菌种的衰退、复壮和保藏

第五节菌种的衰退、复壮和保藏

性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。

由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。

一、斜面冰箱保藏法

一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。保存期3月到6月。

二、沙土管保藏法

适合于产孢子或芽孢的微生物。

首先，将沙与土洗净、烘干、过筛，按沙与土的比例为1—2：1混合均匀，分装于小试管中，料高1厘米左右，121C间歇灭菌三次，烘干备用。一般沙80目，土80一100目。

其次，将孢子制成悬浮液，接入沙土管。或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。

保存期1年左右。

三、菌丝速冻法

不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。该法保藏温度为-20℃，为避免M受损伤致死，需甘油作保护剂。甘油最终浓度为25％。

操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。

四、石蜡油封存法

向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，量高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。保存期约1年

五、真空冷冻干燥保藏法

是目前国内外较理想的常用方法。其基本原理是在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，M的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。菌种可保存5年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种M 都适用。所以，都已较普遍地应用。

基本操作：将M制成悬浮液，再与保护剂混合，然后放在特制的安瓿管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封。低温保藏。

保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使M疏松地固定在上面。牛奶可用离心或加热的方法脱脂。

六、液氮超低温保藏法

液氮超低温保藏法是近几年才发展起来的，国外已较普遍采用，是适用范围最广的M保藏法。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其他保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。

（1）原理

用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达-196℃，远远低于其新陈代谢作用停止的温度(-130℃)，所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。

（2）操作

a 安瓿管液氮保存于超低温状态，所用安瓿管需能承受大温差而不至于破裂，一般用95料或GCl7玻璃管，安瓿管选好后印上标记，加棉塞后灭菌，烘干后备用。

b 菌种准备及分装因为液氮法菌种要经受超低温冷冻过程，也需要保护剂。常用保护剂为10％甘油。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓿管中，安瓿管装量为0.2～1mL。

c 冻结液氮法的关键是先把M从常温过渡到低温。这样在细胞接触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。美国ATCC 采用先将菌液降温到0℃，再以1℃/min的速度降低到-35℃，再把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中。

因液氮蒸发导致温度上升，冰晶状态发生变化而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮残存量，定期补加。

d 重新培养使用或检查所保存的菌种时，将安瓿管从冰箱中取出，室温或35～40℃水浴中迅速解冻，升温至0℃时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。

七、国内外主要菌种保藏机构

（一）国际机构：

（1）、ATCC American Type Culture Collection. Rockvill Maryland, U. S.

A. 美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维尔市。

（2）、CSH Cold Spring Harbor Laboratory. U. S. A. 冷泉港研究室，美国。

（3）、IAM Institute of Applied Micribiology. University of Tokyo, Japan. 日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。

（4）、IFO Instltute for Fermentation. Osaka, Japan. 发酵研究所，日本大阪。

（5）、KCC Kaken Chemical Company Ltd. Tokyo, Japan. 科研化学有限公司，日本东京。

（6）、NCTC National Collection of Type Culture. London, United Kingdom.国立标准菌种收藏所，英国伦敦。

（7）、NIH National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, U. S. A. 国立卫生研究所，美国，马里兰州，贝塞斯达。

（8）、NRRL Northern Uti1ization Research and Development Division, U. S. Department of Argculture, Peoria, U. S. A. 美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市。

（二）国内机构：

中国微生物菌种保藏管理委员会(China Committee for Culture Collection of Microorganisms．CCCMS) 下设六个菌种保藏管理中心。

1、普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)：中国科学院微生物研究所，北京(AS)：真菌，细菌；中国科学院武汉病毒研究所，武汉(AS-Ⅳ)：病毒。

2、农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)：中国农业科学院土壤肥料研究所，北京(1SF)。

3、工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)：轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京(IFFl)。

4、医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)：中国医学科学院皮肤病研究所，南京(1D)：真菌。卫生部药品生物制品检定所，北京(NICPBP)：细菌。中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。

5、抗生素菌种保藏管理中心(CACC)：中国医学科学院抗生素研究所，北京(1A)。四川抗生素工业研究所，成都(STA)：新抗生素菌种。华北药厂抗生素研究所，石家庄(IANP)：生产用抗生素菌种

6、兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)：农业部兽医药品监察所，北京。