WB实验步骤详细总结

WB实验步骤详细总结

蛋白提取（所有操作在冰上进行）

1.裂解

1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF 在-20℃保存，提前一天4℃解冻）

取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀

2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液体与组织比例为20：1），冰上静置10min

2.匀浆

先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）

在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min

3.离心（在基础4楼416室）

1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）

2)将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min 离心15min

3)用移液枪将上层清液取出放入①②号管中

4.变性（上样缓冲液：样品=4：1）

将样品转移至2~3个0.5mlAP管中

加上样缓冲液，100℃变性10min

仪器屏幕：

S5 00：10

S5 100．0 00：10

温度时间（时：

5.保存

变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用

WB实验步骤

1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

2.配制分离胶

1)准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头）

2)10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）

5.91ml 超纯水

4.95ml 丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效

3.75ml Ph8.8Tris▪HCL

10%SDS

150μl

AP（催化剂促凝作用）

150μl

TEMED

9μl

3.灌胶

沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml 移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止4.水封

立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min

5.浓缩胶的配制（5%）

4.13ml 超纯水

1ml 丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效

Ph6.8 Tris▪HCL

750μl

10%SDS

60μl

AP（催化剂促凝作用）

60μl

TEMED

6μl

6.电泳（电泳液最多使用两次）

1)安装电泳装置

低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔出防止拔歪）

2)点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）

Mark 4μl（Protern ladder）推荐9μ，实际4μ已经足

够

样品8μl 7-10μl均可内参挑齐即可

3)连接电泳仪

电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳

先调电压至70mV，跑约20min。（Mark跑开，分出彩带即可）

再调电压至120mV，跑约60min。（不能跑过下面的玻璃板）

注：Mark的条带从红色条带往下依次为：70→55→40→35→20，待测蛋白的分子量再哪一区域就在哪一段剪。用绿色的切板切割待测区域，边缘留点空余，以防止切到条带。放入装有转移液的皿中浸泡

7.转膜（转移液可用3-4次）

1)剪四层滤纸（大小与膜相，近可大不可小）浸入转移液皿中。然后再讲其剪成与胶一致大小（胶始终

保持湿润）

2)剪PVDF膜（用上述滤纸，勿用手直接接触PVDF膜），然后用甲醇活化10s以上

3)“夹三明治”再大塑料盆中加入少量转移液，将夹板、海绵、滤纸、膜均放入浸泡，夹板黑板在下、

两层滤纸→胶→膜→两层滤纸（胶的大分子量条带在上方，即在右上方）

4)安装转膜装置：黑板对黑板，电极黑对黑，红对红。加入转膜液至满（否则仪器无法启动）

5)打开开关，调节电流至100mA，转膜2h（恒流）盆中加满冰

转膜成功标志：胶上的条带均转移的膜上，胶呈无色

8.封闭

1)配制5%脱脂奶粉：

2.5g脱脂奶粉

50mlTBST

2)将膜取出放入上述加入了5%脱脂奶粉中的皿中常温慢摇60min（转移液回收其余清理掉，转移液

可以重复利用2次）

9.一抗

1)用TBST配，每一格加5ml TBST，再分别加入抗体

抗体的量：

2l（Psmad2l）免抗1:1000 5μl：5ml 58（分子量）

2l（Psmad2l）免抗1:500 10μl：5ml 58

Jnk免抗1:1000 5μl：5ml 双带

内参（小鼠抗GAPH）单抗，中杉金桥

1:5000 1μl：5ml 36 小烧杯中混匀加入皿中

2) 膜上用圆珠笔标记，分别放入小格中（正面朝上） 3) 4℃冰箱中，慢摇过夜（正面朝上，摇床416室） 10. 洗脱

用TBST 在皿中洗脱，摇床10min 每次，洗三次。 11. 二抗

1) 用3%的脱脂奶粉

1.5g 的脱脂奶粉

50mlTBST

2) 每格吸入5ml 3%脱脂奶粉，抗体与奶粉比例均为1:5000，即加入1μl

注意：吸入微升时，一定要检查是否吸到液体，一抗用鼠抗则二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用免抗

3) 膜分别加入小格，慢摇1-2h （常温） 12. 洗脱

用TBST 在皿中洗脱，摇床10min 每次，洗三次。 13. 显影：

U 盘

A 液，

B 液（显影液。4℃保存） 200μl 枪+枪头（黄） 膜（置于皿中）

1) 开机后自动预冷，温度降到1-20℃才可 2) 显影液现配现用（A 液：B 液=1：1）

3)

膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液枪吧显影液均

匀涂在膜上

小烧杯中混匀加入皿中

所需