIGMA）。
钙离子在细胞中的调节作用
钙离子在细胞中的调节作用作为生物体内的一种元素，钙离子在细胞中扮演着重要的调节作用。
它能够参与到多个生物学过程中，并且直接影响到细胞的形态和功能。
本文将深入探讨钙离子在细胞中的调节作用。
1. 钙离子的来源钙离子能够从多个来源进入细胞内，其中主要的途径有三个：胞浆内游离钙离子、胞浆外环境钙离子以及内质网与线粒体钙离子。
胞浆内的钙离子主要通过离子泵和离子通道调控，其中细胞膜上的钙离子通道扮演着重要的角色。
胞浆外环境的钙离子能够通过离子通道和转运蛋白进入细胞内，而内质网与线粒体钙离子主要是通过离子通道和载体蛋白进行调节。
2. 钙离子的调节作用钙离子作为一种重要的信号分子，参与到多个细胞过程中。
其中最为重要的是细胞信号转导、胞吞作用和肌肉收缩。
细胞信号转导是指一系列信号分子在细胞内传递的过程，钙离子在其中扮演了重要的角色。
当外界信号分子结合到细胞膜上的受体时，会通过信号转导途径使得胞浆内的钙离子浓度升高。
这样可以刺激各种激酶和磷酸酶的活性，进而调节细胞内异源激活物的释放、细胞黏附和基因表达等多个细胞过程。
胞吞作用是细胞摄取外界物质的一种方式，钙离子在其中也起到了重要的作用。
当细胞需要吞噬某些物质时，会通过离子通道和转运蛋白调节外界环境中的钙离子进入细胞。
这样可以刺激细胞质骨架的变化，进而促进细胞的伸长、分化和迁移等过程。
肌肉收缩是钙离子在细胞中的另一个调节作用。
当肌肉细胞需要收缩时，会通过钙离子的进入和释放调节肌小管蛋白和肌球蛋白的结合和解离过程，从而使肌肉纤维发生收缩。
这是细胞内最为明显的调节作用之一。
3. 钙离子调节失常的影响钙离子调节失常往往会导致多种疾病的发生，包括心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等。
例如，当钙离子离子通道功能异常时，就会导致心脏节律失常和突发性猝死等严重的心血管疾病；而神经退行性疾病则往往是由于神经细胞内的钙离子调节失常导致细胞死亡和退化。
最近的研究还表明，钙离子调节与癌细胞的增殖和转移紧密相关。
钙离子对表皮屏障功能的调节
钙离子对表皮屏障功能的调节Regulation of epidermal barrier functions by calcium 135 综述昊艳1，陈璨1，Peter M Elias2，茼茂强2 WU Yan，CHEN Can，Peter M Elias，MAN Mao-qiang (1．北京大学第一医院皮肤科，北京100034；2．Department of Dermatology，University of California,San Fmncisco，California 94121，USA)【摘要】在正常的表皮内存在着钙离子浓度梯度，自基底细胞层到颗粒层，细胞内、外钙离子浓度由低到高；而角质层中钙离子浓度较低。
这种钙离子浓度梯度对于表皮的增生、分化、细胞间连接及屏障功能起着重要的作用。
细胞外低浓度钙促进角质形成细胞增生；高浓度钙促进角质形成细胞分化、细胞间黏附。
完整的表皮屏障功能是保证表皮钙离子浓度梯度的前提．当屏障功能被破坏后，颗粒层细胞内、外的钙离子浓度降低有促进屏障功能恢复的作用。
随着屏障功能恢复，表皮钙离子浓度梯度也恢复正常。
许多与屏障功能相关的炎症性皮肤病和与表皮松解相关的皮肤病往往伴有表皮钙离子浓度梯度的异常。
【关键词】钙离子；表皮屏障功能；分化；增生与其他离子一样，钙离子对细胞(包括角质形成细胞，KC) 的功能具有重要的调节作用。
它不仅与内分泌、骨骼的形成及递质的传递等有关．与KC的增生、分化以及表皮的屏障功能等也密切相关。
同时，表皮的功能对表皮钙的代谢也具有调节作用。
本文将侧重表皮屏障功能与表皮钙代谢之间的相互影响作一简述。
1钙离子在表皮的分布及钙离子浓度梯度的形成钙离子在KC内以2种形式存在：细胞器结合的钙及胞质内游离的钙。
在基底层细胞中钙离子主要位于线粒体、内质网及高尔基体、胞核及胞质中；在棘细胞层，则主要见于线粒体；在颗粒层，则见于线粒体和板层小体中；角质层中有极少的钙离子【J1。
Ca 2+对角质形成细胞增殖与分化调控的作用研究
［ 摘要］ 目的： 探讨胞外 ｃ ａ 对人角质形 成细胞 （ Ｈ Ｋ Ｃ ） 的增 殖与分化 的调控作用 ， 为组 织工程 皮肤 的研 制提 供依 据。方法： Ｈ Ｋ Ｃ体
外培 养 ， 应用形 态学、 免疫细胞 化学 、 Ｍ Ｔ Ｔ等方法检测胞外 ｃ ａ 对 Ｈ Ｋ Ｃ增殖 与分化 的影响 ， 并利用钙通 道阻滞剂 Ｓ Ｋ ＆ Ｆ ９ ６ ３ ６ ５采 研 究其作用 的可能途径。 结果： Ｃ ａ 为 ０ ． ５ ｅ ｒ ｏ ｔ ｏ ｌ ／ Ｌ时， Ｈ Ｋ Ｃ呈单层 生长 ， 免 疫细胞化 学显 示 Ｈ Ｋ Ｃ呈低分化状态， 当ｃ ａ 为 ｌ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ 与１ ． ５ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ时， 细胞在 ３天后 出现复层生长 ， 免 疫细胞化 学显 示细胞 Ｋ １ ９角蛋 白表达减 少， ｃ ａ 为 ２ ． Ｏ ｍ ｍ ｏ １ ／ Ｌ时表现 出一定 的细胞毒性作用 ， Ｓ Ｋ ＆ Ｆ ９ ６ ３ ６ ５ 可逆转 ｃ ａ 的促 增殖与分化作 用。结论： 胞外 ｃ ａ 在 一定范围 内具有促 Ｈ Ｋ Ｃ分化 与增殖的作用 ，
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作者：章培标，侯宜，侯立中，曲福军，周余来，颜炜群，杨同书【摘要】目的观察无血清培养中不同钙离子浓度对皮肤角质形成细胞(Kc)增殖与分化的影响，为角质形成细胞的体外扩增和人工表皮形成提供依据。
方法取第二代新生兔背皮肤角质形成细胞，按0.5×104/cm2细胞密度接种于含不同浓度CaCl2角质形成细胞培养液的96孔板中，培养1周，每日观察细胞生长情况，至第7日以MTT法检测OD值。
结果当CaCl2浓度低于5mg/L时，细胞贴壁增殖缓慢，甚至无法贴壁；浓度为12.5mg/L 时Kc呈单层快速生长，并能保持较好的表型，是体外Kc培养扩增的最适钙离子浓度；当CaCl2的浓度达到25mg/L时，Kc形成复层，集落中央出现大量分化程度较高的角化细胞和角化物，周边仍存在增殖能力较强的单层Kc，逐渐向四周扩展。
随着Ca2＋浓度的增高，细胞角化程度也随之增高。
结论 Ca2+浓度对体外培养的Kc贴壁、增殖、分化等不同阶段产生影响，通过控制无血清培养液中Ca2+浓度可以调控Kc的增殖和分化。
【关键词】钙离子角质形成细胞分化人工皮肤组织工程 Calcium is one of the key factors adjusting proliferation and differentiation of epidermal keratinocytes cultured in vitro 【Abstract】 Objective To explore the effects of calcium at different levels on proliferation and differentiation of epidermal keratinocytes cultured in serum free medium in vitro' which is the base of tissue engineering skin.Methods Second passage epidermal keratinocytes of neonatal rabbits were seeded into 96-poles plate according to the cell density of 0.5×104/cm2'and cultured with serum free medium contained different levels of CaCl2 for 1 week.The cultured keratinocytes were observed' and identified with immunohistochemical test. Then' MTT test was used to detect the relative growth ratios(RGR) of keratinocytes cultured in K-SFM with different levels ofcalcium.Results The results showed that keratinocytes grown slowly in K-SFM at the level of 5mg/L CaCl2.As the concentration of CaCl2 was 12.5mg/L' keratinocytes grown rapidly in mono-layer keeping its well phenotype. When it grown up to the level of 25mg/L' keratinocytes became stratum and differentiated apparently.Conclusion It is suggested that calcium is one of important factors to decide the growth' differentiation of epidermalkeratinocytes. Two suitable concentrations of calcium could be used to culture keratinocytes and artificial epidermis of tissue engineering in vitro respectively.[!--empirenews.page--] 【Key words】 calcium keratinocyte serum free culture artificial skin tissue engineering 1 材料与方法 1.1 试剂 K-SFM(GIBCO，不含钙，其完全培养液按说明书添加CaCl2)，大豆胰酶抑制剂(SIGMA)，CaCl2(分析纯，国产)，硫酸链霉素（SIGMA），角蛋白免疫组化试剂盒（武汉博士德公司），MTT（SIGMA），DMSO（AMRESCO），胰蛋白酶(HYCLONE)，中性蛋白酶（SIGMA）。
1.2 设备器材超净工作台(国产)，二氧化碳培养箱(SANYO)，倒置生物显微镜(OLYMPUS)，酶联免疫检测仪（国产），塑料培养板（皿）（Nunc）。
1.3 实验动物日本大耳白兔，来自长春208医院动物部。
1.4 实验方法 1.4.1 Kc的分离培养取新生兔背部皮肤，Kc的分离、培养和传代方法及角蛋白(广谱)ABC免疫组化鉴定按文献［1］进行。
1.4.2 Ca2+浓度对Kc增殖分化的影响 (1)取第二代Kc，D-Hank’s离心洗3次后，以不含Ca2+的K-SFM制成细胞悬液，按0.5×104细胞数/孔接种于96孔板，同时添加20μl不同浓度CaCl2，CaCl2终浓度分别为0、
2.5、5、12.5、25、50、100、200、400mg/L，均在36℃ 5%CO2条件下培养1周，每日观察细胞生长情况，1周时以MTT法检测OD值。
(2)取第二代Kc'按1×104细胞数/孔接种于6孔板内盖玻片上，以含12.5mg/L CaCl2的K-SFM 培养1周后，实验组更换为25.0mg/L CaCl2的K-SFM继续培养，待Kc形成复层后再换成无钙K-SFM进行培养，观察Kc的生长情况及形态变化并做角蛋白(广谱)ABC免疫组化染色分析。
2 结果与讨论无血清培养液中Ca2＋的浓度对Kc的生长分化极为重要。
培养液中Ca2+浓度
可影响Kc的增殖分化，其浓度不同，Kc生长状态也不同［2］。
在低Ca2+浓度（0.1mM）条件下，培养的Kc可不形成细胞间连接而迅速扩增，而通过增加胞外Ca2+浓度（1.2～2.0mM），可诱导发生多种变化，包括形成复层、桥粒和黏着连接［3，4］。
钙是细胞分化过程的一个首要条件，尤其是复层及桥粒的形成和聚集。
同时，也是鳞状细胞分化中表皮谷氨酰胺转移酶激活的前提。
低浓度Ca2+（0.05～0.1mM）下，体外培养的人Kc不能集聚桥粒，也不能出现复层，即使退出细胞周期并且仍然合成外皮蛋白和桥粒蛋白［5］。
通过增加钙浓度到生理水平（1.2mM），Kc在24h内即可形成复层［6，7］。
因此，可以通过控制Ca2＋浓度实现控制Kc的增殖与分化。
体外成功构建组织工程人工皮肤，首先需要获得大量的具有增殖能力的Kc。
因此，Kc的培养阶段应尽可能保持细胞表型，延缓其分化。
传统的含血清培养方法，通常在合成培养基中添加10%～20%的胎牛血清，而血清中的Ca2+含量足可以加速Kc分化，减少传代次数［1］。
无血清培养方法其营养组分稳定、清晰可控，通过在无钙的K-SFM中根据需要添加不同浓度的CaCl2可以实现调控Kc的增殖与分化。
本研究结果表明，Ca2+浓度可对体外培养的Kc贴壁、增殖、分化等不同阶段产生影响。
当CaCl2浓度低于5mg/L时，细胞贴壁增殖缓慢，甚至无法贴壁。
12.5mg/L CaCl2即可保证细胞的生长增殖，在此浓度下Kc 呈单层生长，能较好地保持表型，是体外Kc培养扩增的最适钙离子浓度。
当Ca2＋的浓度为25mg/L时，Kc形成复层，集落中央出现大量分化程度较高的角化细胞和角化物，但周边仍存在增殖能力较强的单层Kc，逐渐向四周扩展。
同时，随着Ca2＋的浓度增高，细胞角化程度也随之增高，见图1～5。
形成复层的Kc，换成无钙的K-SFM后2天，上层角化细胞脱落，转变为单层生长。
文献报道［8］，完全融合后的正常Kc和转化Kc以K-SFM继续培养，细胞不能持续生长，不能形成复层细胞结构，也无法形成Kc膜片。
通过在K-SFM中添加1.8mmol/L Ca2+可发生进一步的细胞分化、形成复层和完整的Kc膜片。
提示无血清培养液中选择合适的钙离子浓度对体外Kc的扩增和组织工程人工皮肤的构建具有重要意义。