菌种保藏及活化
菌种保藏方法及复壮技术
●食用菌栽培●·34·欢迎刊发广告，欢迎种业界商家朋友赞助、协办。
菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
活化与保藏
微生物接种和菌种保藏注意事项下列各方法可根据实验室具体条件与需要选做。
(一) 液体石蜡保藏法1.液体石蜡灭菌在250mL三角烧瓶中装入100mL液体石蜡，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，12l℃湿热灭菌30min，然后于40℃温箱中放置l4d(或置于105～110℃烘箱中lh)，以除去石蜡中的水分，备用。
2.接种培养同斜面传代保藏法。
3.加液体石蜡用无菌滴管吸取液体石蜡以无菌操作加到已长好的菌种斜面上，加入量以高出斜面顶端约1cm为宜。
4.保藏棉塞外包牛皮纸，将试管直立放置于4℃冰箱中保存。
利用这种保藏方法，霉菌、放线菌、有芽孢细菌可保藏2年左右，酵母菌可保藏1～2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。
5.恢复培养用接种环从液体石蜡下挑取少量菌种，在试管壁上轻靠几下，尽量使油滴净，再接种于新鲜培养基中培养。
由于菌体表面粘有液体石蜡，生长较慢且有粘性，故一般须转接2次才能获得良好菌种。
(二) 冷冻干燥保藏法1.准备安瓿管选用内径5mm，长10.5cm的硬质玻璃试管，用10%HCl浸泡8～10h后用自来水冲洗多次，最后用去离子水洗1～2次，烘干，将印有菌名和接种日期的标签放人安瓿管内，有字的一面朝向管壁。
管口加棉塞，121℃灭菌30min。
2.制备脱脂牛奶将脱脂奶粉配成20%乳液，然后分装，121℃灭菌30min，并作无菌试验。
3.准备菌种选用无污染的纯菌种，培养时间，一般细菌为24～48h，酵母菌为3d，放线菌与丝状真菌7～10d。
4.制备菌液及分装吸取3mL无菌牛奶直接加入斜面菌种管中，用接种环轻轻搅动菌落，再用手摇动试管，制成均匀的细胞或孢子悬液。
用无菌长滴管将菌液分装于安瓿管底部，每管装0.2mL。
5.预冻将安瓿管外的棉花剪去并将棉塞向里推至离管口约15mm处(图24—2A)，再通过乳胶管把安瓶管连接于总管的侧管上，总管则通过厚壁橡皮管及三通短管与真空表及干燥瓶、真空泵相连接(图24—1)，并将所有安瓶管浸入装有干冰和95%乙醇的预冷槽中，(此时槽内温度可达-40～-50℃)，只需冷冻1h左右，即可使悬液冻结成固体。
活化菌种的方法
活化菌种的方法菌种是微生物学研究中非常重要的一部分，它们可以用于制备各种发酵产品，如酸奶、酒、酱油等。
但是，菌种经过一段时间的保存后，会出现休眠或死亡的现象，这就需要进行活化处理，使其恢复生命活力。
本文将介绍几种常见的活化菌种的方法。
一、温度法温度法是最常用的活化菌种方法之一。
该方法是将被保存的菌种移至适宜的温度环境下进行培养，使其恢复生命活力。
具体方法是将菌种从冰箱中取出，放置于适宜的温度环境中进行培养。
一般情况下，大多数菌株的培养温度为30℃左右。
二、营养法营养法是通过添加适当的营养成分来活化菌种。
该方法适用于营养成分缺乏、菌种处于休眠状态的情况。
具体方法是将保存的菌种接种到含有适量营养成分的培养基中进行培养。
常用的营养成分包括葡萄糖、酵母粉、胰蛋白胨等。
三、pH法pH法是通过改变培养基的pH值来活化菌种。
该方法适用于菌种处于休眠状态、培养基酸碱度不适宜的情况。
具体方法是将保存的菌种接种到pH值适宜的培养基中进行培养。
一般情况下，大多数菌株的适宜pH值为6.5-7.5。
四、氧气法氧气法是通过调节培养环境氧气含量来活化菌种。
该方法适用于需氧菌株、培养环境氧气含量不足的情况。
具体方法是将保存的菌种接种到含有适量氧气的培养基中进行培养。
常用的氧气供应方式包括摇床培养和搅拌培养。
五、复苏法复苏法是通过多种活化手段的组合来活化菌种。
该方法适用于菌种处于极度休眠状态、多种单一活化手段无法恢复生命活力的情况。
具体方法是将保存的菌种接种到含有多种活化成分的培养基中进行复苏培养。
常用的活化成分包括葡萄糖、酵母粉、胰蛋白胨、氧气等。
总之，活化菌种是菌种保存和利用中的重要环节。
选择合适的活化方法可以使菌种恢复生命活力，保证其在后续的利用中发挥更好的作用。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法
微生物菌种的保藏是非常重要的，因为这些菌种可能用于各种实验和研究中。
以下是一些常见的微生物菌种保藏方法：
1. 冷冻保存：将菌种在液氮或-80的冰箱中冷冻保存。
这是最常见的保藏方法，能够长期保存菌株并保持其遗传稳定性。
2. 干燥保存：将菌种在无菌室中取出，用无菌纸或吸水纸吸干，然后放入无菌瓶中密封保存。
干燥保存适用于某些孢子或芽孢的微生物，比如放线菌、链霉菌等。
3. 明胶斜培养基保存：将菌种接种在含有明胶的固体培养基上，然后密封保存。
这种方法适用于某些菌株，如革兰氏阳性菌和厌氧菌。
4. 低温保存：将菌种保存在4的冰箱中。
这种保存方式可以在短时间内保持菌株的活性，但不能长期保存。
5. 液氮保存：将菌种在锅内预冷冷冻过的无菌玻璃管中加入10%甘油或蔗糖，然后立即在液氮中保存。
这种方法适用于大多数微生物，并且可以长期保存。
保藏菌种的方法
保藏菌种的方法
在微生物研究中，保藏菌种是非常重要的一环。
保藏菌种可以保证菌种的纯度和活力，并且方便长期保存和传递。
以下是一些常见的保藏菌种的方法：
1. 冷冻保藏法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用生理盐水或甘油溶液混合菌体，制成菌悬液，然后用干燥冰或液氮冷冻保存。
2. 真空干燥法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌水将菌体洗净，然后在真空条件下干燥保存。
3. 常温干燥法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌纸片或无菌土壤将菌体均匀涂抹在上面，然后在阴凉通风处晾干保存。
4. 液氮保藏法
将菌株培养在适宜的培养基上，待生长到适当的生长期后，用无菌水将菌体洗净，然后用液氮冷冻保存。
在保藏菌种过程中，需要注意以下几点：
1. 保证菌株的纯度和活力，避免杂菌和死菌的混入。
2. 在保存菌种前，要对菌株进行鉴定和存档。
3. 在保存过程中，要保证温度、湿度、氧气和光照等环境条件
的稳定和适宜。
4. 定期检查保存的菌种，确保其纯度和活力。
综上所述，保藏菌种是微生物研究中不可或缺的一环。
通过选择合适的保藏方法和严格的管理，可以确保菌种的纯度和活力，方便长期保存和传递。
实验室最常用的五种菌种保藏方法
在现代生物学研究和生物技术应用中，菌种保藏是至关重要的环节。
恰当的菌种保藏方法能够确保菌种的活性、遗传稳定性和可用性，为科学研究的持续开展以及相关产业的发展提供坚实的基础。
本文将重点介绍实验室中最常用的五种菌种保藏方法，深入探讨它们各自的特点、适用范围以及操作要点。
一、低温冷冻保藏法低温冷冻保藏法是目前最为广泛应用且效果较为可靠的菌种保藏方法之一。
其基本原理是将菌种置于超低温环境（通常为液氮温度，即-196℃）下，使菌种细胞处于极度冷冻的状态，从而抑制其代谢活动，达到长期保存的目的。
该方法具有诸多显著优点。
低温能够极大地减缓细胞的生理活动，几乎使其处于完全停滞状态，从而有效地延长菌种的存活时间。
低温冷冻保藏对菌种的遗传稳定性影响较小，经过长期保存后，菌种的特性通常能够较好地保持。
操作相对简单，只需将菌种制备成适宜的冷冻保存液，然后置于液氮罐中即可。
在具体操作时，首先要选择合适的冷冻保存液。
常用的冷冻保存液一般含有一定比例的保护剂，如甘油、二甲基亚砜等，它们能够降低细胞内冰晶的形成对细胞的损伤。
制备好冷冻保存液后，将菌种接种到冷冻保存液中，制成菌悬液。
将菌悬液分装到合适的冷冻管中，迅速放入液氮罐中进行保存。
在液氮罐中，要定期检查液氮的液位，确保菌种始终处于适宜的低温环境中。
低温冷冻保藏法适用于大多数微生物菌种的长期保存，尤其对于那些对温度敏感、容易变异的菌种，如细菌中的一些致病菌、真菌中的丝状真菌等，具有良好的保藏效果。
然而，该方法也存在一些不足之处，例如液氮的成本较高，液氮罐的储存空间有限，以及在取出菌种进行复苏时可能存在一定的风险等。
二、干燥保藏法干燥保藏法是利用菌种在干燥环境下代谢活动受到抑制的原理来实现保藏的方法。
常见的干燥保藏法包括沙土管保藏法、滤纸保藏法等。
沙土管保藏法是将菌种接种到无菌的沙土中，然后将沙土管置于干燥器中进行干燥保存。
该方法具有操作简便、成本低廉的特点。
在干燥过程中，菌种细胞内的水分逐渐散失，代谢活动减缓，从而达到保藏的目的。
活化的概念
活化的概念活化的概念是很广范的，以下就活化的概念作一个简单的对菌种活化阐述：菌种活化就是将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，逐级扩大培养是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。
菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境要明白菌种活化的情况就需要了解菌种保藏的方式和方法。
目前国际国内常用的菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃ 冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。
对于不同的保存方式活化的方式也不同：1 定期移植法的菌种复苏较简单，直接转接即可；2 液体石蜡法保存的菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次；3 沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。
或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面；4 真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养；5 -80℃ 冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。
直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。
开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养6 液氮超低温冻结法保存菌种复苏与-80℃ 冰箱冻结法保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。
直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。
开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。
总结一下菌种活化需要以下几个步骤：第一配置菌种适宜生长的培养基第二将菌种从保藏状态恢复到室温状态，比如将冷冻的菌种解冻第三将通过操作将保藏的菌种接种到培养基中培养，此步骤称为菌种复壮第四步挑选培养基茁壮的菌落，挑选其中部分菌落接种到新的培养基中培养，重复此步骤2-3次，从而得到生长良好的菌落经过这四个步骤就到达将菌种从保藏状态活化的目的。
菌种保存与活化
菌种保存与活化（一）培养基保存法利用各种斜面和半固体培养基，加上石蜡油保存菌种，是一种最常用而又简易的保存方法。
1.普通琼脂斜面保存法：肠道杆菌、葡萄球菌等一般细菌可接种于不含糖的普通琼脂斜面上，斜面底部应加少许无糖肉膏汤，以防干涸。
经35℃培养18～24h后，移种于4℃冰箱中，一般可保存一个月，每月传代一次。
2.血液琼脂斜面保存法：链球菌、肺炎链球菌应接种于血液琼脂斜面上，35℃培养生长后，置4℃冰箱中保存，链球菌须半个月至1个月移种一次，肺炎链球菌的新分离菌株须2～4天移种一次，以后逐渐延长移种时间，在适应后可延至半个月移种一次。
3.巧克力色斜面保存法：宜保存脑膜炎奈瑟菌，并在35℃孵箱中保存，一般每2天移种一次。
4.鸡蛋斜面保存法：适于保存含有Vi抗原的沙门菌属及其他含表面抗原的细菌，一般可保存一个月。
5.半固体穿刺保存法：将细菌接种于琼脂半固体或血清琼脂半固体内，经35℃培养18～24h，再以无菌方法加入灭菌的液体石蜡。
高度约lcm，置4℃冰箱保存。
保存时间可达3～6个月。
（二）干燥保存法原理是将细菌体内的水分蒸发掉，使其处于休眠和代谢停滞状态，从而达到长期保存菌种的目的。
菌种干燥后低温保存，可保存数年至十几年医学教|育网搜集整理。
（三）冷冻干燥保存法本法又称冷冻真空干燥法。
它综合利用了各种有利于菌种保存的因素（低温、干燥和缺氧等），是目前最有效的菌种保存方法之一。
用本法保存的菌种具有成活率高，变异性小等优点，保存期一般3～5年，有的可长达10年以上。
菌种保管要求2009-11-16 15:32【大中小】【我要纠错】1.应充分了解每种细菌的不同生物性状及营养要求，以选择适宜的培养基。
一般原则是使细菌能够生长而不易变异的前提下，必须选择营养丰富的培养基，一般不用含糖的培养基。
液体培养基不适于保存菌种。
2.培养后最好在细菌尚未旺盛发育之前取出，放冰箱内保存。
但应注意，一般细菌大多保存于4℃冰箱中，但真菌，霍乱弧菌、铜绿假单胞菌及粪产碱杆菌需在室温保存。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（三）操作步骤：
1、菌株活化: 在无菌操作下 (1). 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之 前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻 触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完 全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央 轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3培养基为止 （I 区）。 (2). 旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未 接种的区域（II 区）。 (3).重复步骤(2)的动作完成 III 区与 IV 区 (4). 灼烧接种环，将接种环归位。 (5)将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。
• 1、活化：把微生物从保藏斜面转接到活化斜面上， 使其活性得以恢复。相对而言活化斜面培养基中的 营养丰富些。
保藏斜面
→
活化斜面
2、复壮：使微生物活性恢复的同时，恢复其优良 的生产性能。 保藏斜面 → 平板分离（自然分离，剔除退化菌种） →活化斜面
六 实验步骤
（一）实验所需物品： • 1.仪器：霉菌培养箱、恒温摇床 • 2.玻璃器皿：50ml三角瓶、9cm培养皿。 • 3试剂：丙三醇（甘油）、胰蛋白胨、 酵母提取物、氯化钠、氨苄青霉素、 卡那霉素。 • 4.其他：移液枪、枪头、1.5ml离心管。
液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
一种良好的菌种保藏方法，首先应保持原菌优良性状长期 稳定，同时还应该考虑方法的通用性、操作的简便性和设备 的普及性。具体的方法很多，现把多种方法按类排列后作一 综合性表解，以便读后有一全面了解。
1、斜面保藏法和穿刺保藏法
（1）斜面保藏法：是一种短期、过渡的保藏法，用新鲜斜面 接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃
图示: A、金属接种环
B、平板划线法
2、菌种保存：在无菌操作下 (1)挑取活化所得的菌板上的单个菌斑培养， 用3ml液体LB培养基（卡那或氨苄抗性） 在7ml离心管内，37度摇床培养过夜。 (2)用移液枪吸取得到的一定浑浊度的菌液 800微升和200微升丙三醇加入1.5ml离心 管中，混匀。-80度保存。
2.沙土管干燥保藏法（略）
3.真空冷冻干燥保藏法
是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低温度 下，（-18℃），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后 在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢 都暂时停止，不易发生变异。一般可保存5~10年左右。
4.液氮保藏法
是适用范围最广的微生物保藏法，其保存期最长。因为液氮的温度 可达-196℃，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（-130℃），
3.注意事项：
(1).用移液枪时枪杆千万不要触碰器皿内壁， 触碰会引起不必要的污染。 (2)吸取液体时千万不要将液体吸入移液枪 内，万一吸入不要将液体再打回器皿内， 应丢弃。更换移液枪或控干移液枪，然 后在使用。 (3)画板时动作要快且轻柔。动作太重会将 培养皿中的培养基划破，不利于菌生长。 动作太慢会有沉降菌进入培养皿中，引 起不必要的污染。
（二）实验准备工作： 1、配制LB培养基（1L） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 10g 固体培养基需加入琼脂粉18g（夏季）或 15g（冬季），高压灭菌，备用。 2、将培养皿、锥形瓶、枪头、离心管等高压 灭菌。 3、氨苄青霉素、卡那霉素过滤除菌分装放在 1.5ml离心管内，—20℃保存。 4、
故此时代谢活动已停止。保藏期一般为2~3年，长的可达9年之久。
5.悬液保藏法（略） 6.低温保藏法
四、菌种保藏的共同注意点
• 1、严格的无菌操作； • 2、用于保存的微生物在生长前必须处于 它生长良好的状态； • 3、保藏过程中要防止退化的发生（不同 的保藏方法，分别有不同的保存时间。）
五、与菌种保藏相关的几个概念
菌种保藏及活化
菌种保藏的原理和方法
一、菌种保藏的目的Leabharlann 保存、不退化二、菌种保藏的原理
DNA复制时自发突变是造成菌种退化的原因，因此要创造代 谢不活泼的状态 。
休眠态（孢子、芽孢）
代谢不活泼的状态
环境（干燥、低温、缺氧、缺营养）
三、菌种保藏的方法
斜面保藏法和穿刺保藏法
沙土管干燥保藏法
真空冷冻干燥保藏法
Thanks
冰箱保存（过低，会结冰；太高，达不到保存目的）。保存期一 般为3~6月。 注意点： （1）水分：用牛皮纸避免水分蒸发，或用橡皮塞 （2）培养基：专门设计的培养基，营养相对不太丰富 （3）微生物状态：孢子或芽孢长好后，再保藏，不易退化
（4）温度：4℃冰箱保存（过低，会结冰；太高，达不到保存目 的）
（2）穿刺保藏法： （略）