第六章植物愈伤组织培养
【初中生物】初中一年级生物上册知识点：植物组织培养中的愈伤组织
【初中生物】初中一年级生物上册知识点：植物组织培养中的愈伤组织【—初中一年级生物上册：植物组织培养中的愈伤组织】植物组织培养中使用的外植体一般是高度分化了的细胞，在植物体中是不会再分裂繁殖的，只是执行某种功能直至死亡。
植物组织培养中的愈伤组织植物组织培养中的愈伤非政府就是如何构成及再分化的？植物组织培养中使用的外植体一般是高度分化了的细胞，在植物体中是不会再分裂繁殖的，只是执行某种功能直至死亡。
这些细胞在培养基上培养时会由原来的分化状态，变成分生状态的细胞，分裂产生愈伤组织，这个过程称为脱分化（dedifferentiation）过程。
这种转变在细胞的形态结构和生理生化上都会产生一系列变化。
组织培养的研究结果表明分化细胞的脱分化需要两个条件，即创伤和外源激素。
目前人们对于退分化过程的本质还不确切。
分化细胞在细胞周期中就是处在一种相对静止状态的细胞（g0期细胞），退分化就是必须超越这种状态，并使细胞步入细胞周期中的g1期，并沿着g1期→s期→g2期→m期的循环展开细胞分裂，构成愈受伤非政府。
现在辨认出细胞周期受到基因调控，一种称作编码细胞周期依赖性激酶cdk （cycilindependentkinase）的基因和一种细胞周期蛋白（cyclin）可能将与植物细胞退分化的第一次对立启动有关。
那么，什么因素诱导细胞周期调控基因的促进作用，培育实践证明与外源激素有关。
至于激素如何诱导以及诱导促进作用的过程目前仍不确切，尚待深入研究。
分化细胞退分化后细胞结构存有两点显著的变化：一就是在细胞内发生液泡蛋白；二就是叶绿体转变成原质体。
当细胞脱分化形成愈伤细胞后，经过一段时期的分裂，细胞群体变成不是一种细胞类型的均一群，又会产生分化，形成分生细胞或分生细胞团，由此再生成植株有两条途径：一是形成体细胞胚（功能类似于受精过程产生的胚），通过体细胞胚形成再生植株。
二是走器官发生的途径再生植株，分生细胞在一定的诱导条件下重建芽的分生组织，分化出芽后再生根，成为完整的植株。
植物愈伤组织培养的影响因子
对愈伤的特点以及影响植物愈伤组织形成的条件 内源＿ 激素和外源激素、 光照条件、 温度条件、 培养基的成分等进行简要的概述。
【 关键 词】 愈 伤组 织 ； 组织特 点 ； 影响条件
愈伤组织是指外植体在离体培养条件 下形成 的一团无极性 、 能旺 盛分裂的薄壁细胞 团． 在培养 过程中经过诱导分化 可以发育成完整的 再生植 株 愈伤组织培养 已成为一种最常用的植物组织 培养形式， 其 不仅是一种植物快繁的新手段 同 时也是植 物改 良种 质保存和有用化 合物生产的理 想途径。 在生产 实践 中得到广 泛应用 因此 。 不断深入研 究影响植物愈伤组织形成 和诱 导的因素。 不仅可 以促进植 物组织培养 技术进一步发展和完善。 而且 可以为实践应用提供 理论基础 胞 的增殖和根 的分化 ， 若Ｂ Ａ （ 或Ｋ Ｔ ） 的相对浓度较高， 则促进芽 的分 化， 如果 比例适 中时． 则仍产 生无分化 的愈伤组织『 Ｊ ｊ ｝ ｏ ２ ． ２ 基 因对植物愈伤组织 的影响 植 物愈 伤组织器官 的发生主要是相 应基因表达 和相应蛋 白的合 成过程 植物愈伤组织在植物激素和其他生长条件的影响下 ， 可通过 各种信号传递 系统调节器官发生有关的基因的活性 、 启动器官发生有 关基 因的表达 、 产生相应 的蛋 白． 进而在促 进愈伤组织 的形成 中发挥 重要 的作用㈣ 愈伤组织 中表达蛋 白的多少可反映其组织 化和分化 的 程度 ， 表 达的蛋 白少 ， 表 明该愈伤组织 的分化 或组 织化程 度低， 具有 较强 的分生能力 或器官发生能 力Ｉ ． 例如． 在大麦愈 伤组织 形成时被 检测 出约 ３ ０个特异性表达 的蛋 白Ｉ ） ２ － ３ 培养基对植物愈伤组织的影响 植物愈伤组织 的形成主要的介质为培养基 ． 也是愈伤组织成功 的 必要条件 ． 目 前植 物愈伤组织 的培养基 主要 分为 Ｍ Ｓ 、 Ｈ、 Ｂ ５ 、 Ｎ ６ 、 Ｗｈ ｉ ｔ ｅ 等５ 类培养基， 每种 培养 基的营养成分 、 盐 浓度不 同。 不 同的植物 愈伤 组织培养基 也有所 不同 研究发现 ， 豆科类 愈伤组织一般使用 Ｍ Ｓ 培 养基生 长较好『 １ ４ １ ． 而在 Ｎ ６ 培养基 中的生长受到 明显的抑 制。ｐ Ｈ值 与 多种培养基 的凝 固相关联 ， ｐ Ｈ直接反应了培养基的酸碱度 ． 同时也直 接或 间接 的影 响植物愈伤组织对 营养元 素的吸收所 以要精确控制植 物愈伤组织培养基 的 ｐ Ｈ值。培养基 的 ｐ Ｈ值根据不 同的培养材料有 所不 同， 一方 面， 适 当降低培养基 ｐ Ｈ值 可以降低多酚氧化酶 的活性 和 底物利用率 ， ｐ Ｈ越接近 ６ ． ０越有利 于愈伤 组织的形成 。另一方面 ， 有 些植物材料愈伤组织培养基要求 的 ｐ Ｈ与正常相 比较高一些， 基本呈 现出中性 的状态旧。 除了 ｐ Ｈ值的影响外 ， 碳源也是影响植 物愈伤组织 形成 的重要 因素之一 植物愈伤组织的培养基不能缺少碳源 ， 碳源能 够给外植体提供能量 。 而且具有 调节 渗透平衡的作用．绝大多数 的培 养基都 用蔗糖作为主要 的碳源 能 够保 证绝大多数植物离体培养物 的 正 常生长， 蔗糖一直被 作为植物组织 培养标准 的碳 源得到广 泛应用 ． 许多研究表 明， 另 外与 ｐ Ｈ值 的影 响类似 ，不同植物对不 同糖类 的反 应也是不完全相 同ｌ Ｉ ６ １ ２ ． ４ 光照对植物愈伤组织 的影响 光 照条件 时影响植物愈伤组织形成 的一个重要的影响因子。 光 照 和黑 暗培养 条件对植物愈伤组织 的影响表现 的截然 不同， 研究发现 ， 光照条件下。 长春花组织 培养 细胞生长速度较快， 导致这种现象 的原 因主要 在于光照在诱导分化 时可激活某 些酶的活性 和光诱 导的叶绿 体或 叶绿体代谢产物 同样也有研究报道显示黑暗对愈伤组织 的生 长 是有利 的 多数植物细胞在光照和黑暗培养条件下合成的次生代谢 物 的含量有较大 的差别 ． 影响着植物愈伤组织培养时次生代谢产物 的积 累。 ２ ． ５ 温度对植物愈伤组织 的影响 植物愈伤组织诱导和次生代谢物形成很大程度上受温度的影响 ， 植物愈伤组织 的培养适宜生长 的温度范 围一般为 １ ５～３ ２ ℃： 不 同植物 的愈 伤组织 的最适 温度有所不 同， 例如 ． 拟南芥最适 培养温 度一般 为 ２ ３ ℃． 而矮牵牛最适培养温度一般为 ２ ５ ℃ 但是次生代谢物形成 的最 适温度往往与形成愈伤组织 的最适温度不 同旧 上述 的讨 论表明， 内源激素和外源激素 、 光照条件 、 温度条件 、 培 养基 的成分是影响植 物愈 伤组织诱导和分化 的几 种重 要的因素。 尽 管其作 用特 点已知， 但 由于植物物种 的差异 ， 植物 内源激素和外源激 素以及 培养基种类 的选择 和使用量 ． 光 照条件和温度条件 的选择成 为 探讨高效率进行植物 愈伤组织诱导 和分化 的关键所在 。 植物内源激素 对植 物的生长 和代谢有 重要作 用 ， 但在植 物体 内的 （ 下转
植物生物工程学实验一(植物愈伤组织培养)
缺氮时某些植物的愈伤组织会出现一种很引人注目的 花色素苷的颜色，愈伤组织内部不能形成导管。
培养基的成分—— 大量元素
(2)
P
是磷脂的主要成分。而磷脂又是原生质、细胞核的重要
组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。 在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加 养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植 物体中的积累。 常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。 缺磷或钾时细胞会过度生长，愈伤组织表现出极其蓬松 状态。
(4) Mg、S和Ca
Mg 是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是含S 氨基酸和蛋白质的组成成分。 常以MgSO4·7H2O提供。 用量为1-3mg／L较为适宜； Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜 不受破坏有显著作用， 常以CaCl2·2H2O提供。 缺硫时培养的植物组织会明显的退绿；
培养基的成分—— 大量元素
(3) K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有 密切关系。 K 增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维 组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易 过大，一般为1-3mg／L为好。 制备培养基时，常以KCl、KNO3等盐类形式提 供。
培养基的成分—— 大量元素
培养基的成分——微量元素
z B ， Mn ， Zn ， Cu ， Mo ， Co 等，也是植物组织培养中不可 缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，发育异常现象。 z Mn 对糖酵解中的某些酶有活化作用，是三羧酸循环中某些 酶和硝酸还原酶的活化剂。 zB 能促进糖的过膜运输，影响植物的有性生殖如花器官的
培养基的成分
z 元素名称 z N z 大量 P z 元素 K (≥0.5mmol/L) Ca z Mg z S z Fe z 微量 B z 元素 Mn (≤ 0.5mmol/L) Cu z Mo z Cl 添加形式 KNO3, NH4NO3 KH2PO4 NaH2PO4 KCl KNO3 CaCl2 ·2H2O Mg2SO4 · 7H2O Mg2SO4 · 7H2O FeNa2-EDTA H3BO3 MnSO4 CuSO4 Na2MoO4 · 2H2O CaCl2 ·2H2O
植物愈伤组织培养
第六章植物愈伤组织培养本章主要内容•植物愈伤组织及形成过程•植物愈伤组织与遗传变异•植物愈伤组织培养条件与定向变异第一节植物愈伤组织及形成过程•植物愈伤组织的概念•植物愈伤组织的形态结构•植物愈伤组织的形成过程•植物愈伤组织的继代培养一、植物愈伤组织的概念愈伤组织(callus)，原是指植物在伤口表面形成的一团薄壁细胞。
在组织培养中，愈伤组织指在人工培养基上由外植体组织的增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄璧细胞。
通过愈伤组织培养再分化产生再生植株是植物组织培养的主要形式之一。
几乎所有高等植物的各种器官，如根、茎、叶和花等，以及各种组织，如皮层、茎髓和形成层等，离体后在适当条件下都能产生愈伤组织。
愈伤组织愈伤组织诱导不定芽不定芽的生根培养二、植物愈伤组织的形态结构愈伤组织是许多异质细胞集合而成的一个无一定形态结构的细胞聚集体。
根据其性质和细胞组成的特点，可以分为致密和松脆两种结构类型。
松脆愈伤组织都有大量的分生组织中心，进行活跃的细胞分裂，愈伤组织内有大量的细胞间隙，细胞排列完全无序。
坚实致密愈伤组织内无大的细胞间隙，而由管状细胞组成维管组织。
植物愈伤组织的形态结构优良的愈伤组织通常必须具备以下特性:⑴高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植株。
⑵容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性原生质体。
⑶旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。
⑷经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操作。
三、植物愈伤组织的形成过程从单细胞或一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历4个时期:诱导期分裂期形成期分化期1、诱导期(起动期)•诱导期(induction stage)是细胞准备进行分裂的时期,通过一些刺激因素和激素的诱导作用，使处在静止状态的细胞合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸物质的合成。
此期间细胞的大小变化不大。
植物愈伤组织诱导培养实验指导--李老师
植物组织培养基的配制与植物愈伤组织诱导一、实验目的；通过植物组织培养基和植物愈伤组织诱导实验的学习和训练，使学生了解植物组织培养的基本原理和操作技术，初步掌握MS固体培养基制备方法、外植体的常规灭菌技术以及愈伤组织诱导方法。
二、实验原理：根据植物细胞全能性原理，培养植物材料。
即在无菌条件下，将植物的器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）放在人工培养基上进行培养，通过细胞分裂，形成一团薄壁细胞，即愈伤组织。
愈伤组织可以在适宜的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下进行再分化，重新产生出植物的各种器官和组织，进而发育成完整的植株。
三、实验内容实验包括以下3部分内容：实验1-1、植物组织培养基母液的配制和保存实验1-2、MS培养基的配制与灭菌实验1-3、胡萝卜愈伤组织的诱导实验1-1 植物组织培养基母液的配制和保存1、目的要求学习植物组织培养基母液的配制方法，为培养基的配制做准备。
2、基本原理植物培养基是植物离体培养的组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节等物质。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将培养基成分首先配制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度，按比例稀释。
本实验以MS培养基为例，学习培养基母液的配制。
MS培养基母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。
另外，还要配制生长激素母液，在不同类型的培养基中使用。
3、实验仪器设备和试剂3.1仪器、用具分析天平、酸度计（或pH试纸）、冰箱、药匙、玻棒、称量纸、滴管、洗瓶、记号笔、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、500ml、1000ml）、磨口试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量筒、移液抢、微波炉等。
3.2试剂（1）95%乙醇、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。
植物组织培养中的愈伤组织与再生植株
植物组织培养中的愈伤组织与再生植株植物组织培养是一种重要的生物技术手段，通过这种方法可以实现对植物组织和细胞的离体培养，进而实现愈伤组织的形成和再生植株的繁殖。
本文将探讨植物组织培养中的愈伤组织与再生植株的形成机理及应用价值。
一、愈伤组织的形成机理愈伤组织是指在植物组织培养中由受伤组织或原始组织经过愈伤反应形成的可再生新生组织。
愈伤组织的形成机理主要包括以下几个方面。
1. 组织分化和再分化：在组织培养的过程中，受创组织或原始组织中的未分化细胞会经历分化和再分化的过程，从而形成愈伤组织。
2. 激素调控：激素在愈伤组织形成中起着至关重要的作用。
生长激素如细胞分裂素和生长素可以促进愈伤组织的增殖，而植物激素如乙烯和脱落酸则能够促使细胞分化。
3. 渗透调节：适当的渗透调节对愈伤组织的形成也有一定的影响。
渗透调节可以改变细胞的渗透压，调节细胞内外的水分平衡，进而刺激愈伤组织的形成。
二、再生植株的培养与应用在植物组织培养中，愈伤组织的培养和再生植株的繁殖是一个密不可分的过程。
通过适当的培养条件和激素调控，可以促进愈伤组织的增殖和分化，最终实现再生植株的形成。
再生植株的培养与应用有以下几个方面的意义和价值。
1. 育种：通过植物组织培养中的再生技术，可以实现对植物的快速繁殖和筛选，从而提高植物的育种效率。
它在育种领域具有广泛的应用前景，可以用于无性繁殖的经济作物的高效育种。
2. 遗传改良：植物组织培养技术可以通过对植物基因的改造和修饰，实现对植物遗传性状的调控和改良。
这对于传统育种方法无法改变的一些特征具有重要意义。
3. 保存濒危植物：通过植物组织培养的再生技术，可以对濒危植物进行有效的保存和再生繁殖，从而保护和恢复濒危植物种群的数量和多样性。
4. 生物制剂生产：植物组织培养中的再生技术还可以应用于生物制剂的生产，如植物激素、抗生素和药物等的合成，对于药物和化妆品等产业具有重要的经济意义。
总结：植物组织培养中的愈伤组织与再生植株是一项重要的生物技术手段。
《植物组织培养》课程考核大纲
………… 三、判断题（每小题 1 分，共 5 分） 1. 一个已分化的细胞若要表现其全能性，首先要经历脱分化过程。（） 2. White 培养基无机盐浓度低，适合生根培养。（）
课程考核包括形成性考核和终结性考核两部分。形成性考核占总成绩的 40%，包括学生 出勤情况（10%）、课堂学习态度及回答问题情况（10%）、作业、测验（20%）。终结性考 核成绩占总成绩的 60%，考核采用笔试形式，考查学生基本理论和基本知识的掌握情况及综 合应用能力。 【期末考试形式】
开卷笔试。 【期末考试对试题的要求】
391
1．了解：影响因素 2．理解：花粉培养 3．掌握：花药培养 4．运用：小孢子 第十一章 植物离体低温保存 知识点： 1．超低温保存 2．低温保存 3．常温保存 4. 原理和方法 考核目标： 1．了解：常温保存 2．理解：原理和方法 3．掌握：超低温保存 4．运用：低温保存 第十二章 植物组织培养商品化生产及管理 知识点： 1．基本要求 2．基建规划 3．成本组成 4. 成本核算 考核目标： 1．了解：基本要求 2．理解：成本组成 3．掌握：基建规划 4．运用：成本核算 【样题】 一、名词解释（每小题 2 分，共 20 分） 1．组织培养 2. 细胞的全能型
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考核目标： 1．了解：实验室基本组成 2．理解：（1）仪器设备（2）器械用具 3．掌握：（1）环境条件（2） 4．运用：（1）无菌操作注意事项（2）玻璃器皿的清洗 第三章 培养基及其制备 知识点： 1．植物必需的营养元素 2．培养基营养成分 3．常用植物生长调节剂 4．母液的配制 5. 母液的保存 6. 培养基的配制 7. 培养基的灭菌 8. 培养基保存 考核目标： 1.了解：（1）母液的保存（2）培养基保存 2．理解：（1）培养基营养成分（2）常用植物生长调节剂 3．掌握：植物必需的营养元素 4．运用：（1）母液的配制（2）培养基的配制（3）培养基的灭菌 第四章 植物材料 知识点： 1．外植体种类 2．外植体的大小 3．取外植体的时间 4. 外植体表面灭菌 考核目标： 1．了解：外植体种类 2．理解：外植体的大小 3．掌握：取外植体的时间 4．运用：外植体表面灭菌 第五章 植物离体快速繁殖 知识点： 1．植物离体快速繁殖 2. 基本程序 3．影响因素 4. 褐变 5. 玻璃化 考核目标： 1．了解：影响因素 2．理解：植物离体快速繁殖 3. 掌握：（1）褐变（2）玻璃化 4．运用：基本程序 第六章 植物愈伤组织培养 知识点： 1．植物愈伤组织 2．继代培养 3．形态结构 4. 培养条件 5. 培养过程 考核目标：
植物愈伤组织培养
酶活力 增加
细胞的 大小变 化不大
第一节 植物愈伤组织及形成过程
二 植物愈伤组织的形成过程：
诱导期长短
植物种类
外植体生理状 况
ห้องสมุดไป่ตู้
外部因素
第一节 植物愈伤组织及形成过程
二 植物愈伤组织的形成过程：
分裂期：细胞通过一分为二的分裂，不断
增生子细胞
细胞分裂 快
结构疏松
缺少有组 织的结构
颜色浅而 透明
第一节 植物愈伤组织及形成过程
生细胞
愈伤组织
第一节 植物愈伤组织及形成过程
一 植物愈伤组织的形态结构：
由许多异质细胞集合而成的一个无一定形态结构的细胞聚集体。
松脆
有大量的分 生组织中心
内有大量的 细胞间隙
细胞排列无 次序
致密
无大的细胞 间隙
管状细胞组 成维管组织
第一节 植物愈伤组织及形成过程
一 植物愈伤组织的形态结构：
生 液泡细胞所占比例较高
第三节 植物愈伤组织培养条件与定向诱导
一 植物愈伤组织培养条件：
外植体
• 材料的基因型 • 同一种植物的不同器官和组织 • 幼龄外植体
培养基
• 生长调节剂 • 无机营养元素 • 有机成分 • 物理性质
环境条件
• 光照 • 温度
第三节 植物愈伤组织培养条件与定向诱导
二 不同用途愈伤组织的定向诱导：
三 愈伤组织的形态发生方式：
器官
脱
再
发生
分 离体器官、 化
分 化
发 育
型
组织或细
愈伤组织
根、芽等
植株
胞
胚状体
植株
无激素 培养基
植物愈伤组织培养
03
植物愈伤组织培养的成功应用案例包括生产次生代谢产物、新品种的快速繁殖 、基因工程研究和重造植物等。
展望植物愈伤组织培养的发展趋势和应用前景
植物愈伤组织培养的发展趋势包括深 入研究其生理生化机制、优化培养条 件和寻找更高效的诱导和增殖方法。
随着生物技术的不断发展，植物愈伤 组织培养将与基因工程、细胞工程和 代谢工程等技术结合，实现更高效的 植物繁殖和次生代谢产物的生产。
基本培养基
指具有共性特点的基础培养基，如MS、1/2MS等。
特殊培养基
指在基本培养基上添加特殊成分或调整某些成分而形成的新型培养基，如B5、N6等。
优化培养基
指根据不同植物或不同生理阶段的特点，对外植体、激素、盐分等成分进行调整而形成的 培养基，如分化培养基、生根培养基等。
03
愈伤组织培养的产业化应用
植物激素与信号转导途径的研究
研究植物激素在愈伤组织形成和分化过程中的作用及其信号转导途径，解析激素调控网络 。
比较基因组学和功能基因组学研究
通过比较不同植物愈伤组织形成的基因表达模式，挖掘关键基因和调控网络，为改良植物 品种提供理论依据。
创新愈伤组织培养技术及其在植物生产中的运用
01
创新愈伤组织培养技术
05
结论与展望
总结植物愈伤组织培养的研究成果
01
植物愈伤组织培养是一种有效的植物繁殖方式，能够快速繁殖和保存植物种质 资源，同时还可以生产次生代谢产物和进行基因工程研究。
02
植物愈伤组织培养的研究已经取得了许多成果，包括建立高效的愈伤组织诱导 和增殖培养基、探索不同因素对愈伤组织诱导和增殖的影响、研究愈伤组织分 化成根和芽的规律和机制等。
植物愈伤组织培养在农业、林业、园 艺和中药等领域具有广泛的应用前景 ，未来将会有更多的应用案例和研究 成果出现。
愈伤组织培养步骤
愈伤组织培养步骤
愈伤组织培养是生物科学研究中的重要技术，它能够让细胞在体外环境下生长和分化。
以下是愈伤组织培养的详细步骤：
1、准备培养基：愈伤组织培养需要特殊的培养基，其中包含细胞生长所需的各种营养成分。
按照培养基的说明书进行配制，确保准确无误。
2、灭菌：在培养之前，所有的培养器具和培养基都需要经过高温高压灭菌，以确保无菌环境。
这是细胞生长的关键，因为任何污染都可能导致实验失败。
3、细胞分离：从植物中分离出细胞是培养愈伤组织的第一步。
通常采用酶解法，即用纤维素酶和果胶酶分解细胞壁，使细胞分离成单个。
这一步要特别小心，因为酶的作用会影响后续的细胞生长。
4、接种：将分离出的单个细胞接种到培养基上。
这一步骤需要使用显微操作技术，确保每个细胞都准确地放置在培养基上。
5、培养：将接种了细胞的的培养基放入恒温箱中，设定适宜的温度和湿度。
在培养期间，要定期检查细胞的生长情况，确保没有污染。
6、观察与记录：每天使用显微镜观察细胞的生长情况，记录生长速度、形态变化等数据。
这些数据对于后续的研究非常重要。
7、换液与传代：随着细胞的生长，营养物质会被消耗。
因此，需要定期更换新鲜的培养基，以保证细胞的正常生长。
当细胞数量足够多时，可以进行传代，即将一部分细胞重新接种到新的培养基上。
8、实验结束后的处理：实验结束后，对使用过的器具和培养基进行消毒处理，避免对环境造成污染。
以上是愈伤组织培养的基本步骤，但实际操作中可能还需要根据具体的实验需求进行调整。
在进行实验时，一定要注意遵守实验室规则，保证实验安全。
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植物愈伤组织的形态结构
优良的愈伤组织通常必须具备以下特性:
⑴ 高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织
得到再生植株。
⑵ 容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮 系，并且在需要时能从中分离出全能性原生质体。
⑶ 旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立
大规模的愈伤组织无性系。 ⑷ 经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对 它们进行各种遗传操作。
三、植物愈伤组织的形成过程
从单细胞或一块外植体形成典型的愈伤组织，大 致要经历4个时期:
诱导期 分裂期 形成期 分化期
1、诱导期 (起动期)
•
诱导期 (induction stage)是细胞准备进行分裂的 时期,通过一些刺激因素和激素的诱导作用，使处 在静止状态的细胞合成代谢活动加强，迅速进行 蛋白质和核酸物质的合成。此期间细胞的大小变 化不大。
愈 伤 组 织
愈伤组织诱导不定芽
不定芽的生根培养
二、植物愈伤组织的形态结构
愈伤组织是许多异质细胞集合而成的一个无一定形 态结构的细胞聚集体。根据其性质和细胞组成的特 点，可以分为致密和松脆两种结构类型。 松脆愈伤组织都有大量的分生组织中心，进行活跃 的细胞分裂，愈伤组织内有大量的细胞间隙，细胞排 列完全无序。 坚实致密愈伤组织内无大的细胞间隙，而由管状细 胞组成维管组织。
无机营养元素
在植物组织培养中与整体植物一样，细胞的生长 也要求满足植物生长的必需元素，若完全缺乏或过 多或不足，也会影响细胞生长和分化。不过其影响 不如激素明显。 各种类型的植物、器官所需要的每种元素的量， 特别是大量元素是有区别的。如生根培养要求无机 离子浓度小一些，所以常用1/2MS或White培养基。 如有些植物要求的氮，以硝酸态形式供应为佳，而 有些植物要求的氮，以铵态氮的形式供应为佳。
பைடு நூலகம்机成分
在培养基中加了糖、硫胺素、烟酸、吡哆素、肌醇和 甘氨酸等，可以满足愈伤组织的生长和分化的要求。糖 不仅可作为碳源，而且也是培养基渗透调节剂。各种氨 基酸和生物活性物质，可以促进愈伤组织生长和向器官 分化。在组织培养过程中加一些植物器官的汁液，也常 常产生良好的效应。
物理性质
培养基的物理性质 (固体状态或液体状态，渗透压和pH 值)对形态发生有明显的影响。 在胡萝卜和石刁柏的培养过程中，需要改变培养基的形 式，才能顺利地分化出苗。其方法是：
三、愈伤组织染色体变异与形态发生的关系
有些愈伤组织起初具有形态发生能力，但经过反复 继代培养之后，这种形态发生能力常常逐渐下降，有 时甚至完全丧失。此外，在由老龄培养物分化出来的 器官中，有很大一部分可能是形态异常的。 造成这些问题的原因有生理的和遗传的两个方面。 生理方面的原因主要是继代世代数多引起生理衰退。 遗传方面的原因主要是多倍性、非整倍性和染色体结 构变异。
第一阶段诱导形成愈伤组织，应在固体琼脂培养基上进行培养； 第二阶段细胞和胚状体的增殖，需在液体培养基中完成； 第三阶段由胚状体发育成可移植的植株，又应转移到固体琼脂培 养基上进行培养。
培养基的渗透压对细胞增殖和胚状体的形成有明显的影响。
2、培养基
培养基的各种成分及物理性质，都对愈伤 组织的培养和器官发生产生一定影响，但起决 定作用的仍然是植物生长调节剂，特别是生长 素和细胞分裂素的配比。
生长调节剂
细胞分裂素和生长素的比例是控制芽和根形成 的重要条件之一。细胞分裂素和生长素的比例高 时，有利于芽的形成；而比例低时，有利于根的 诱导。这样通过变换激素的种类、浓度和配比， 即可有效地调节培养组织的器官分化。 不同种类的生长素和细胞分裂素，对生根和长 芽的效果是不同的。
诱导期的长短和诱导分裂的难易程度，因植物 种类、外植体的生理状况和外部因素而异。 外源生长调节物质对诱导细胞开始分裂效果最 好，最常用的有2,4-D、NAA、IAA和细胞分裂素 等。
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2、分裂期
分裂期 (division stage) 是不断增生子细胞的过程。 其特征是:细 胞 分 裂 快 ， 结 构 疏 松 ， 缺 少 有 组 织 的 结 构，颜色浅而透明。主要表现如下:
• 在愈伤组织培养中，经常发现细胞的生理 行为和形态发生行为有自发变异的现象。 原因可能是核的异常，也可能是其他原因。 • 很多物种在活体中的组织分化并不导致细 胞多倍性，但离体条件下却容易发生多倍 化现象。
组织培养物在细胞学上的异质性可能由2个因子引起：
① 原来存在于外植体中染色体倍数性和遗传组成 不同的细胞，经诱导后都能发生分裂； ② 培养条件可能引起新的不规则性。 而且这2个因子常常同时发挥作用。
① 细胞的数目迅速增加。 ② 每个细胞平均鲜重下降。
③ 细胞体积小，细胞内无液泡
④ 细胞核和核仁增至最大
⑤ 细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。
⑥ 组织的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成 极快。
3、形成期
形成期 (formation stage)是指外植体的细胞经过诱导、 分裂形成了无序结构的愈伤组织的时期。 这一时期愈伤组织内细胞有以下特点是: ① 大而不规则、高度液泡化，整个组织是比较松散的。 ② 表面以下约5～10个细胞是细胞生长的中心这些中 心是愈伤组织的主要生长部位。
因此初生愈伤组织可能是一个异质细胞群，它既反
映了原外植体中的染色体状况，又是愈伤组织诱导期 间核变异的结果。
1、初生愈伤组织
当把外植体接种到人工培养基上以后，细胞核内可 能出现3种不同的过程： ①正常有丝分裂； ②先进行核内复制，然后进行有丝分裂； ③先发生核碎裂（无丝分裂），然后进行有丝分裂。 在愈伤组织和悬浮细胞生长期间，染色体数目还可能 发生进一步变异。一般来说，在愈伤组织和悬浮培养 物中核的状态可以有以下几种类型:二 倍 体 、 多 倍 体 、 单倍体、非整倍体和染色体结构变异体等。
1、外植体
③ 年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组 织，而且也容易诱导分化成植株。 如油菜植株的自下而上的茎段培养结果表明， 下部的器官形成频率低，越往上部，苗的分化频率 越高。年龄也有明显影响，年龄越老，当转移到分 化培养基上生长时，其苗分化频率越低。 因此在组织培养中，要及时转移已形成的愈伤 组织进行分化培养，可大大提高苗的分化频率。
愈伤组织一般只在不与琼脂接触的表面增殖生长，与 琼脂接触的一面极少有细胞增殖。因此，由于愈伤组织 的迅速增殖，整个愈伤组织小方块变成了一个不规则的 馒头状的组织块。
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第二节 植物愈伤组织与遗传变异
• 愈伤组织的遗传变异 • 影响愈伤组织变异的因子 • 愈伤组织染色体变异与形态发生的关系
一、愈伤组织的遗传变异
4、分化期
分化期 (differentiation stage)是指停止分裂的细胞发 生生理代谢变化，导致形成由不同形态和功能的细胞组 成的愈伤组织。 分化期愈伤组织的主要表现如下： ① 细胞分裂部位和方向发生改变。 ② 分化组织瘤状结构和维管组织的形成。 ③ 细胞的体积不再减小，形成分化时的一个最好开 端，并在此以后，保持相对不变。
4、分化期
④ 出现各种类型的细胞。例如薄壁细胞、分生细胞、 管胞、石细胞、纤维细胞、色素细胞、毛状细胞、细胞 丝状体等。 ⑤ 愈伤组织的颜色。生长旺盛的愈伤组织一般呈乳 黄色或白色，有光泽，也有浅绿色或绿色的；而老化的 愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。
以上对愈伤组织形成过程的时期的划分并不具有 严格的意义，实际上，特别是分裂期和分化期往往可 以出现在同一块组织上。 另外，虽然细胞脱分化的结果在大多数情况下是 形成愈伤组织，但这绝不意味着所有细胞脱分化的结 果都必然形成愈伤组织。相反，越来越多的试验证 明，一些外植体的细胞脱分化后可直接分化为胚性细 胞而形成体细胞胚。
2、建成愈伤组织
就染色体数来说，在培养的愈伤组织细胞中异常现 象主要有2种类型： ① 整倍性 增加的染色体数是基本染色体数的整倍数 (2n，3n，4n，5n等) ② 非整倍性 细胞所具有的染色体数不是基本染色体数的整倍数 （如2n-1，2n-2，2n+1，2n+2等）。
在组织培养中，由于选择作用的结果，在最终形成 的细胞群体中占优势的只是一种主要的核型，即一种 染色体数。这种选择作用受培养基成分和培养类型的 影响，同时也受到一个异质群体中细胞间的竞争和互 作的影响。 Smith和Street(1974) 把取自生长速率相同的胡萝卜 二倍体细胞系和四倍体细胞系的细胞等数混合，混合 后经反复继代培养，四倍体细胞的频率不断增加，最 后整个培养物都成了四倍体的细胞系。
二、影响愈伤组织变异的因子
在离体培养中，愈伤组织细胞的核型变异受 许多因素影响，组织自身的变异倾向是一方 面，另外还有若干其他因子，其中最重要的是 培养基成分。
1、培养基
① 培养基成分的化学成分 Toney(1961)曾经指出，通过改变培养基成分，可以 有选择地诱导和保持倍性较高的细胞的分裂。在只加 2,4-D的培养基上，豌豆根段培养物中二倍体细胞发生 分裂，但当培养基中除2,4-D之外还含有激动素和酵母 浸出液时，则能有选择地诱导四倍体细胞发生分裂。 激动素和酵母浸出液也能提高多倍体细胞有丝分裂的 频率。 ② 培养基的物理状态 有研究表明，在悬浮培养的条件下，选择压有利于二 倍体细胞，而在半固体培养的条件下，四倍体细胞出 现的频率较高。
第六章 植物愈伤组织培养
本章主要内容
• 植物愈伤组织及形成过程 • 植物愈伤组织与遗传变异 • 植物愈伤组织培养条件与定向变异
第一节 植物愈伤组织及形成过程
• 植物愈伤组织的概念
• 植物愈伤组织的形态结构 • 植物愈伤组织的形成过程
• 植物愈伤组织的继代培养
一、植物愈伤组织的概念
愈伤组织 (callus)，原是指植物在伤口表面形成 的一团薄壁细胞。在组织培养中，愈伤组织指在人工 培养基上由外植体组织的增生细胞产生的一团不定形 的疏松排列的薄璧细胞。 通过愈伤组织培养再分化产生再生植株是植物组织 培养的主要形式之一。几乎所有高等植物的各种器 官，如根、茎、叶和花等，以及各种组织，如皮层、 茎髓和形成层等，离体后在适当条件下都能产生愈伤 组织。