菌种的保藏与复壮
微生物菌种保藏及复壮
微生物菌种保藏及复壮5.1. 微生物菌种保藏在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。
微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。
具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。
5.1.1. 蒸馏水悬浮法这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。
好气性细菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜面传代保藏斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。
它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。
但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。
因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。
斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。
此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。
如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。
5.1.3. 矿物油中浸没保藏此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。
特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。
是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。
菌种保藏方法及复壮技术
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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
单元3 菌种保藏与复壮
单元3 菌种保藏与复壮模块1 菌种的保藏在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。
菌种保藏的意义菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。
所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。
其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。
菌种保藏的原理菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。
一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。
一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。
一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1) 经长期保藏后菌种存活健在；(2) 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。
(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
一、微生物菌种保藏要求在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本方法：由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。
世界上最早建立的菌种保藏室捷克微生物学家Frantisek Kral布拉格大学副教授，讲授细菌学和真菌学课程。
1890年，Kral建立了私人细菌学实验室，即KRAL细菌学实验室，同年建立了世界上第一个微生物菌种保藏室，保藏有800多个微生物菌种，相继公布了5个版本的菌种目录。
1911年，去世，二战被毁，原保藏的菌种几经转移，至今已寥寥无几。
菌种保藏和复苏-精简版
菌种的保藏与复苏一、菌种保藏（一）菌种保藏的定义菌种保藏（culture preservation）是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。
菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。
（二）菌种保藏的原理微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但大都是根据这三个因素而设计的。
其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。
在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。
在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。
如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。
与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。
（三）菌种保藏的方法本实验室常用菌种保藏方法主要有：1.低温保藏法将菌种接种在适宜的固体或液体培养基上，待菌生长充分以后，转移至4°C冰箱中保存。
平板在4°C存放时，最好用封口膜封口，不能长时间存放，一般7-10天，最多不应超过2个星期（特殊菌株可能时间更短，如铜绿假单胞菌只能存放3天）。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，应经灭活处理后销毁。
2.甘油冷冻管保藏法菌种长时间冻存应放于液氮或者-80 °C冰箱，利用10-15%的甘油进行冻存。
甘油的作用：甘油能够提高水体的粘稠度，使其冰点提高，防止细胞内部产生冰晶造成细胞的损害，一般使用甘油的终浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产生毒性，如果是保存带有质粒的菌种建议甘油终浓度为8-10%，甘油浓度太高会导致质粒的不稳定。
菌种的复壮与保藏(陈)
➢石蜡油封藏法 • 措施：阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而
且又防止了水分挥发。
• 方法：液体石蜡150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸
汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分→倒入菌 种管中（高出1cm） → 4℃保存。
• 适用：霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌(xìjūn)等 • 保藏期：1～2年，或更长
常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高 分子物质。
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复苏方法： —— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， —— 将安瓿管顶部烧热， —— 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶
部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下， 敲下已开裂的安瓿管的顶端， —— 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌 吸管移入新鲜培养基上，进行(jìnxíng)适温培养。
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➢ 砂土管干燥保藏法 • 措施(cuòshī)：无营养，缺氧，干燥 • 方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂
土管中→ 干燥→ 封口 → 5℃保藏 • 适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有
芽孢的细菌 • 保藏期：1~10年或更长
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沙土 管制作 (shātǔ)
另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加 并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
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3、不适宜的培养和保藏条件 不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。
不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气(tōng qì)量 等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退 型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过 正常细胞，造成菌种衰退。
第三章 菌种保藏复壮扩大培养
• （5）其他保藏方法
• 冷冻法：分低温冷冻（－20 ℃）与 超低温冷冻（－196 ℃）两种。适 用于细菌、真菌、病毒等的保藏 • 液态真空干燥法：菌体在恒温液态 条件下进行真空干燥。适用于包括 细菌、病毒，特别适用于冷冻干燥 保藏效果不佳的菌种。 • 琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产 孢子细菌的保藏
（2）矿物油保藏法
将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的 液体石蜡，油层高于斜面末端1cm，然后放于 冰箱中保存。 适用菌种：适用于除细菌外的其它菌种
（3）砂土管保藏法
利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微 生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两 步。 适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对干燥敏 感的细菌（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以 及酵母不适用。
• 2、种龄与接种量 • 3、斜面冷藏时间 • 4、温度：温度直接影响生长和酶的合合成酶的最适pH。 培养基pH值在发酵时要受菌体代谢的影响。
• 调节方法（使之保持适当的pH值）有三种 方法： 用酸碱溶液中和法；使用缓冲溶液法； 使用生理缓冲剂；
3、新诱变因子及诱变技术
• （1）低能离子束诱变： 离子注入是20世纪80年代兴起的一种表面处理技术。这种 相互作用过程大致分为能量沉积、动量传递、离子注入和电荷 交换等四个原初反应过程，在10－19－10－13s中间时发生。 荷能离子注入除具有Y射线能量沉积引起机体损伤的特征外， 还具有动能交换产生的级联损伤，表现为遗传物质原子转移、 重排或基因的缺失。还有慢化离子、移位原子和本底元素复合 反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造 成的损伤。离子注入通常采用N+、H+、Ar＋。离子注入生物 学效应显示出一些不同于辐射生物学的特征，相当于物理和化 学诱变两者相结合的复合诱变效应 • （2）激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变
菌种的保藏与复壮
4、目的菌的筛选
• 涂布法：于分离平板上铺上一层单一的试验菌的办法用来测定各 个菌落的抗生素生产能力。
• 复印平板法：即用丝绒等把琼脂平板上的菌落转移到别的琼脂平
板上的方法。例如在检测营养缺陷性时，首先在完全培养基琼脂
平板上制备密度适当的菌落，然后把平板上的菌落转移到丝绒上， 再把它当作印章，复印在不含营养物的合成培养基琼脂平板上。 所以和原来平板上的菌落相比较，就可以很容易地检测出营养缺 陷型菌株。这种方法被广泛应用于分离突变菌株，常和诱变剂处
1、常用的细菌
•
大肠杆菌 应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。
乳酸杆菌
应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶 等的制作
枯草芽孢杆菌 应用：生产淀粉酶
2、酵母菌
种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵 母、面包酵母。 应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取 蛋白质、生产脂肪。
啤酒酵母
根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变。
诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。 诱变因素的种类很多，有物理的、化学的和生物的三大类。经 诱变处理后，微生物的遗传物质、 DNA和 RNA的化学结构发 生改变，从而引起微生物的遗传变异。
诱变育种的一般步骤
（1）出发菌株的选择 • 自然界直接分离到的野生型菌株 • 经历过生产条件考验的菌株 • 已经历多次育种处理的菌株
4、突变菌株的筛选 （1）营养缺陷型突变株的筛选 • 生物合成途径的某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成， 末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。 （2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选 • 调节基因或操纵基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不能再 和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因，因此 不再起反馈阻遏作用； • 编码酶的结构基因发生突变，使变构酶不再具有结合终产物 的能力但仍具有催化活性，从而解除了反馈抑制。 • 抗反馈突变株一般通过抗结构类似物突变的方法筛选。 • 营养缺陷型的回复突变株中也可获得抗反馈突变株。
菌种的衰退复壮和保藏
2、菌种保藏方法
1）斜面菌种低温保藏法---利用低温对微生 物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。 把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液 等,直接放入4～5℃冰箱中。保藏时间一 般不超过3个月,到时必须进行移接传代, 再放回冰箱。
2）砂土管保藏法---将干燥砂粒与细土混合 后灭菌制成砂土管,然后接种保藏 。若把 砂土管放在低温或抽气后密封,效果更佳。 此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。 保藏期1～10年 3）石蜡油封藏法---向培养好的菌种斜面上, 加入灭菌石蜡油,高出斜面1cm,然后蜡封 管口,放入冰箱。该法既可防止培养基水 分蒸发,又能使菌种与空气隔绝。保藏期 1～ 2年
美国的“美国典型菌种收藏所”(ATCC)，保藏 方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。
2、衰退的防止
（1）控制传代次数 （2）创造良好的培养条件 （3）利用不易衰退的细胞传代 （4）采用有效的菌种保藏方法
二、菌种的复壮
1、复壮的定义：
狭义复壮：指的是在菌种已在发生衰退的情况下，通 过纯种分离和测定典型性状，生产性能等指标，从 已衰退的群体中筛迁出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有的性状的相应措施。 广义的复壮：是一项积极的措施，即在菌种的典型特 征或生产性状尚未衰退前，主经常有意识地采服纯 种分离和生产性状的测定工作，以期众中选择到自 发的正变个体。
第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、菌种的衰退及其防治 1、衰退：是指由于自发突变的结果，而使某种 原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。 如原有形态性状变得不典型了，生长速度变慢， 代谢产物生产能力下降，致病菌对宿主侵染力 的下降，对外界不良条件包括低温、高温或噬 菌体侵染等抵抗能力的下降等。
3、菌种保藏中心
我国由于1979年7月成立了中国微生物菌种 保藏管理委员会(CCCCM),
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菌种保藏
• 在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐
渐减慢，存活下来的孢子在以后保存期 间稳定性较好，保藏的有效时间与菌种 存活率的关系见图2-10。 用沙 土管保藏的某些抗生素产生菌保藏期可 达18年(土霉素和链霉素产生菌)到22年 (新霉素产生菌)，但对利福霉素、卡那 霉素、四环素等容易产生变异的菌种， 就不适合作长期的沙土管保存。
1.沙土管法
取河(海)沙，过0.78mm(24目)筛，用10％盐酸 浸泡24h，倒去盐酸用清水冲洗至pH呈中性，去水 烘干或晒干。取菜园或果园土粉碎过筛，把烘干 的沙土按3：2或1：1混合装入指形管或高100mm， 直径为10mm的小试管中，高约1cm(约2g)，塞棉塞 121℃灭菌1h，也可用170℃2h干热灭菌(或蒸汽三 次间歇灭菌)，蒸汽灭菌后需烘干。经肉汤检查确 实证明无菌即可使用。将要保存的斜面菌种制成 浓孢子悬液(≥106/ml)，用灭菌滴管或吸管吸取孢 子悬液滴入无菌沙土上，每管约0.3～0.5ml，用 接种环将其混合均匀。
(六)真空冷冻干燥法
• 4.简易冷冻干燥装置 在缺乏真空冷冻干
燥机的情况下，可以自己装配一个简易 冻干装置(图2-11)，它主要由歧管(玻璃或 金属管制成)、冰浴、冷凝器(水汽接收) 和真空泵组成。冰浴用干冰(固体CO2)和 甲基溶纤剂致冷，干燥后期也可作温度 控制用。冷凝器也要置冰浴中，必要时 用一根U玻璃弯管代用。安瓿管在冻干前 也要预冻
1.沙土管法
• 也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直
接挑取放入沙土中。然后将沙土管抽真 空干燥。这时管内砂土松散，表明已干 燥。将干燥的砂土管放置在干燥器或密 闭容器内、干燥器下部放置变色硅胶等 干燥剂，于4℃下保存。从斜面取出的孢 子放入沙土管中混匀后，可以不抽真空 直接放干燥器内保存。
1.沙土管法
一、菌种保藏
现行的菌种保藏方法有下列诸种:
• (一)低温保藏法 • (二)低温定期移植法 • (三)石蜡油低温保藏法 • (四)干燥保藏 • (五)甘油管保藏法 • (六)真空冷冻干燥法 • (七)液氮超低温保存
(一)低温保藏法
• 这是一种常用的简便方法。一般的斜面孢
子、液态孢子、斜面种子以及用麸皮、大 米、小米或碎玉米制成的孢子，可以放在 4℃冰箱内保藏，这种温度条件下不能使 菌体进入休眠，而仅是抑制微生物的生命 活动。因此，保藏时间不宜过长，一般不 超过1～2个月为宜。本方法虽然简便，但 由于菌株处于较高的水平活性下，这对保 藏株的生产性状是不利的，因此，生产菌 种一般不采用此法保藏。
3.大(小)米保藏法
•
是根据我国制曲原理加以改进的一种 方法。此法是将曲霉等大量产生孢子的 菌直接培养在大(小)米培养基上，待孢子 充分成熟后干燥后保藏。
(五)甘油管保藏法
• 本法也是利用微生物在甘油中生长和代
谢受到抑制的原理达到保藏目的。其方 法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。 将培养好的斜面菌种用无菌种用无菌水 制成高浓度的菌悬液(108～1010/ml)。取 1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘 油浓度约为40%，于-20℃下冻存。
• (2)保护剂
不同种类的保护剂对不同 微生物的作用是不同的，如个别菌种在 脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达 99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时 死亡率大大减少。一般情况下，那些容 易保存的菌种对保护剂的要求不很严格， 而不易保存的菌种对保护剂的要求却很 苛刻。因此，选择好的保护剂是冷冻干 燥保存菌种的关键因素。
(六)真空冷冻干燥法
• 1)菌的质量
保藏的菌种应培养地营 养丰富的最适条件下，使之进入稳定期， 稍老一些的菌体对环境抵抗力强。另处， 作为冷冻干燥的菌悬液细胞浓度要高不 同的菌对冷冻干燥的耐受程度不同，如 果保存的菌液细胞浓度不高，就会使以 后传种造成困难，保存期也会受到影响。
(六)真空冷冻干燥法
(四)干燥保藏
• 微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于
干燥条件下停止生长及处于休眠状态，达 到较长期保藏的目的。此法用于细菌芽孢 或产分生孢子的菌种，是现在发酵工业生 产中较常用的菌种保藏方法。为了转接方 便，控制接种量以及对菌种的保护作用， 通常将菌种的分生孢子、芽孢，甚至菌丝 体吸附于一些载体表面放至干燥容器里进 行常压干燥或真空干燥，所用载体有沙土、 滤纸、硅胶及大(小)米等。
(六)真空冷冻干燥法
• 3.操作方法 • (1)安瓿管准备 选取规格约直径为8mm，
高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%盐 酸浸泡8～10h，再经自来水冲洗多次， 用蒸馏水涮洗2～3次，烘干；在每管内 放入打好菌号及日期的标签，字面朝向 管壁，管口塞好棉塞，灭菌备用。
(六)真空冷冻干燥法
(六)真空冷冻干燥法
(六)真空冷冻干燥法
• (3)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好
的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是 新鲜的。每支长好的斜面加2～3ml保护剂， 用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养 基)，制成菌悬液。如用液体培养的菌种， 则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细 胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。 悬液中菌数要求达到108～1010cfu/ml 为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分 装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部， 装量可依据冷冻干燥机效能而定。
(六)真空冷冻干燥法
• 真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、
除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不 宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细 菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类 微生物都适用，不宜用冻干法保存的微 生物不到2%。冷冻干燥保存的菌种存活 时间长、效果好，一般菌种可保存5年以 上，有的可保藏15年以上不发生变异。 还具有体积小、不易污染、便于运输等 优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏 方法。
• (2)保护剂的选择及制备
冷冻干燥保 藏法使用的保护剂种类很多，列于表2-8， 效果不尽相同，通常采用高分子化合物与 低分子化合物混合使用效果更好。在配制 时注意比例、浓度、PH和灭菌方法。一些 对热敏感的保护剂如血清等用过滤除菌， 牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制灭菌温度。 一般情况下，多数菌种可以用脱脂乳糖等 要控制灭菌温度。一般情况下，多数菌种 可以用脱乳为保护剂。
(六)真表明，慢速干燥比 快速干燥存活率高，如青霉菌6h干燥存 活率为67.3%，而3h为59%。 • (4)空气的影响 冷冻干燥后空气对细菌 细胞影响较大，可导致细胞损伤进而死 亡，故在冻干后应立即在真空下融封， 才有利于长期保存。
(六)真空冷冻干燥法
其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用 的一种简单易行的方法。在作低温保藏时，注意 尽量不损伤细胞。在缓慢冷冻时，胞外基质一般 较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞 水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。如快速 降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本 平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的 损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。与低 温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏 法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平 衡原理而设计的。
(六)真空冷冻干燥法
• (4)预冻 分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在-
30～40℃下冻结20～60min，也可以用干冰和无水 乙醇冻5～10min。 • (5)冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中开始 抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在-30℃以下， 并尽快使真度达到66Pa以下。此后可还渐升温以加 速水分升华，但升温不宜过快，以免引起样品融化。 干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而寂， 以样品最终水分含量达到1%～3%为准。具体操作时 是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空 载时最高真空；样品温度与管外温度接近。干燥 完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封，并用高频 真空检测真空度。
(二)低温定期移植法
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，
定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是 将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭 菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌 体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当 温度下培养，待菌长好后即可放低温保存， 此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年 以上不发生明显变异。
(三)石蜡油低温保藏法
• 具体操作是：菌种为斜面培养菌种，斜
面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置 三角烧瓶中经过121℃高压蒸汽灭菌1～ 2h，将其放烘箱中(160℃左右)干热处理， 去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得 清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上 不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面 顶部约1cm左右为宜。
(二)低温定期移植法
•
斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷， 即容易发生遗传变异；连续传代可使一 些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂 菌。因此，一些贵重菌株及生产优良菌 株不宜用此法保藏。
(三)石蜡油低温保藏法
• 本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖
灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝， 使菌处于生长和代谢停止状态，同时石 蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较 长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求 在-4～4℃下。液体石蜡法适用于不产孢 子的菌种。
第二章 菌种的保藏与复壮
•
菌种衰退的基本原因是变异， 变异是不可避免的，而减缓变异速 度则是可能的。变异速度与菌种所 处的环境有密切的关系，不良环境 条件能促进变异，频繁或过多传代 也是造成衰退变异的重要原因。为 菌种创造良好条件，减缓菌种衰退， 这就是菌种保藏与复壮工作。
第二章 菌种的保藏与复壮
1.沙土管法
2.滤纸保藏法
• 本法是将要要保藏的微生物细胞或孢子吸