东北红豆杉的愈伤组织诱导

取 东 北红 豆 杉 新 生 茎 和 幼 嫩 叶 片 ， 照 以 下 按
生 物合 成途 径 、 导 、 诱 固定 化 及基 因修饰 等 方 面 的
研究 ， 终 在反 应 器 中进 行放 大 生产 ， 最 以及 过程 工 程 调控 。
程序 ， 诱导 接种 前 进行 表 面 消毒 ： 在 自来 水 反复 冲
些。以茎 和叶为外植体 ， Ｓ为基础培养基 ， Ｍ 采用 １ ０种激素 配 比在 黑 暗条 件下诱 导愈 伤组织 。综合愈 伤 组织诱导率 、 伤组 织 生长 状态 和 愈伤 组织 传 代过 程 中 的褐 化情 况 ， ， 愈 ２ ４一Ｄ １ ０ ｍ ． ｇ・ 和 ６一Ｂ Ｌ Ａ １０ｍ Ｌ ． ｇ・ 为东北红 豆杉茎 愈伤诱导和传代 的最佳激素配 比。低 温预处理外植体有利于减 轻愈伤组 织
Ａｂ ｔａ ｔ Ｔ ｘ ｌ ｏ ｔ ｍｓ ａ ｄ ｌ ａ ｅ ｆ Ｔ ｘ ｓ ｃ ｓ ｉ ａ ａ ｈ ｓ ｂ ｅ ｘ ｒ ｃｅ ｎ ｅｅ ｍｉ ｅ ｓｒ ｃ ： ａ ｏ ｆ ｓｅ ｎ ｅ ｖ ｓ ｏ ａ ｕ ｕ ｐ ｄ ｔ ａ ｅ ｎ ｅ ｔ ｔ ｄ ａ ｄ ｄ ｔｒ ｎ ｄ． ａ ｗｈ ｃ ｈ ｗｓｔ ａ ｏ ｈ ｓ ｍｓａ ｄ ｌ ａ ｅ ｏ ｔ ｉ ｒ ｃ ａ ｏ ，ｗ ｉ ｈ ｏ ｔｎ ｆｓｅ Ｓ ａ ｌ ｔ ｉｈ ｓ ｏ ｈ ｔｂ ｔ ｔ ｎ ｅ ｖ ｓｃ ｎ ａｎ ｔａ ｅ ｔｘ ｌ ｈ ｌ ｔ ｅ ｃ ｎ ｅ ｔｏ ｔｍｓｉ ｉ ｌ ｅ ｅ ｔｅ ｈ ｇ ｅ ｈ ｎ ｔ ａ ｆｌ ａ ｅ ． Ｔ ｋ ｎ ｓ ｍｓ ａ ｄ ｌａ ｅ ｓ ｅ ｐ ａ ｔ ．ａ ｄ ｔ ｋ ｎ ＭＳ ｂ ｓ ｌｍｅ ｉ ｓ ｉｈ ｒｔ ａ ｈ ｔｏ ｖ ｓ ａ ｅ ｔ ｎ ｅ ｖ ｓ ａ ｘ ｌ ｎ ｓ ｎ ａ ｅ ａ ａ ｄ ａ ａ ｅ ｅ ｍｅ ｉ ｅ ｉ ｄ ｆ ｏ ｏ ｅ ｃ ｍｂ ｎ ｔ ｎ ａ ｅ ｂ ｅ ｐ ｌ ｄ ｔ ｎ ｕ ｅ ｃ ｌ ｎ ｄ ｒ ．Ａｃ ｏ ｄ ｎ ｄａ，ｔ ｎ ｋ ｎ ｓ ｏ ｒ ｎ ｏ ｉ ａ ｉ ｓｈ ｖ ｅ ｎ ａ ｐ ｉ ｉ ｄ ｃ ａｌ ｉ ａ ｋ ｈｍ ｏ ｅ ｏ ｉ ｃ ｒ ｉｇ
瓶。
导愈伤组织的能力和诱导的愈伤组织合成次生代 谢产 物 的能 力均 不 同 。选 择 外 植体 时 应考 虑 到 外
洗 茎 和叶 片 ３— ；５％ 乙醇浸 泡茎 和 叶片 ３ ； ４ｈ ７ ０ｓ
取 出茎 和 叶片 ， 无 菌水 浸 泡 ５～６次 ， 去 表 面 用 洗
乙醇 ； ０ １％ 升 汞 浸 泡 茎 和 叶 片 ， 泡 １ ｎ 用 ． 茎 ５ｍｉ，
植 物细 胞培 养生 产次 生 代谢 产 物 是有 效 利 用 植 物资 源生 产药 物 的潜 在技 术 。但 产 率偏 低 一 直 是制 约该 项 技术 实 现产 业化 的瓶 颈 。要有 效 提 高 次 生代 谢物 的产量 ， 要 综合 考 虑 多方 面 的 因素 ， 需
到稳 定 生产 的细胞 系 。然后 从 多个 细 胞 系 中筛 选 生 长和 生产 状 况 最 好 的稳 定 的细 胞 系 ， 之 进 行 对
（ ）＝５ ４ ， 速 ｌ Ｌ ・ｍｎ 检 测 波 长 水 ２： ８ 流 ｍ ｉ～，
２ ７ ｎ 进样 量 １ Ｌ ２ ｍ， ０ 。
１２ ２ 东 北红 豆杉 愈伤 组织 诱导 ．．
～
３０ ０棵 短 叶红 豆杉 的树 皮或 １万 多公 斤 枝 叶 。 ０
紫 杉醇 供 给 问题 引 起 了 医药 界 的广 泛 关 注 ， 源 资
不 足成 为制 约 紫杉 醇临 床应用 的主要 因素 。 目前市 售 的 紫 杉 醇 按 原 料 来 源 不 同 ， 般 分 一 为 两类 ： 类 是直 接从 红 豆 杉植 物 中提 取 ； 一类 一 另
的褐化情况 ， 但却 降低了愈伤组织诱导率 。在愈伤组织及 培养 基中未检测到紫杉醇 。 关键词 ： 东北红 豆杉 ； ＭＳ培养基 ； 愈伤诱 导
中 图 分 类 号 ： ８ ３ １ Ｑ １．１ 文 献 标 志码 ： Ａ
Ｃａ ｌ Ｉ ｄｕ ｔｏ ｆ Ｔ ｘｕ ｓ ｄ ｔ ｌ ｎ ｃ ｉ ｎ ｏ ａ ｓ Ｃｕ ｐｉ ａ ａ ｉ
剪刀将 其 剪成 １ｅ 长 的小 段 （ ） ｌｅ 的 小 ｍ 茎 或 ｍ
果＿ ］ ６ 。首 先就 是外 植 体 的选 择 。不 同外 植 体 诱
块（ 叶片 ） 以备 接种 用 。接种 时 ， ， 将剪 好 的茎 和叶 片贴 服接 种 于 固体 培 养基 表 面 ， 瓶 培 养 基 表 面 每 均匀排 布 ４个 茎段 或 叶 片 ， 个 激 素 浓度 接 种 １ 每 ０
ｂ ｏ ｉ ｇ ｏ ａ ｌ． ｈ ｌ ｅ ｕ ｅ ｈ ａｌ ｉ ｄ ｃｉ ｉ ．Ｔ ｘ ｌ Ｓｎ ｔ ｅ ｅ ｔｄ ｉ ｅ ｃ ｌ ｎ ｄ ａ ｒｗｎ ｎ ｆｃ ｌ ｗ ｉ ｒ ｄ ｃ ｓｔ ｅｃ ｌ ｎ ｕ ｔ ｔ ｉ ｅ ｉ ｖ ｙ ａ ｏ ｏ ｔｃ ｅ ｔ ａｌ ａ ｄ ｍｅ ｉ ． ｉ ｄ ｎ ｈ ｉ
为半合成紫杉醇 ， 即从红豆杉嫩枝条或树叶等可
基金项 目： 连民族学院青年科研基金项 目（０ ９ ２ ２ 。 大 ２ ０ Ａ ０ ） 作者简介 ： 高明波（ ９ ４一） 女 ， １７ ， 山东莱 阳人 ， 讲师 ， 士 ， 博 主要从事植物 细胞工程研究 。
第 ３期
高明波 ， ： 等 东北红豆杉 的愈伤组织诱 导
２７ ５
再生 资 源 中提取 １ ０一去 乙酰 巴卡 亭 Ⅲ ， 用 提 取 或
紫 杉醇 过程 中的副产 物 如 ７一木糖 紫 杉醇 、０一去 ｌ
取 东 北红 豆杉 茎 干粉 ２ｇ 叶干粉 ５ｇ 置于 ５ ， ， ０
ｍ Ｌ离心 管 中 ， 入 ８倍 体 积分 析 纯 甲醇 （ 体 积 加 含 比为 ０ ０ ． １％ 冰 醋 酸 ） 超 声 提 取 ２次 ， 次 ３ ， 每 ０ ｍｎ ｉ。提取 液 于 ４０ ０ｒ・ ｉ 下 离 心 ｌ ｉ， ０ ｍｎ ０ｒ ｎ 合 ａ 并上 清 ，５ 旋 转 蒸 发 ， 容 至 ２ Ｌ色 谱 纯 甲 ２％ 定 ５ｍ 醇 ，．２ ｍ 膜过 滤备 做 Ｈ Ｌ 。 ０２ Ｐ Ｃ
ｔ ｈ ａｌ ｎ ｕ ｔｖｔ ｏ ｔ ｅ ｃ ｌｉｉ ｄ ｃ ｉｉｙ，ｃ ｌｉｖ ｇ ｔｔｖ ｔｔ ａ ｌ ｅ ｅ ａｉｅ ｓａｅ，ａ ｒ ｗｎｉｇ ｄ ｇ ｅ ｕ ｉ ｇ ｔ ｅ ｃ ｌｉｓ ｃ ｌｕ ｅ， ｎｄ ｂ ｏ ｎ ｅ ｒ ｅ ｄ ｒｎ ｈ ａ ｌ ｕｂ ｕ ｔ ｒ ２．４ 一Ｄ ． １ ０ ｍｇ ・Ｌ。 ａ ｄ ６一ＢＡ ． ｍｇ ・Ｌ。 ａ ｅ ｔｅ ｂ ｓ ｏ ｍｏ ｅ ｃ ｍｂ ｎ ｔ ｎ ｔ ｎ ｕ ｅ ａ ｄ 。ｎ １ ０ 。 ｌ ｈ ｅ ｔｈ ｒ ｎ ｏ ｉ ａｉ ｏ ｉ ｄ ｃ ｎ ｏ ｓ ｂ ｕ ｔ ｒ ｃ ｌｉ ｒ ｍ ｔｍｓ ｆ Ｔ．ｃ ｓ ｄ ｔ ｕ ｃ ｌｕ ｅ ａｌ ｏ ｓｅ ｏ ｆ ｕｐｉａ ａ．Ｌ ｗ ｔｍｐ ｒ ｔ ｒ ｐ ｅｒ ａｍｅ ｔ ｓ ｏ ｄ ｏ ｌｅ ｉｔ ｏ ｅ ｅ ａｕ ｅ ｒ ｔｅ ｔ ｎ ｉ ｇ ｏ ｔ ａｌ ｖａｅ
生产细 胞培 养技 术 生 产 紫杉 醇 具有 很 大 潜力 。植 物 细胞 培养 生产 次 生 代谢 产 物 的基 本 方 法 如 图 １ 。首 先筛 选 含 有 目标 次生 代 谢 物 的植 ｊ 物及 最好 的基 因型 ， 择 合适 的 部 位 作 外 植 体 进 选 行 愈伤 组织 诱导 。在 愈 伤诱 导 过 程 中筛 选合 适 的 生 长培 养 基 ， 进行 传 代 培 养 ， 经 过 多代 培养 ， 再 得
有 时需 将 多 种 方 案 综 合 使 用 才 能 达 到 理 想 的 效
叶片 泡 １ ｉ； 无 菌 水 将 茎 和 叶 片 反 复 浸 泡 洗 ０ｍｎ 用 涤 ８次 ， 净 表 面消 毒液 ； 出进 行 过表 面 消毒 并 洗 取 洗涤 过 的茎 和 叶 片 于灭 菌后 的培 养 皿 中 ， 无 菌 用
Ｋｅ ｙ ｗｏｒ ｄｓ： ａ ｕ ｕｐｉ ａ ａ； ｄ ａ；ｃ ｌ ｎ ｕ ｔ ｎ Ｔ ｘ ｓ ｃ ｓ ｄ ｔ ＭＳ ｍｅ ｉ ａｌ ｉ ｄ ｃ ｉ ｉ ｏ
植 物是 天 然 化 合 物 的宝 库 ， 有 大 量 有 用 的 含 次 生代 谢 物质 ， 人 类 药 物 和 工 业 原 料 的 重 要 来 是 源 。已经 有超 过 １ ０万种 化 合 物 从 植 物 中 分 离 鉴 定， 并且 以 每 年 大 约 ４ 千 种 新 化 合 物 的 速 度 增 加 … 。美 国医药 市场 的药 物有 ２ ５％ 来 自植物 Ｊ 。 红 豆杉 的提 取 物 紫 杉 醇 （ ａｌａｅ，Ｔ Ｉ ｐｃｉｘｌ 蹦０ ｔ ＠） 具 有独 特 的抗 癌 机理 ， 继 阿霉 素 、 铂 以后 国际 是 顺 市 场最 畅 销 的新 型 抗 癌 药 物 ， 多 种 癌 症 具 有 良 对 好 疗效 且 副作用 较 小 。紫杉 醇 最初 从 短 叶红 豆 杉
ＨＬ Ｐ Ｃ条件 ： ｇ ｅ ｔ ０， ｙ ｅｓ Ｄ ｌ Ａ ｉ ｎ ｌ０ Ｈ ｐｒｉＯ Ｓ Ｃｓ ｌ １ ｌ 柱 （ ． ４ ６ｍｍ× ５ ｍ ， ｍ） 流 动相 ： 乙腈 ） Ｖ ２ ０ｍ ５ ； （ ：
乙酰紫 杉醇 、 三尖 杉 宁碱 等 为 原 料 经 化 学 半 合 成
第 １ ３卷 第 ３期 ２ １ 年 ５月 ０１
大 连 民 族 学 院 学 报
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｌ ｎ Ｎａｉｎ ｌ ｉｓＵｎｖ ｒｉ ｏ ｒ ａ ｆＤａｉ ｔ ａｉ ｅ ｉｅｓｔ ａ ｏ ｔ ｙ
Ｖｏ ． ３． ． １ １ Ｎｏ ３
Ｍ ａ ０１ ｖ２ １
文章 编号 ：０ ９— １ Ｘ（０ １ ０ ０ ５ ０ １０ ３ ５ ２ １ ）３— ２ ６— ４
ＧＡＯ Ｍｉｇ— ｏ ， ＩＸ ｎ ｔｉ， Ｕ ｈ ｎ ｊ ｎ 。 ｎ ｂ 。 Ｌ ｉｇ— ａ。 Ｒ ＡＮ Ｃ ｅ ｇ— ｉ ｇ ， ａ
（ ． ｏ ｅｅｏ ｉ ｃｅｃ ； ． ｅ ａｏａ ｒ ｆ ｉｃｅ ｉ ｌ ｎｉ ｅ ｎ Ｓ Ａ ａ Ｃ ｌｇ ｆ ｆ Ｓｉ ｅ ｂ Ｋ ｙＬ ｂｒｔ ｙｏ ｏｈｍ ｃ ｇ ｅｒ ｇ（ Ｅ Ｃ—ＭＥ ， ｌ Ｌｅ ｎ ｏ Ｂ ａＥ ｎ ｉ ） Ｄ ｉ ａｏ ａｔ ｓＵ ｉ ｒｉ ， ａ ａ ｉ ｎｎ １６ ５ ｈｎ ） ｌ ｎ ｉｌｉ ａａ Ｎ ｔ ｎ ｉｅ ｎ ｅｓｙ Ｄ ｌｎＬａ ｉｇ１６ ０ ，Ｃ ｉａ ｖ ｔ ｉ ｏ