免疫组化的原理与操作
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理大家好，今天咱们聊聊免疫组化这门技术。
它可是生物医学研究中的一把好手，能让细胞和组织的秘密无所遁形。
咱们先从免疫组化是什么说起。
首先得明白，免疫组化是一种研究方法，它通过给样品加上抗体，让它们跟细胞里的蛋白质或分子“亲密接触”，然后通过染色来观察这些蛋白质或分子的位置和分布。
听起来是不是挺高大上的？不过别急，咱们慢慢来，一步步揭开它的神秘面纱。
1.1 准备工作开始之前，你得确保所有材料都是新鲜的、高质量的，还有那试剂啊，得是实验室里常用的那种。
别忘了准备一个显微镜，这可是观察的关键哦！1.2 固定和包埋接下来就是让细胞和组织固定在一块，这个步骤叫做固定。
把样本放到甲醛溶液或者丙酮里面一泡，就能把它们牢牢地锁住，防止它们移动。
之后呢，把固定好的样本放进树脂里，这样它们就能稳稳当当的了。
这一步是为了保护细胞和组织的结构不被破坏，方便后续的切片和染色工作。
1.3 切片把处理好的样本切成薄片，这就是切片。
切片的时候得小心，别让样本碎掉或者变形。
切片后，还得把那些乱七八糟的东西去掉，比如蜡质啊、气泡啊，这样才能让下面的染色工作顺利进行。
1.4 染色染色可是个技术活。
你得选对染料，颜色要鲜艳，还要能穿透细胞膜，把里面的物质找出来。
染色的方法有很多种，比如直接法、间接法和免疫荧光法等等。
每种方法都有它的特点，就像不同的人有不同的爱好一样。
1.5 观察染色完成后，就可以用显微镜来观察啦！看看细胞和组织里的蛋白质、分子是怎么分布的。
有时候，你还能发现一些有趣的现象，比如某些细胞里藏着很多糖，还有些地方有抗体的“家”。
这些观察结果可是非常宝贵的，能帮助我们更好地理解生物体内的奥秘。
2.1 注意事项做免疫组化实验的时候，可不能马虎哦。
记得要戴好防护眼镜和手套，避免接触到有毒有害物质。
操作时要轻柔，不要破坏样本的结构。
还有啊，处理完样本后得洗手，保持实验室的清洁和卫生。
2.2 常见问题及解决方案有时候会遇到一些问题，比如样本太干或者太湿，这时候可以试试加一点水或者甘油来调整。
免疫组化的原理及应用
免疫组化的原理及应用原理免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过特异性抗体与相应抗原的特异性结合，利用染色反应显示出有关蛋白质在组织或细胞中的位置与数量的技术。
简单来说，免疫组化是通过酶标法或荧光法等方法，利用特异性抗体标记目标蛋白质，从而在组织或细胞中检测和定位目标蛋白质的方法。
免疫组化的原理主要包括以下几个步骤：1.抗原修复：免疫组化一般需要在标本切片前对组织进行抗原修复处理，以恢复和增强抗原的免疫活性。
2.阻断非特异性结合：在免疫组化过程中，为了防止非特异性结合的出现，需要使用非特异性抗体或蛋白质进行阻断。
3.抗体结合：将特异性抗体与标本中的目标抗原进行结合，可采用直接法或间接法。
4.信号显示：对于直接法，特异性抗体上已标记有荧光染料或酶标标记，可直接显示信号；对于间接法，再添加与特异性抗体免疫结合的二抗，二抗上标记有荧光染料或酶标标记，用于显示信号。
5.结果观察与分析：利用显微镜观察标本中信号的形态、分布和强度，进行结果判读和分析。
应用免疫组化在生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域都有广泛的应用。
以下列举一些主要的应用：1.细胞定位：通过使用特异性抗体和荧光染料标记目标蛋白质，可以在细胞水平上观察和定位目标蛋白质的分布和表达情况。
2.组织检测：通过在组织切片上应用免疫组化技术，可以检测和定位特定蛋白质在组织中的表达情况，并用于研究组织的结构和功能。
3.癌症诊断：免疫组化在肿瘤诊断中有重要的应用价值。
通过检测肿瘤标志物的表达情况，可以帮助医生判断肿瘤类型、分级和预后，并指导相应的治疗方案。
4.药物研发：免疫组化可以用于评估新药对蛋白质表达的影响，了解新药的作用机制，以及筛选适合的治疗靶点。
5.神经科学研究：免疫组化在神经科学领域的研究中也有广泛的应用。
通过免疫组化技术，可以观察和定位神经元、神经递质和突触相关蛋白质，帮助研究神经系统的结构和功能。
总的来说，免疫组化技术广泛应用于生命科学研究和临床实践中，为我们研究细胞和组织的结构与功能、研究疾病机制、辅助临床诊断等提供了有力的工具和方法。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种常用的实验诊断技术，它通过检测细胞或组织中的特定蛋白质来帮助诊断疾病。
免疫组化的完整步骤包括抗原制备、抗体制备、预处理、染色和结果分析等几个环节。
下面我将详细介绍每个环节的原理及操作步骤。
首先是抗原制备。
抗原是指能够与特异性抗体结合的物质，常见的抗原有蛋白质、多肽和核酸等。
在免疫组化中，我们需要选择一种合适的抗原，并将其制备成适合免疫反应的浓度和形式。
一般来说，抗原可以采用化学合成法、生物来源法或基因工程技术等方法进行制备。
接下来是抗体制备。
抗体是指能够与抗原特异性结合的免疫球蛋白，它是免疫组化的核心成分。
在抗体制备过程中，我们需要先确定需要检测的抗原类型和数量，然后选择合适的动物或植物源材料，进行细胞融合或表达纯化等步骤，最终得到高纯度的单克隆抗体。
第三步是预处理。
在进行免疫组化之前，我们需要对样品进行一系列的预处理操作，以去除杂质和干扰物质的影响。
预处理包括样品稀释、缓冲液调整、基质效应消除等步骤。
还需要根据具体的实验设计选择合适的预处理方法和条件。
第四步是染色。
染色是免疫组化的核心步骤之一，它可以将标记有抗体的二抗与待测样本中的抗原结合，形成可视化的斑点分布。
常用的染色方法包括直接荧光法、间接荧光法、免疫印迹法等。
在染色过程中，需要注意染料的选择、浓度和作用时间等因素，以保证染色效果的质量和稳定性。
最后一步是结果分析。
免疫组化的结果分析需要综合考虑多个因素，如阳性对照品的比较、背景值的控制、图像处理和统计分析等。
常用的结果分析方法包括图像分析软件(如ImageJ)和统计分析软件(如SPSS)。
在结果分析过程中，需要注意数据的可靠性和准确性，避免误判和漏判的情况发生。
免疫组化是一项复杂而精细的技术，它需要综合运用多种知识和技能才能完成高质量的实验诊断任务。
希望以上的介绍能对您有所帮助！。
免疫组化的完整步骤及各步原理
免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种非常神奇的实验技术，它可以让科学家们观察到细胞内部的微小世界。
那么，这个神奇的过程到底是怎么进行的呢？下面就让我们一起来揭开免疫组化的神秘面纱吧！我们要了解一下什么是免疫组化。
简单来说，免疫组化就是利用特定的抗体去识别和标记细胞表面或者细胞内部的一些蛋白质分子。
这些抗体可以是医生们自己设计的，也可以是从动物或者植物中提取出来的天然抗体。
当这些抗体与目标蛋白结合时，就会发生一些特殊的反应，比如说颜色的变化、荧光的产生等等。
通过观察这些反应，科学家们就可以了解到细胞内部的结构和功能特点。
接下来，我们来看一下免疫组化的完整步骤及各步原理。
首先是样品制备，也就是把待测的细胞样本取出来进行处理。
这个过程非常重要，因为只有处理好的样品才能够被抗体识别和标记。
接着就是抗体制备，也就是把医生们设计好的抗体合成出来。
这个过程需要一定的技术和经验，因为不同的抗体可能适用于不同的细胞类型和目标蛋白。
然后就是抗原检测，也就是把制备好的抗体加入到样品中，看看它们是否能够与目标蛋白结合。
如果结合了，就会发生一些特殊反应，比如说颜色的变化、荧光的产生等等。
最后就是结果分析，也就是根据观察到的反应来推断出细胞内部的结构和功能特点。
虽然免疫组化看起来很复杂，但是只要掌握了其中的原理和技巧，就可以轻松地完成实验了。
当然啦，在实际操作过程中也会遇到各种各样的问题和挑战，比如说抗体的选择、样品的质量等等。
但是只要我们保持耐心和信心，相信总会找到解决问题的方法的。
免疫组化是一项非常重要的技术，它可以帮助我们更好地了解细胞内部的结构和功能特点。
虽然它看起来有些复杂难懂，但是只要我们认真学习和实践，相信一定可以掌握其中的精髓并取得优异的成绩！。
免疫组化的原理
免疫组化的原理
免疫组化是一种利用抗体与其特异性抗原结合的反应来检测或定位特定分子的方法。
它主要基于抗体的高度特异性与高亲和力，能够识别并结合到抗原上。
免疫组化的过程一般包括固定组织、抗原还原、孵育抗体、洗涤、孵育二次抗体和检测。
具体步骤如下：
1. 固定组织：将待检测的生物组织固定在载玻片上，通常使用形式固定剂或冷冻剂进行固定。
2. 抗原还原：对固定组织进行抗原还原处理，以破坏抗原与抗体结合时的形态学阻滞并使抗原更易于与抗体结合。
3. 孵育抗体：将含有特异性抗体的抗体溶液加到载玻片上的组织切片上，允许其与目标抗原结合。
此时，如果组织中存在目标抗原，抗体就会与其结合形成免疫复合物。
4. 洗涤：通过洗涤步骤去除未结合的抗体，减少干扰性信号的产生。
洗涤通常使用磷缓冲盐溶液或其他缓冲溶液进行多次冲洗。
5. 孵育二次抗体：加入标记有酶、荧光物质或放射性同位素等的二抗溶液，使其与已结合的抗原-一抗复合物发生反应。
二次抗体通常是对多种一抗的特异性抗体。
6. 检测：使用相应的技术，如酶标记法、荧光标记法或放射性
探测等，检测二次抗体与抗原-一抗复合物的结合情况。
通过信号的产生和可视化，可以确定抗原的存在位置以及其表达程度。
总的来说，免疫组化是一种通过利用抗体与抗原间的特异性反应，实现对目标抗原的检测和定位的方法。
其原理主要是通过抗原-抗体的结合来实现对特定分子的识别和鉴定。
免疫组化的原理与操作
肿瘤分类
01
通过检测肿瘤组织中特定抗原的表达，有助于判断肿瘤的性质
和来源，为肿瘤的分类提供依据。
预后评估
02
免疫组化检测肿瘤细胞增殖、侵袭和转移相关的分子标志物，
有助于评估患者的预后和制定治疗方案。
靶向治疗
03
针对特定肿瘤相关抗原的免疫组化检测，有助于发现潜在的靶
点，为靶向治疗提供指导。
在感染性疾病诊断中的应用
病原体检测
通过检测感染组织中特定病原体的抗原或抗体，有助于确诊感染 性疾病的病因。
鉴别诊断
对于临床表现相似的感染性疾病，免疫组化检测有助于鉴别诊断， 为临床治疗提供依据。
流行病学调查
对感染性疾病的免疫组化检测结果进行分析，有助于了解疾病的 流行病学特征和传播途径。
在自身免疫性疾病诊断中的应用
自身抗体检测
控制显色反应的条件，避免背景染色和假阳性结果。
实验后的质量控制
1 2
结果判读
建立标准化的结果判读方法，确保结果的一致性 和可重复性。
室内质控
定期进行室内质控，评估实验的稳定性和可靠性。
3
室间质评
参与实验室间的质评活动，提高实验结果的可靠 性。
05
免疫组化在临床病理诊断中的应用
在肿瘤诊断中的应用
02
抗体选择与实验设计
抗体来源与特性
01
02
03
抗体来源
免疫组化抗体主要来源于 动物免疫系统，如小鼠、 兔、羊等，通过注射抗原 产生特异性抗体。
抗体特性
抗体具有高度的特异性， 能够识别并结合特定的抗 原，用于标记和定位组织 中的目标分子。
抗体纯度
高质量的抗体应具有高纯 度，低交叉反应性和低非 特异性结合，以提高实验 的准确性和可靠性。
免疫组化的原理及操作规程
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
免疫组化实验原理及其步骤
免疫组化实验原理及其步骤大家好，今天咱们聊聊免疫组化实验，这是一个听起来有点高大上的实验，但实际上，它可以用简单的话来解释清楚。
免疫组化实验，简单来说，就是通过抗原抗体反应来识别细胞或组织中的特定蛋白质。
听上去是不是有点神秘？别担心，我们一步步来解开这个谜团。
1. 什么是免疫组化实验免疫组化实验其实就是一种用来观察细胞或组织中特定蛋白质的技术。
想象一下，你在大海里找宝藏，免疫组化实验就像是你用来找宝藏的那把神奇的探测器。
它能帮助我们在复杂的组织中找到目标蛋白，就像在沙滩上找到了隐藏的珍珠一样。
这个过程可以分为几个关键步骤，每一步都至关重要。
2. 实验步骤2.1 准备工作首先，你得准备好样本。
无论是组织切片还是细胞涂片，都要处理得当。
就像是做菜前，你得把所有的食材都准备齐全一样。
样本处理得当，才能保证接下来的实验顺利进行。
2.2 固定和切片接下来是固定。
固定的目的是让样本中的蛋白质不变形，保持原有的状态。
这一步就像是给样本穿上保护衣，确保它们在实验过程中不会跑偏。
然后，将样本切成非常薄的片，这样才能方便后续的操作。
这就像是做蛋糕时，你要把蛋糕切成薄片，好让每一片都能均匀上色。
2.3 阻断非特异性结合在这一步，咱们需要阻断样本上那些可能干扰实验的东西。
这就好比你在派对上，得先处理好背景噪音，才能好好享受音乐。
这里用一些阻断液体，确保后续的抗体只会和目标蛋白结合，不会出现误会。
2.4 加入抗体这是整个实验的核心部分。
我们要用到的抗体，就像是侦探寻找线索。
首先加入一抗，这是一种能特异性识别目标蛋白的抗体。
然后加入二抗，这个二抗就像是给目标蛋白贴上了一个显眼的标签，能帮助我们看到它。
二抗一般会和一种显色剂结合，这样我们就能通过显微镜看到目标蛋白的存在了。
2.5 显色和观察最后，我们要显色。
显色的过程就像是把照片上的黑白图案变成彩色，让一切都变得清晰可见。
通过显微镜观察样本，看看那些我们感兴趣的蛋白质在哪里，就像在寻找隐藏的宝藏一样。
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IHC不仅具有传统形态学（包括LM和EM水平） 能对组织和细胞进行仔细、客观观察的优点（特别 是经苏木精或伊红复染后），而且还克服了传统免 疫学反应只能定性和定量（离体、液相），而不能 定位的缺点。IHC则可在原位和固相对染色结果进 行观察。目前IHC的定位可精确到亚微结构水平。 随着IHC技术的发展和图象分析技术的发展， IHC已进入多标记（双标记）和定量研究的阶段， 使IHC在生物学和医学各领域的应用日益广泛，不 仅用于研究，也用于诊断。IHC与核酸分子杂交相 结合形成的原位杂交技术（in situ hybridization， ISH）既特异性强、灵敏，又具定位、可视的特点。
（三） 组织的脱水、浸蜡、包埋和切片
前三步只用于石蜡切片，冰冻切片和振动切片 不需此步骤。 切片可分为： 石蜡切片：脱水、透明、浸蜡、包埋、切片5~7μm； 冰冻切片：浸糖，20%~30%蔗糖4oC过夜，减少冰 晶；OCT包埋；液氮速冻，减轻组织破 坏。病理切片要薄，5~7 μm；脑片通常 30~50 μm厚。 振动切片：不需做任何包埋，固定后的组织可直接 用振动切片机做各种厚度的切片，并在 染色后可进一步制作电镜标本观察。
三、样品的准备、处理 （一）标本的收集与处理
IHC染色成功与否及其质量如何，除染色方法本 身外，对材料的处理也至关重要，它包括：取材、 固定、脱水、包埋、切片等。目的：保存好Ag的数 量及活性、保持组织细胞的良好形态结构。材料的 来源：人体及实验动物；细胞和组织；新鲜的及固 定的。 1、组织标本的取材与储存 来源：活检取材、手术切除、实验动物组织等。 要求：要快、要小（1×1×0.4cm），避免挤压。 处理：冰冻→即用或保存；固定→即用或保存。
2、常用固定剂及其用途
1. 10%的formalin（4%的甲醛formaldehyde）：以pH7.4的PBS 配制，优点：穿透力强、固定快、组织收缩小；适于固定蛋 白、肽类、酶、糖。IHC常用4%多聚甲醛polyformaldehyde 灌注固定及后固定，时间4~6 h。 2. 2.5%的戊二醛，同上。也可用2%戊二醛与2%多聚甲醛混合 液固定，尤对超微结构保存好。醛类固定剂的缺点是易封闭 抗原，必要时需抗原修复。 3. 70%的酒精（乙醇），优点：固定蛋白好，缺点：组织收缩 严重；时间：2h。 4. 70%丙酮，优点：渗透快；缺点：对形态保存不好；用于对 冰冻切片和细胞涂片的固定；时间：10min。 5. 混合固定液：Bouin液：40%PF250ml、冰醋酸50ml、饱和苦 味酸250ml；还有PLP固定液，较适合免疫组化。 6. 四氧化锇（OsO4 锇酸）：常用PBS配制1%锇酸溶液后固定 1h，用于免疫组化及电镜观察。有强烈刺激，需在通风橱内 操作。
2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动物的二抗；
3、一抗可高度稀释，节省一抗，且可用PBS代替一抗做空白对照。
3．非标记Ab桥法：
“桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体， 其二抗为未标记桥抗体。 （1）单桥法
(2)双桥法 在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次， 可增大染色强度。 ★ 特别提示：注意动物种属关系
特点：敏感性高，但酶浓度不好掌握；与组织非 特异性结合的酶不易洗去，背景染色重。
4．过氧化物酶—抗过氧化物酶法（Peroxidase peroxidase method，简称PAP法）
anti-
是桥法的改良，用第二抗体作“桥梁”，先与第一抗体结合， 再与PAP复合物联结，形成抗原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物 ，最后用底物显色剂显色。
2、细胞标本的取材与储存
来源：血细胞、穿刺细胞、体液细胞等。 处理：细胞多时直接涂片、干燥、固定、染色； 细胞少需离心沉淀、涂片、干燥、固定、染色； 对于体外培养细胞：贴壁生长细胞（内皮C、纤 维C、神经C等）在培养皿底置载玻片；悬浮生长细胞 需离心沉淀，再涂片、固定，即用或冰冻保存。
（二）固定（fixation）
（四）IHC的应用
1. 只要是形态科学均可采用:包括病理学、神经科学、 生物学、病原微生物的检测（病毒、细菌、寄生虫 等）、皮肤病学、器官移植等。 2. 可用于多种材料：A.各种组织（冰冻组织、formalin 固定组织、石蜡包埋组织兼可）；B.各种细胞(穿刺、 体液、涂片、血细胞、培养细胞等）。 3. 用于诊断：肿瘤病理学等（大中医院）。 4. 用于科研：临床和基础医学，尤其是形态学专业研 究生常用IHC，或IHC+分生技术；最近几年，分子 生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来， 用免疫组织化学方法对所研究的大分子进行定位， 进而深入研究其功能。
（二）技术分类
1. 根据染色方式分成：① 贴片染色 ② 漂浮染色 2. 根据Ag-Ab结合方式分成： ① 直接法 ② 间接法 ③ 多层法 3. 按标记物的性质分成： ① 免疫荧光技术（免疫荧光法） ② 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、 ABC法） ③ 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色 法、蛋白A金法）
一、IHC的发展简史
—— IHC技术源于免疫荧光术（immunofluorescence, IF），从1941年~1950年Coons等用了10年首创了 荧光素标记抗体技术——检测肺组织内的肺炎双 球菌，六、七十年代IF在科研中占据着主导地位 ——1968 年中根一穗（Nakane）等创建了酶标抗体技 术（immunoperoxidase，IPO）——铁蛋白标记 Ab技术; ——1974年Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧 化物酶－抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫 细胞化学得到广泛应用；
二、IHC的现状和发展前景
（一）方法学
1.从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）→亲和反应。新的亲 和物质对有：生物素与卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌A 蛋白（SPA）与IgG，凝集素与受体，激素与受体。这些亲 和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、 胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学 （affinity histochemistry），这些方法特异性、敏感性、稳 定性高，更方便、适于某些特殊观察（如EM）。 2.从单一显示某种物质（单标记）→显示多种物质（双标记）。 3.从LM→EM（超微结构）：免疫电镜、胶体金法、金银法。 4.从定性→定量，图象分析（IA）、流式细胞术（FCM）。 5.IHC与ISH相结合，可在不同水平检测DNA、mRNA、protein。 6. 原位PCR+IHC可在组织原位通过扩增检测微量目的DNA。 7. 趋于标准化、自动化。
（1）ABC复合物的制备：
（2）ABC法反应原理：
特点：ABC法敏感性更高，比PAP法 敏感20~40倍，背景也更清晰。
ABC法示意图
染色结果观察（BrdU）
6、酶标亲和素-生物素技术（labelled avidin-biotin technique， 简称LAB法）。
即用辣根过氧化物酶直接标记avidin，用biotin标记2抗。
1．直接法
荧光素直接标记特异性抗体（一抗）上，标记抗 体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察→ 检测抗原。
优点：简单，时间短， 特异性强。 缺点：灵敏度低，所 需抗体量大 （不经济）。 应用：基本不用了！！
2．间接法
荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。 ※显色后镜检
特点：1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异性较低；
（三）标记物
1. 必要性：组织细胞内Ag-Ab结合反应一般是不可 见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。 2. 常用标记物 ① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（ Fluorescein isothiocyanate ，FITC）---荧光显 微镜下呈绿色荧光; 四乙基罗达明（rho—damine RB200）---荧光显微镜下发橙红色荧光 ② 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 ③ 生物素：（Biotin） ④ 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 ⑤ 其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）
ห้องสมุดไป่ตู้
（五）抗原修复
近年兴起的新技术。目的：暴露被交联封闭的Ag。 主要适用于经长期formalin固定的标本、石蜡包埋标 本；也可用于冰冻切片。常用的方法有： （1） 微波加热 切片煮沸10~20min，室温自然冷却， 所用溶液有：①饱和NaCL溶液；②10mMpH 6.0的 枸橼酸钠缓冲液；③ 4M的尿素等；④pH8.0TBS; （2）高压锅处理 将切片放入10mM、pH 6.0的枸橼酸 钠缓冲液容器中，置锅内加盖喷气3~10min，自然冷 却。 （3）酶消化处理 ：常用0.1%的胰蛋白酶（含 0.1%CaCL2，pH 7.8）37。C 10min。或0.4%胃蛋白 酶37。C 30min;
Immunohistochemistry
免疫组化概述
概念：免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 是 利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织 和细胞中某种化学成分的一门技术,是传统的免疫学 和组织化学相结合而发展起来的一门新兴学科，也 叫原位免疫学（In situ immunology）。
1、固定的含义 固定是指以某种化学物质使蛋白质、酶类（变性 ）、脂质、糖类等物质保持在组织细胞原位，避免 Ag溶解、扩散、丢失；保持组织细胞的正常形态结 构。 根据Ag对固定剂的耐受性，可将其分为：不稳 定Ag（如细胞表面Ag，不耐甲醛，宜用丙酮）、半 稳定Ag及稳定Ag，后二者多为蛋白、肽类、酶类物 质。 固定有时间性，太短达不到固定目的，太长交联 过度，封闭Ag。
（四）防脱片剂
（1） 蛋白甘油，蛋清与甘油1：1搅拌、过滤、防腐； （2）1%的铬矾明胶涂片； （3）0.1%的多聚赖氨酸涂片，晾干备用。配制时用塑料 瓶而不能用玻璃瓶； （4） 购买商品化的进口硅化玻片； （5）APES（氨丙基三乙氧基硅烷），1：50丙酮稀释，