DNA的生物合成-复旦大学生物化学PPT课件
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第十章 DNA的生物合成(共65张PPT)
配对
方向 引物
DNA(不对称转录）
NTP RNA聚合酶 mRNA,tRNA,rRNA，小RNA
A-U,T-A,G-C
5’ 3’ 不需要
DNA复制与转录的比较
以DNA为模板
相 遵循碱基配对原则 同 都需依赖DNA的聚合酶 点 聚合过程都是生成磷酸二酯键
新链合成方向为5’→3’
重组修复（recombination repair ）
• 又称复制后修复（ postreplication repair）
• 受损伤的DNA在进行复制时，跳 过损伤部位，在子代DNA链与损 伤相对应部位出现缺口。通过分子 间重组，从完整的母链上将相应的 碱基顺序片段移至子链的缺口处， 然后再用合成的多核苷酸来补上母 链的空缺，此过程即重复修复。并 非完全校正。
structures were observed; no single stranded
DNA is visible.
No complete unwinding of the two
parental strands occurred before the
daughter strands are synthesized
• 当DNA受到大剂量紫外线（波长260nm附近）照射 时，可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合 ，形成二聚体，例如TT二聚体。
2. DNA损伤修复
• 光复活 • 切除修复 • 重组修复 • SOS修复
光复活（photoreactivation）
• 可见光（最有效波长 400nm）激活生物界 广泛分布（高等哺乳 动物除外）的光复活 酶，该酶分解嘧啶二 聚体。
二、DNA的复制
dnaA蛋白与起始点形成复合物，促进其他 dna蛋白也与起始点形成复合物。一旦双螺旋 解开成单链，SSB即结合单链。
《DNA生物合成过程》PPT课件
复制因子A（replication factor A,RF-A)是单链DNA结 合蛋白
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34
ARS
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35
（二）复制的延长
亲代DNA
5
3
3 5
引物
核小体
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3 5
领头链
随从链
3 5
36
完整版课件ppt
37
完整版课件ppt
38
完整版课件ppt
39
完整版课件ppt
行聚合作用。即新进入的 dNTP 与引物 3´－OH形成磷酸二酯键，由5´3´方
向延长子链。
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13
3'
DNA-pol
5'
OH 3'
dCTP
dGTP
dTTP
dATP
模板方向3`→5`
5'
3'
dATP dCTP
dGTP
dTTP
合成需要引物提供3`-OH
合成方向5`→3`
底物是dNTP
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5'
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20
冈崎片段：
• 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射
自显影技术，观察到DNA复制中出现一 些不连续的片段，因而将这些不连续的 片段称为冈崎片段。
• 原核生物的冈崎片段为一至二千个核苷
酸，真核生物约为数百个核苷酸。
完整版课件ppt
21
随从链的合成
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22
目录
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3
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4
2. 复制叉 (replication fork)
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34
ARS
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35
（二）复制的延长
亲代DNA
5
3
3 5
引物
核小体
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3 5
领头链
随从链
3 5
36
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37
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38
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39
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行聚合作用。即新进入的 dNTP 与引物 3´－OH形成磷酸二酯键，由5´3´方
向延长子链。
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13
3'
DNA-pol
5'
OH 3'
dCTP
dGTP
dTTP
dATP
模板方向3`→5`
5'
3'
dATP dCTP
dGTP
dTTP
合成需要引物提供3`-OH
合成方向5`→3`
底物是dNTP
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5'
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20
冈崎片段：
• 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射
自显影技术，观察到DNA复制中出现一 些不连续的片段，因而将这些不连续的 片段称为冈崎片段。
• 原核生物的冈崎片段为一至二千个核苷
酸，真核生物约为数百个核苷酸。
完整版课件ppt
21
随从链的合成
完整版课件ppt
22
目录
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3
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4
2. 复制叉 (replication fork)
《DNA的生物合成》PPT课件
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23
（2）接着danB 和 danC 等蛋白复合物进 入 DNA 的熔解区形成前引物化复合物。
（3）前引物化复合物形成后，导致模板 DNA 双螺旋解链，解螺旋的 DNA部分被 单链结合蛋白结合，保持伸展状态，形成 单链模板。
（4）引物合成：接着，引物酶也结合于 单链模板上开始合成 RNA 引物。
完整版课件ppt
36
（2）暗修复:
暗修复通过三种不同的机理来完成修复：
（1）切除修复（excison repair） （2）重组修复（recombinational repair） （3）SOS 修复（SOS repair）
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37
5' 3'
（1）切除修复
3' 5' 紫外特异核酸 内切酶的切断作用
完整版课件ppt
35
（1）光修复
光修复也称光复活，它是由可见光（300nm400nm）激活 光复活酶 ，该酶能分解胸腺嘧啶二 聚体。
已从细菌和一些动物的细胞中分裂出一种光复 活酶。此酶与DNA形成的复合物以一种尚未了解 的方式吸收光，并利用光能裂解二聚体中的环丁 基的C-C键，以达到复活胸腺嘧啶。哺乳动物和 人体内缺乏此酶。
完整版课件ppt
6
10.2.1 DNA聚合酶
以 DNA 聚合酶I 为代表说明三个酶 的共性:
（1）是一个模板指导酶。 （2）聚合需要引物。 （3）具有水解作用。
完整版课件ppt
7
（1）模板指导酶
即需要打开的 DNA 单链作为模板才能 合成子链。此酶催化的底物：必须是脱氧的 核苷 5’-三磷酸（dATP、dGTP、dTTP和 dCTP）；
只有当所有 4 种脱氧核苷三磷酸以及 DNA 模板存在时，才能实现 DNA 的合成。
DNA的合成 ppt课件
PPT课件
5
传 统 中 心 法 则
PPT课件
6
4. RNA 复制
1965年，科学家在RNA肿瘤病毒中发现了一种
RNA复制酶，它可以对RNA进行复制。
病毒RNA进入宿主细 胞后，还可进行复制， 即在RNA指导的RNA
聚合酶催化进行RNA
合成反应。
PPT课件 7
1970年，科学家在致癌的RNA病毒中发现了逆转录
TTTTGGGGTTTTGGGG…
功能
• 维持染色体的稳定性
• 维持DNA复制的完整性
PPT课件 65
2.端粒酶(telomerase)
结构：
1）是一种逆转录酶，是一种核糖核蛋白。
2）由RNA和蛋白质构成，能识别和结合端粒序列。
3）其中RNA大约有150个核苷酸，富含CxAy，正好
与端粒序列TnGm的单链呈杂交结合状态。
PPT课件 42
(2) DNA-pol Ⅱ（120kD）
• DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活 • 它参与DNA损伤的应急状态修复。
PPT课件
43
(3)DNA-pol
Ⅲ
(250kD)
功能 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。
PPT课件 44
DNA复制的保真性至少要依赖三种机制
PPT课件
66
特点： 1）由RNA和蛋白质构成的复合物 2）为特殊的逆转录酶，能以自身的RNA为模板 逆转录合成端粒DNA
PPT课件
67
端粒酶的功能：解决线性DNA末端隐缩
真核生物染色体DNA采取线性复制方式子链
5 ′末端的一段RNA引物被水解后，留下的空隙。
则由端粒酶爬行式复制填补。
DNA的生物合成复制ppt课件
4．SOS修复
SOS修复: 损伤太大，不能起模板作用时。 特点：碱基配对不严格。 挽救了DNA，但突变频率高。
母链
子链
全保留式
半保留式
混合式
子链继承母链的遗传信息 三种可能的方式
含15NDNA 的母体菌
子一代
子二代
密度梯度 离心结果
15N-DNA母体菌 在含14NH4Cl培养 液中繁殖示意
1958 M.Messelson F.W.Stahl
真核生物的DNA聚合酶
DNA-pol
α
β
分子量（kD） 16.5 4.0
5→3聚合活性 中
？
3→5核酸外切 -
-
酶活性
功能
起始引 低保
发，引 真度
物酶活 的复
性
制
γ
δ
14.0 12.5
高
高
+
+
线粒体 DNA复 制
延长子 链的主 要酶， 解螺旋 酶活性
ε 25.5 高
+
填补引物 空隙，切 除修复， 重组
3´
? | | | | | | | | | | |
3´ T C G A A G T C C T A G C G A C 5´
• 3 5外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。
• 5 3外切酶活性 能切除突变的 DNA片段。
目录
原核生物的DNA聚合酶
分子量(kD) 组成
分子数/细胞 5→3核酸外切酶活性 基因突变后的致死性
大片段/Klenow 片段 604个氨基酸 DNA聚合酶活性
5 核酸外切酶活性
• Klenow片段是实验室合成DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。
(推荐)《DNA的生物合成》PPT
DNA复制时，亲代DNA双螺旋解开成为两 条单链，各自作为模板，按照碱基配对规 律合成一条与模板相互补的新链，形成两 个子代DNA分子。每一个子代DNA分子中 都保留有一条来自亲代的链。这种DNA复 制的方式称为半保留复制。
6
DNA半保留复制的实验证明
含15N-DNA的细菌
培养于普 通培养基
第一代细菌 继续培养于 普通培养基
Mechanism of DNA replication
3’
5’
P
P
C
G
P
P
G
C
P
P
A
T
P
3’
P
OH
P
T
A
P
A
T
P
T
5’ 23
template Primer and the direction of new strand
Mechanism of DNA replication
3’
5’
P
P
C
G
P
P
G
复制叉的解链方向
随从链
冈崎片段
5’
3’ 5’
31
四、复制的保真性
新链的延伸过程严格遵守碱基配对的规律，即 A＝T，G ≡ C 。
DNA聚合酶对碱基的选择能力，能选择与亲代模 板链正确配对的碱基进入子链相应的位置。
校读修正错配碱基，通过DNA聚合酶的3′→5′外 切酶活性，在碱基发生错配时，及时切除并更换 上正确碱基。
46
三、引物酶和引发体(primase, primosome )
引物酶，即Dna G蛋白，催化引物的生成
引发体，由ori C，Dna A、Dna B、Dna C 及Dna G组成 引物为一段短的RNA片段 为什么需要引物？
6
DNA半保留复制的实验证明
含15N-DNA的细菌
培养于普 通培养基
第一代细菌 继续培养于 普通培养基
Mechanism of DNA replication
3’
5’
P
P
C
G
P
P
G
C
P
P
A
T
P
3’
P
OH
P
T
A
P
A
T
P
T
5’ 23
template Primer and the direction of new strand
Mechanism of DNA replication
3’
5’
P
P
C
G
P
P
G
复制叉的解链方向
随从链
冈崎片段
5’
3’ 5’
31
四、复制的保真性
新链的延伸过程严格遵守碱基配对的规律，即 A＝T，G ≡ C 。
DNA聚合酶对碱基的选择能力，能选择与亲代模 板链正确配对的碱基进入子链相应的位置。
校读修正错配碱基，通过DNA聚合酶的3′→5′外 切酶活性，在碱基发生错配时，及时切除并更换 上正确碱基。
46
三、引物酶和引发体(primase, primosome )
引物酶，即Dna G蛋白，催化引物的生成
引发体，由ori C，Dna A、Dna B、Dna C 及Dna G组成 引物为一段短的RNA片段 为什么需要引物？
生物化学课件第十二章 DNA的生物合成
解链方向
随从链 (lagging strand)
5
• 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，
这股链称为领头链。
• 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能 顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称 为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段 (okazaki fragment)。
• 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制
（二）复制的延长
复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以 dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上， 其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。
3' 5'
DNA-pol
OH 3'
5' 3'
dCTP
dGTP
dTTP
dATP
dCTP
dATP
dGTP
dTTP
3
5 3
领头链 (leading strand)
3 5
·· ·TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA
58
66
166
174
201
209
237
245
E.coli复制起始点 oriC
原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向
两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制
叉，称为双向复制。
复制中的放射自显影图象
的半不连续性。
领头链的合成
随从链的合成
阶段一
阶段二
阶段三
阶段四
复 制 过 程 简 图
（三）复制的终止
• 原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制 片段在复制的终止点(ter)处汇合。
ori
第十三章-DNA的生物合成-复制PPT课件
• 引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。
• 在 E. coli 中 ， 含 有 DnaB 蛋 白 、 DnaC 蛋 白 、 引 物 酶 （DnaG蛋白）和DNA复制起始区域的复合结构被称为 引发体（primosome） 。
2021/7/22
17
• 许多与DNA复制直接相关的基因被称为dna基 因；不过也有其他不同的名称。
2021/7/22
动画：DNA replication 5
DNA半保留复制的实验证明
• 1958 年 Meselson 和 Stahl 用同位素示踪和密度梯度离 心的方法证明了DNA的半保 留复制。
• 该实验首先将大肠杆菌在含 15N的培养基中培养约15代， 使其DNA中的碱基氮均转变 为15N。然后将大肠杆菌移至 只含14N的培养基中同步培养 一代、二代。分别提取DNA， 作密度梯度离心，将具有不 同密度的DNA分离开。
2021/7/22
11
4. 单链DNA结合蛋白
• 单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB），是一些能够与单链DNA结合的 蛋白质因子。
• 使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳 定单链DNA，便于其作为模板复制子代DNA；
• 保护单链DNA，避免核酸酶的降解。
2021/7/22
8
1. 模板（template）
DNA复制是模板依赖性 的，必须要以亲代DNA 链作为模板。亲代DNA 的两股链解开后，可分 别作为模板进行复制。
2021/7/22
9
2. 底物（substrate）
• 以四种脱氧核苷三磷酸为底物，即dATP、 dGTP、dCTP、dTTP。
• dNMP和dNTP代表任意一个脱氧核苷酸和脱 氧核苷三磷酸。
• 在 E. coli 中 ， 含 有 DnaB 蛋 白 、 DnaC 蛋 白 、 引 物 酶 （DnaG蛋白）和DNA复制起始区域的复合结构被称为 引发体（primosome） 。
2021/7/22
17
• 许多与DNA复制直接相关的基因被称为dna基 因；不过也有其他不同的名称。
2021/7/22
动画：DNA replication 5
DNA半保留复制的实验证明
• 1958 年 Meselson 和 Stahl 用同位素示踪和密度梯度离 心的方法证明了DNA的半保 留复制。
• 该实验首先将大肠杆菌在含 15N的培养基中培养约15代， 使其DNA中的碱基氮均转变 为15N。然后将大肠杆菌移至 只含14N的培养基中同步培养 一代、二代。分别提取DNA， 作密度梯度离心，将具有不 同密度的DNA分离开。
2021/7/22
11
4. 单链DNA结合蛋白
• 单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB），是一些能够与单链DNA结合的 蛋白质因子。
• 使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳 定单链DNA，便于其作为模板复制子代DNA；
• 保护单链DNA，避免核酸酶的降解。
2021/7/22
8
1. 模板（template）
DNA复制是模板依赖性 的，必须要以亲代DNA 链作为模板。亲代DNA 的两股链解开后，可分 别作为模板进行复制。
2021/7/22
9
2. 底物（substrate）
• 以四种脱氧核苷三磷酸为底物，即dATP、 dGTP、dCTP、dTTP。
• dNMP和dNTP代表任意一个脱氧核苷酸和脱 氧核苷三磷酸。
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The Process of DNA Replication
一、原核生物的DNA生物合成
（一）复制的起始
需要解决两个问题： 1. DNA解开成单链，提供模板。
2. 合成引物，提供3-OH末端。
1. DNA解链
1 13 17 29 32 44 GATTNTTTATTT · · · GATCTNTTNTATT · · · GATCTCTTATTAG · · ·
• 它参与DNA损伤的应急状态修复。
DNA-pol Ⅲ
(250kD)
功能 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。
（二）真核生物的DNA聚合酶
DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。 参与低保真度的复制 。 在线粒体DNA复制中起催化作用。 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。 在复制过程中起校读、修复和填补缺 口的作用。
（二）真核生物的DNA聚合酶
DNA-pol 分子量（kD） 5→3聚合活性 3→5核酸外切 酶活性 功能 α 16.5 中 起始引 发，引 物酶活 性 β 4.0 ？ 低保 真度 的复 制 γ 14.0 高 + δ 12.5 高 + ε 25.5 高 + 填补引物 空隙，切 除修复， 重组
N端
DNA-pol Ⅰ 木瓜蛋白酶
C端
小片段
323个氨基酸 5 核酸外切酶活性
大片段/Klenow 片段
604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 • Klenow片段是实验室合成DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。
DNA-pol Ⅱ（120kD）
• DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。
邻的DNA链连接成一条完整的链。
5’
O
3’
3’
O P OO-
HO
ATP
5’
DNA连接酶
ADP 5’ 3’ 3’
O O P OO-
5’
目录
•功能
• DNA 连接酶在复制中起最后接合缺口的
作用。
• 在 DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺 口作用。 • 也是基因工程的重要工具酶之一。
第三节
DNA生物合成过程
二、DNA聚合酶
全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNAdependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol
活性：1. 53 的聚合活性
2. 核酸外切酶活性
• 核酸外切酶活性
5´
AG C T T C A G G A T A
3´
| | | | | | | | | | |
C. 复制接近终止点(termination, ter)
真核生物每个染色体有多个起始点，是多
复制子的复制。
习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为
一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复
制的功能单位。
5’ 3’
ori
ori
ori
ori
3’ 5’
5’ 3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
复制子
三、复制的半不连续性
复制的方式
——半保留复制(semi-conservative replication) 复制的高保真性(high fidelity)
双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication)
一、半保留复制的实验依据和意义
拓扑异 构酶Ⅱ
切断DNA分子两股链，断端通过 切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA 分子进入负超螺旋状态。
目录
五、DNA连接酶
• DNA连接酶(DNA ligase)作用方式
连接 DNA 链 3-OH 末端和相邻 DNA 链 5-P
末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相
E. Coli 基因图
• 解螺旋酶(helicase) ——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链 解开成为两条单链 • 引物酶(primase) ——复制起始时催化生成RNA引物的酶 • 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) ——在复制中维持模板处于单链状态并保护单 链的完整
含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。
3
5 3
引物
5
引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。
（二）复制的延长
复制的延长指在 DNA-pol 催化下， dNTP 以 dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上， 其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。
3' 5'
母链DNA
复制过程中形成 的复制叉
子代DNA
目录
• 子链继承母链遗传信息的几种可能方式
全保留式
半保留式
混合式
• 密度梯度实验
含重氮-DNA的细菌
培养于普 通培养液
梯度离心结果
第一代
继续培养于 普通培养液
第二代 ——实验结果支持半保留复制的设想。
• 半保留复制的意义
按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA
DNA-pol
OH 3'
5' 3'
dCTP
dGTP
dTTP
dATP
dCTP
dATP
dGTP
dTTP
目录
领头链的合成
目录
随从链的合成
目录
目录
阶段一
阶段二
阶段三
阶段四
复 制 过 程 简 图
目录
复 制 过 程 动 画
（三）复制的终止
• 原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制 片段在复制的终止点(ter)处汇合。
（一）复制的起始
• 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子 复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活 而不是同步起动。 • 复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子 (replication factor, RF)。
• 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。
第 十 章
DNA的生物合成 (复制)
DNA Biosynthesis，Replication
复制(replication)
是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板 合成子链DNA的过程。 复制 亲代DNA
子代DNA
第一节
复制的基本规律
Basic Rules of DNA Replication
DNA-pol I DNA-pol II 分子量(kD) 组成 分子数/细胞 5→3核酸外切酶活性 基因突变后的致死性 109 单肽链 400 有 可能 120 ？ ？ 无 不可能 DNA-pol III 250 多亚基不对称 二聚体 20 无 可能
DNA-pol Ⅰ
（109kD）
功能：对复制中的错误进行校读，对复制和 修复中出现的空隙进行填补。
A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用 其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。
（二）复制的保真性和碱基选择
• DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键） 与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 • 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应 的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。
3
5 3
领头链 (leading strand)
解链方向
随从链 (lagging strand)
5
• 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，
这股链称为领头链。
• 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能 顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称 为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段 (okazaki fragment)。
5 3
串联重复序列 反向重复序列
3 5
· · · TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA
58
66
166
174
201
209
237
245
E.coli复制起始点 oriC
2. 引发体和引物
Dna B、 Dna C Dna A 5 3 DNA拓扑异构酶 SSB 5 3
DNA复制的保真性至少要依赖三种机制
1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。
四、复制中的分子解链及DNA 分子 拓扑学变化
DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把 DNA解成单链，它才能起模板作用。
（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白
3´
?
5´
T C G AA G T C C T A G C G A C
• 3 5外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 • 5 3外切酶活性 能切除突变的 DNA片段。
目录
（一）原核生物的DNA聚合酶
DNA-pol Ⅰ
DNA-pol Ⅱ
DNA-pol Ⅲ
（一）原核生物的DNA聚合酶
• 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制
的半不连续性。
第二节 DNA复制的酶学
The Enzymology of DNA Replication
•参与DNA复制的物质
底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol
一、原核生物的DNA生物合成
（一）复制的起始
需要解决两个问题： 1. DNA解开成单链，提供模板。
2. 合成引物，提供3-OH末端。
1. DNA解链
1 13 17 29 32 44 GATTNTTTATTT · · · GATCTNTTNTATT · · · GATCTCTTATTAG · · ·
• 它参与DNA损伤的应急状态修复。
DNA-pol Ⅲ
(250kD)
功能 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。
（二）真核生物的DNA聚合酶
DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。 参与低保真度的复制 。 在线粒体DNA复制中起催化作用。 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。 在复制过程中起校读、修复和填补缺 口的作用。
（二）真核生物的DNA聚合酶
DNA-pol 分子量（kD） 5→3聚合活性 3→5核酸外切 酶活性 功能 α 16.5 中 起始引 发，引 物酶活 性 β 4.0 ？ 低保 真度 的复 制 γ 14.0 高 + δ 12.5 高 + ε 25.5 高 + 填补引物 空隙，切 除修复， 重组
N端
DNA-pol Ⅰ 木瓜蛋白酶
C端
小片段
323个氨基酸 5 核酸外切酶活性
大片段/Klenow 片段
604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 • Klenow片段是实验室合成DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。
DNA-pol Ⅱ（120kD）
• DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。
邻的DNA链连接成一条完整的链。
5’
O
3’
3’
O P OO-
HO
ATP
5’
DNA连接酶
ADP 5’ 3’ 3’
O O P OO-
5’
目录
•功能
• DNA 连接酶在复制中起最后接合缺口的
作用。
• 在 DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺 口作用。 • 也是基因工程的重要工具酶之一。
第三节
DNA生物合成过程
二、DNA聚合酶
全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNAdependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol
活性：1. 53 的聚合活性
2. 核酸外切酶活性
• 核酸外切酶活性
5´
AG C T T C A G G A T A
3´
| | | | | | | | | | |
C. 复制接近终止点(termination, ter)
真核生物每个染色体有多个起始点，是多
复制子的复制。
习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为
一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复
制的功能单位。
5’ 3’
ori
ori
ori
ori
3’ 5’
5’ 3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
复制子
三、复制的半不连续性
复制的方式
——半保留复制(semi-conservative replication) 复制的高保真性(high fidelity)
双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication)
一、半保留复制的实验依据和意义
拓扑异 构酶Ⅱ
切断DNA分子两股链，断端通过 切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA 分子进入负超螺旋状态。
目录
五、DNA连接酶
• DNA连接酶(DNA ligase)作用方式
连接 DNA 链 3-OH 末端和相邻 DNA 链 5-P
末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相
E. Coli 基因图
• 解螺旋酶(helicase) ——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链 解开成为两条单链 • 引物酶(primase) ——复制起始时催化生成RNA引物的酶 • 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) ——在复制中维持模板处于单链状态并保护单 链的完整
含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。
3
5 3
引物
5
引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。
（二）复制的延长
复制的延长指在 DNA-pol 催化下， dNTP 以 dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上， 其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。
3' 5'
母链DNA
复制过程中形成 的复制叉
子代DNA
目录
• 子链继承母链遗传信息的几种可能方式
全保留式
半保留式
混合式
• 密度梯度实验
含重氮-DNA的细菌
培养于普 通培养液
梯度离心结果
第一代
继续培养于 普通培养液
第二代 ——实验结果支持半保留复制的设想。
• 半保留复制的意义
按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA
DNA-pol
OH 3'
5' 3'
dCTP
dGTP
dTTP
dATP
dCTP
dATP
dGTP
dTTP
目录
领头链的合成
目录
随从链的合成
目录
目录
阶段一
阶段二
阶段三
阶段四
复 制 过 程 简 图
目录
复 制 过 程 动 画
（三）复制的终止
• 原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制 片段在复制的终止点(ter)处汇合。
（一）复制的起始
• 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子 复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活 而不是同步起动。 • 复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子 (replication factor, RF)。
• 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。
第 十 章
DNA的生物合成 (复制)
DNA Biosynthesis，Replication
复制(replication)
是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板 合成子链DNA的过程。 复制 亲代DNA
子代DNA
第一节
复制的基本规律
Basic Rules of DNA Replication
DNA-pol I DNA-pol II 分子量(kD) 组成 分子数/细胞 5→3核酸外切酶活性 基因突变后的致死性 109 单肽链 400 有 可能 120 ？ ？ 无 不可能 DNA-pol III 250 多亚基不对称 二聚体 20 无 可能
DNA-pol Ⅰ
（109kD）
功能：对复制中的错误进行校读，对复制和 修复中出现的空隙进行填补。
A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用 其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。
（二）复制的保真性和碱基选择
• DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键） 与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 • 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应 的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。
3
5 3
领头链 (leading strand)
解链方向
随从链 (lagging strand)
5
• 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，
这股链称为领头链。
• 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能 顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称 为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段 (okazaki fragment)。
5 3
串联重复序列 反向重复序列
3 5
· · · TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA
58
66
166
174
201
209
237
245
E.coli复制起始点 oriC
2. 引发体和引物
Dna B、 Dna C Dna A 5 3 DNA拓扑异构酶 SSB 5 3
DNA复制的保真性至少要依赖三种机制
1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。
四、复制中的分子解链及DNA 分子 拓扑学变化
DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把 DNA解成单链，它才能起模板作用。
（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白
3´
?
5´
T C G AA G T C C T A G C G A C
• 3 5外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 • 5 3外切酶活性 能切除突变的 DNA片段。
目录
（一）原核生物的DNA聚合酶
DNA-pol Ⅰ
DNA-pol Ⅱ
DNA-pol Ⅲ
（一）原核生物的DNA聚合酶
• 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制
的半不连续性。
第二节 DNA复制的酶学
The Enzymology of DNA Replication
•参与DNA复制的物质
底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol