血红蛋白的提取和分离知识梳理

血红蛋白的提取和分离知识梳理

一、凝胶色谱法

1．概念：也称做＿＿＿＿＿＿，是根据＿＿＿＿＿＿＿分离蛋白质的有效方法。

2．原理

（1）由＿＿＿＿＿构成的凝胶，内部有许多贯穿的＿＿＿。

（2）当＿＿＿＿＿＿不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量＿＿＿的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程＿＿＿＿＿，移动速度＿＿＿，而相对分子质量＿＿＿的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在＿＿＿＿＿＿移动，路程＿＿＿，移动速度＿＿＿，从而使＿＿＿＿＿＿不同的蛋白质分子得以分离。

二、缓冲溶液

1．作用：在一定范围内，抵制＿＿的＿＿＿＿＿对溶液pH的影响，维持pH＿＿＿。2．配制：由＿＿＿＿＿种缓冲剂溶解于＿＿＿中配制而成，通过调节缓冲剂的＿＿＿＿＿＿就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。

三、电泳

1．概念：指＿＿＿＿＿在电场的作用下发生＿＿＿＿的过程。

2．原理：在一定的＿＿＿下，＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿等生物大分子的可解离基团会带上＿＿＿或＿＿＿，在＿＿＿＿＿的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷＿＿＿＿的电极移动。

3．作用：电泳利用了待分离样品中各种分子＿＿＿＿＿的差异及分子本身的＿＿＿、＿＿＿的不同，使带电分子产生不同的＿＿＿＿＿，从而实现样品中＿＿＿＿＿的分离。

4．方法：常用的电泳方法有＿＿＿＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿，测定蛋白质分子量时通常使用＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

四、实验操作

1．样品处理：通过＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿＿＿＿＿等操作收集血红蛋白溶液。

（1）红细胞的洗涤：目的是＿＿＿＿＿＿。分离时采取＿＿＿＿＿＿＿＿＿，直至上清液中没有＿＿＿＿＿，表明红细胞已洗涤干净。

（2）血红蛋白的释放：在＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。

（3）分离血红蛋白溶液：把＿＿＿＿＿离心后，将试管中的液体用＿＿＿过滤，除去＿＿＿＿＿＿，于＿＿＿＿＿＿中静置片刻后，分离出下层的＿＿＿＿＿＿。

2．粗分离：即透析

（1）方法：将血红蛋白溶液装入＿＿＿＿＿，将＿＿＿＿＿放入一定量的适宜浓度的＿＿＿＿＿＿中，透析＿＿＿。

（2）目的：将＿＿＿＿＿＿＿＿＿的杂质除去。

（3）原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。

3．纯化：通过凝及色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：

（1）凝胶色谱柱的制作。

（2）凝胶色谱柱的装填

①材料：本实验使用的是＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

②方法：凝胶用＿＿＿＿＿＿充分溶胀后，配成＿＿＿＿＿＿，一次性＿＿＿倒入色谱柱内。不能有＿＿＿存在；不能发生＿＿＿＿流干露出凝胶颗粒的现象。

（2）样品的加入的洗脱

①a．准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的＿＿＿＿＿＿缓慢下降到与＿＿＿＿平齐，关闭出口。

b．加样：用＿＿＿＿小心地将1mL透析后的样品加到＿＿＿＿的顶端，注意不要破坏＿＿＿＿。

c．加样后，打开下端出口，使样品渗入＿＿＿＿＿＿内。

②洗脱：加入＿＿＿＿＿，打开下端出口，进行＿＿＿＿。

4．纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是＿＿＿＿＿＿＿＿。

五．操作提示

1．红细胞的洗涤：＿＿＿＿、＿＿＿＿与＿＿＿＿十分重要。＿＿＿＿＿过少，无法除去血浆蛋白；＿＿＿＿＿＿过高和＿＿＿＿过长会使＿＿＿＿等一同沉淀，达不到分离效果。2．色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在＿＿＿＿＿＿中膨胀，可以将加入其中的＿＿＿＿＿用＿＿＿＿加热，加速膨胀。

3．凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的＿＿＿＿＿＿，降低＿＿＿＿＿。

4．蛋白质的分离：如果红色区带＿＿＿＿＿＿＿地移动，说明色谱柱制作成功。

【答案】

一、1．分配色谱法相对分子质量大小

2．（1）多糖类化合物通道（2）相对分子质量较小较长较快较大凝胶外部较短较快相对分子质量

二、1．外界酸和碱基本不变

2．1～2水使用比例

三、1．带电粒子迁移

2．pH多肽核酸正电负电电场相反

3．带电性质大小形状迁移速度各种分子

4．琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

四、1．红细胞的洗涤血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液

（1）去除杂蛋白低速短时间离心黄色（2）蒸馏水甲苯（3）搅拌好的混合液滤纸脂溶性沉淀层分液漏斗红色透明液体

2．（1）透析袋透析袋磷酸缓冲液12h（2）样品中分子量较小

3．（2）交联葡聚糖凝胶蒸馏水凝胶悬浮液缓慢气泡缓冲液

（3）缓冲液凝胶面吸管色谱柱凝胶面凝胶层磷酸缓冲液洗脱

4．SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

五、1．洗涤次数离心速度离心时间洗涤次数离心速度时间白细胞

2．洗脱液湿凝胶沸水浴

3．洗脱次序分离效果

4．均匀一致