电子显微镜技术研究进展
种子活力无损检测方法研究进展
种子活力无损检测方法研究进展1.电子显微镜技术电子显微镜技术是一种利用电子显微镜对种子细胞超微结构与形态的分析方法。
通过电子显微镜分析种子形态结构、种皮形态、胚乳储藏物质、胚乳细胞和胚珠细胞等结构，可以对种子的活力和品质进行初步评价。
电子显微镜技术的优点是观察到了种子微观结构，信息量大，但该技术需要显微镜专业人员操作，并且必须侵入种子内部，有一定破坏性。
2.红外线成像技术红外线成像技术是一种利用可见光、近红外和远红外光，通过非接触实时地捕捉并形成图像的技术。
通过红外线成像技术能够在不破坏种子的情况下，实时捕捉种子内部的温度分布情况，从而推断种子的含水量、代谢活性等信息，并且可以进行大规模的检测。
该技术准确度高，不会破坏种子，而且可以分析不同灌溉水量对种子的影响等，因此具有较大的应用前景。
3.近红外光谱技术近红外光谱技术利用近红外光谱仪对种子的近红外光谱进行分析，并依据比较简单的数据处理和统计学分析技术，得到种子品质的评价结果，比如含水量、脂肪、蛋白质等成分含量。
该技术的优点是简单、自动化程度高，而且可以快速实现对大批量种子的检测，有着广泛的应用前景。
4.核磁共振技术核磁共振技术是一种复杂的物理检测方法，可以用于测试种子的水分、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、维生素和酶等成分的含量和组成。
这种非常敏感的技术可以精确、无损地检测各种种子的营养含量和品质水平，但是这种检测方法价格昂贵，设备维护和操作人员培训成本也非常高。
总的来说，种子活力无损检测技术在种子产业中具有重要的应用价值，不仅可以为种子生产商提供准确有效的种子活力评估，而且可以为消费者提供保证。
虽然各种检测方法各有优缺点，但是随着技术的不断发展，种子活力无损检测技术在未来将会得到更加广泛的应用。
现代电子显微镜技术在病毒检测中的应用进展
西藏医药2021年第42卷第2期（总155期）142明益气活血汤可降低患者心衰、死亡等的风险。
观察两组患者治疗前后心功能指标发现，治疗后治疗组患者的心功能改善情况较好，提示益气活血汤可改善患者的心脏收缩舒张功能，而两组治疗后LVEDd 水平未见明显差异，表明合用益气活血汤未缩小舒张末心脏内径，可能与观察的时间较短有关。
综上所述，气阴两虚AMI 患者冠脉介入术后采用西药联合益气活血汤治疗的效果较好，可改善患者心功能，可能与降低氨基末端脑钠肽前体、脂蛋白相关磷脂酶A2水平有关。
【参考文献】[1]门长英. 自拟益气活血利水汤治疗气阴两虚型冠心病慢性心力衰竭53例临床观察[J]. 中外医疗, 2012, 031(013):127-127.[2]李俊龙, 金政, 皮健彬,等. 益心活血丸对气阴两虚证急性ST 段抬高型心肌梗死经皮冠状动脉介入术后患者临床疗效及心功能的影响[J]. 中医杂志, 2019,60(11):949-953.[3]陈菊明, 韩平. 自拟保生汤辅助治疗气阴两虚急性心肌梗死疗效观察[J]. 四川中医, 2019,13(8):78-80.[4]吕静静. 益气通痹汤联合替罗非班对急性心肌梗死患者PCI 术后心肌保护的作用观察[J]. 中国合理用药探索, 2019,16(7):63-65.[5]王创国, 贾高鹏. 早期应用低分子肝素在急性心肌梗死患者溶栓治疗中的效果及对心功能的影响[J]. 临床医学研究与实践, 2019,5(16):40-42.[6]姚丽, 张剑波, 李永星,等. 重组人B 型钠尿肽对急性心肌梗死后心力衰竭患者心功能及心率变异性的影响[J]. 中国中西医结合急救杂志, 2019,26(1):50-53.[7]马晶, 张瀛月, 李海燕,等. 融合心脏康复治疗对心肌梗死患者心肺运动功能和心理状态的影响[J]. 中华老年多器官疾病杂志, 2019,18(10):721-725.[8]向芳. 救心汤对心肌梗死后心功能3级及以上患者脑钠肽的临床疗效[J]. 世界临床医学, 2017, 11(12):74,77.[9]罗子幸, 王文会, 贺青军,等. 参七益气活血汤治疗心肌梗死的临床效果及对生活质量的影响[J]. 中国现代医生, 2019,57(20):133-135,139.[10]陈雪云. 西医联合黄芪保心汤治疗扩张型心肌病心力衰竭对患者心功能及神经内分泌因子的影响分析[J]. 中医临床研究, 2019,11(20):26-28.[11]王群. 心脉隆注射液联合左西孟旦对急性心肌梗死后心力衰竭老年患者的疗效及炎症因子分析[J]. 世界复合医学, 2019,15(7):10-12.本文责任编辑 王聚乐●讲座·综述●现代电子显微镜技术在病毒检测中的应用进展丁巳娟 韩起 陈生林 冯东方西藏军区总医院 西藏拉萨 850000摘要 电子显微镜应用于病毒研究的历史悠久，为许多人类重大传染病致病因子的发现做出了重要的贡献。
电子显微镜研究纳米材料的原子结构
电子显微镜研究纳米材料的原子结构纳米材料是当今科技领域的热门研究方向之一，其具有独特的物理和化学性质，广泛应用于能源、材料、生物医学等领域。
而要深入了解纳米材料的性质和行为，需要通过先进的仪器设备进行观察和分析。
其中，电子显微镜作为一种重要的研究工具，为我们揭示了纳米材料的原子结构。
电子显微镜是一种利用电子束来观察物体的显微镜。
与传统光学显微镜不同，电子显微镜使用的是电子束而不是光束，因此具有更高的分辨率和更大的深度。
在纳米材料研究中，电子显微镜能够观察到纳米尺度下的原子结构和表面形貌，为我们提供了宝贵的信息。
在电子显微镜中，电子束通过准直系统聚焦到纳米材料样品上。
样品与电子束的相互作用会产生多种信号，包括透射电子显微镜（TEM）中的透射电子和散射电子，以及扫描电子显微镜（SEM）中的二次电子和反射电子。
这些信号通过相应的探测器捕获并转换成图像，从而形成我们所看到的纳米材料图像。
透射电子显微镜是研究纳米材料原子结构的重要工具。
通过透射电子显微镜，我们可以观察到纳米材料的晶体结构和晶格缺陷。
透射电子显微镜中的电子束穿过样品，与样品中的原子发生相互作用，产生透射电子。
透射电子的强度和散射方向与样品中的原子排列和晶格性质有关。
通过对透射电子的分析，我们可以确定纳米材料的晶体结构和晶格参数。
扫描电子显微镜则主要用于观察纳米材料的表面形貌和形态。
扫描电子显微镜中的电子束在样品表面扫描，并与样品表面的原子和分子相互作用。
这种相互作用会产生二次电子和反射电子。
通过捕获并分析这些信号，我们可以获得纳米材料表面的形貌信息。
扫描电子显微镜具有较高的分辨率和较大的深度，能够观察到纳米材料的细节和表面形貌的变化。
除了透射电子显微镜和扫描电子显微镜，还有许多其他类型的电子显微镜用于研究纳米材料的原子结构。
例如，场发射电子显微镜（FESEM）能够观察到纳米材料的表面形貌和形态，同时还可以进行能谱分析和成分分析。
透射电子能谱仪（EDS）和电子能量损失谱仪（EELS）则可以用来分析纳米材料的元素组成和化学性质。
超高分辨率显微镜技术的研究及应用
超高分辨率显微镜技术的研究及应用近年来，随着科技的不断发展，人类对于微观世界的探索也越来越深入。
而超高分辨率显微镜技术的发展更是为我们揭开了微观世界的神秘面纱，使得我们能够更加深入地研究原子、分子和纳米级别的物质结构和性质。
本文将介绍超高分辨率显微镜技术的基本原理、研究进展以及应用领域等方面的内容。
一、基本原理超高分辨率显微镜技术是一种基于电子束、离子束、探针等方法，利用物质与射线相互作用而获得样品局部结构和性质信息的技术。
其中，电子束显微镜是最为常见和先进的超高分辨率显微镜技术之一。
其基本原理是利用高能电子穿透固体样品时所发生的散射和透射现象，通过对透射电子的成像和分析，可以得到样品的组成、结构和性质信息。
由于电子束波长远远小于光学波长，因此电子显微镜比光学显微镜具有更高的空间分辨率，目前已经达到了亚埃级别。
二、研究进展随着材料科学、生物科学、纳米科学等领域的不断发展，超高分辨率显微镜技术也得到了迅猛的发展。
其中，场发射扫描电镜（FESEM）、透射电镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）等技术已经广泛应用于材料、生物、能源等领域，成为了研究和开发新材料、新能源、新药物等的重要手段。
在材料科学领域，超高分辨率显微镜技术广泛应用于材料表面形貌、界面结构、晶体缺陷、成分分析等方面的研究。
通过电子束显微镜等技术，研究人员可以观察到许多微观结构特征，如纳米粒子的分布、晶格缺陷、电子束诱导的化学反应等，从而掌握更多有关材料微观结构和性质的信息，为材料的合成、加工和应用提供了重要的参考。
在生物科学领域，超高分辨率显微镜技术广泛应用于细胞、分子等微观结构的研究。
通过电子束显微镜等技术，研究者可以观察到许多细胞、分子等微观结构的构成和形态，如蛋白质、RNA、DNA等。
这些信息对于生物科学研究中的分子生物学、细胞学、生物物理学等领域都有着重要的意义，有助于人们深入研究生命现象的本质和机理，进一步揭示生物系统的运作原理。
冷冻电镜——精选推荐
冷冻电镜研究进展冷冻电⼦显微镜技术（cryoelectron microscopy）是从20世纪70年代提出的，经过近10年的努⼒，在80年代趋于成熟。
它的研究对象⾮常⼴泛，包括病毒、膜蛋⽩、肌丝、蛋⽩质核苷酸复合体、亚细胞器等等。
⼀⽅⾯，冷冻电⼦显微镜技术所研究的⽣物样品既可以是具有⼆维晶体结构的，也可以是⾮晶体的；⽽且对于样品的分⼦量没有限制。
因此，⼤⼤突破了X-射线晶体学只能研究三维晶体样品和核磁共振波谱学只能研究⼩分⼦量（⼩于100KDa）样品的限制。
另⼀⽅⾯，⽣物样品是通过快速冷冻的⽅法进⾏固定的，克服了因化学固定、染⾊、⾦属镀膜等过程对样品构象的影响，更加接近样品的⽣活状态。
21世纪初，冷冻电⼦显微镜都具备⾃动图像采集系统。
CCD(charged-couple device)照相机能快速、动态的记录电⼦衍射图，但由于像素的限制，其分辨率不如照相胶⽚。
CCD和照相胶⽚所记录的是⽣物样品空间结构的⼆维投影，利⽤各种计算机软件程序包，可以从电镜的⼆维图像重构样品的三维结构，即三维重构。
已开发出许多软件程序包可供计算机处理使⽤，⼤⼤⽅便了⽣物样品的结构重构。
[1]操作步骤样品准备⽤于冷冻电镜研究的⽣物⼤分⼦样品必须⾮常纯净。
⽣物样品是在⾼真空的条件下成像的，所以样品的制备既要能够保持本⾝的结构，⼜能抗脱⽔、电⼦辐射。
⼀种⽅法是通过快速冷冻使含⽔样品中的⽔处于玻璃态，也就是在亲⽔的⽀持膜上将含⽔样品包埋在⼀层较样品略⾼的薄冰内。
该⽅法有两个关键步骤：⼀是将样品在载⽹上形成⼀薄层⽔膜；⼆是将第⼀步获得的含⽔薄膜样品快速冷冻。
在多数情况下，⽤⼿⼯将载⽹迅速浸⼊液氮内可使⽔冷冻成为玻璃态。
其优点在于将样品保持在接近“⽣活”状态，不会因脱⽔⽽变形；减少辐射损伤；⽽且通过快速冷冻捕捉不同状态下的分⼦结构信息，了解分⼦功能循环中的构象变化。
另⼀种⽅法是通过喷雾冷冻装置（spray-freezing equipment），利⽤结合底物混合冰冻技术 (spray-freezing)，可以把两种溶液（如受体和配体）在极短的时间内混合起来 (ms量级)，然后快速冷冻，将其固定在某种反应中间状态，这样能对⽣物⼤分⼦在结合底物时或其他⽣化反应中的快速的结构变化进⾏测定，深⼊了解⽣物⼤分⼦的功能。
超高分辨率电子显微镜技术的研究前沿
超高分辨率电子显微镜技术的研究前沿超高分辨率电子显微镜技术是当今材料科学和生物医学研究领域中最受欢迎的分析方法之一。
该技术的原理是通过使用高能电子束来探测样本结构的微观特征。
近年来，随着电子显微镜技术的不断发展，超高分辨率电子显微镜技术的研究前沿也逐渐展现出来。
1. 透射电子显微镜技术（TEM）的发展透射电子显微镜是一种能够在原子尺度下探测三维宏观结构的重要工具。
这种技术最早于1930年代被发明，近年来随着电子束的能量、空间分辨率和信噪比的提高，透射电子显微镜技术的研究取得了很大的进展。
最近，科学家们利用透射电子显微镜技术研究了金属纳米颗粒的结构和动力学。
他们发现，通过在纳米颗粒中引入杂质，可以显着增强金属纳米颗粒的催化活性。
此外，透射电子显微镜技术还被广泛应用于生物医学领域，如分析细胞膜蛋白结构的变化以及病毒与细胞相互作用的研究。
随着技术的进步，电子显微镜早已不只是研究小分子和物质的工具，而是在许多领域成为研究的重要手段。
2. 原子力显微镜（AFM）的进展原子力显微镜是一种可以在原子尺度下观察到样品表面形貌和表面力学性质的仪器。
随着技术的成熟，原子力显微镜已经成为研究新型材料的重要工具之一。
例如，人们利用原子力显微镜研究了具有重大科学应用价值的二维纳米材料，例如石墨烯。
通过使用原子力显微镜技术，他们成功地观察到了单层石墨烯的原子结构，同时还研究了石墨烯的电传输特性。
此外，原子力显微镜还被广泛应用于生物医学研究中，例如研究蛋白质和DNA的结构。
3. 光电子能谱显微镜（PEEM）的应用光电子能谱显微镜是一种可见光或紫外线光照射样品后，测量样品电子发射能谱图的仪器。
这种技术最初被广泛用于材料科学和表面化学领域，但是随着技术的发展，它已经逐渐应用于生物体系与材料界面的研究中。
PEEM技术被广泛应用于生物体系研究，例如研究细胞膜蛋白和生物分子的表面电荷分布，以及在细胞内探测特定物质的空间分布和组织学变化。
电子显微技术的新进展
电子显微技术的新进展电子显微技术一直是科学研究领域中不可或缺的工具。
它们能够扩大我们的视野，让我们看见微观世界中更为复杂、微小的结构，进而深入了解各种物质和现象。
随着科学技术的发展，电子显微技术也在不断地演进，开发出了一些全新的技术，可以突破现有的瓶颈、解决若干难题。
一、单分子成像单分子成像是一种新的显微技术，它可以在分子级别直接观察分子的结构、结构变化和相互作用。
通过这种技术，研究者可以更加深入地研究分子之间的交互和生化反应，可以更好地了解生命科学和物质科学。
这种技术的原理是通过使用荧光标记、掺杂、测量等手段，将分子显微成像。
随着技术的发展，研究者已经能够通过单分子成像，成功的观察到多种生化物质的动态行为。
例如，可以在真核细胞膜下面观察到不同的蛋白质轮廓，以及精细的亚细胞结构变化。
二、高分辨扫描透射电子显微镜随着电子显微技术的发展，透射电子显微术（TEM）已成为当今最常见、最常用的分析方法之一。
但是TEM的分辨率仍然受到一些限制，例如电子衍射和成像位置的控制等。
近年来，研究者在TEM技术中开发出一种新技术——高分辨扫描透射电子显微镜（HRSTEM）。
HRSTEM基于高通量的电子源，利用电子散射模型和成像技术，实现了精确的原子分辨率成像。
HRSTEM可以观察到一些分子和纳米材料中的具体结构，如氧化物纳米管、金、银、铂纳米径粒等。
三、单纳米热成像随着新型纳米材料的研究越来越深入，近年来也出现了一些新的电子显微技术，可以帮助我们更好地了解这些材料的物理性质。
其中之一就是单纳米热成像技术。
这种技术利用扫描探针显微镜（SPM）中的纳米热成像技术，开发出了可以在膜、纤维、芯片等表面上观察材料到纳米级别的详细热传导的技术。
这种技术的分辨率较高，可以达到70纳米，在物理、材料科学等领域中具有广泛应用价值。
总结电子显微技术的演变已经带来了许多新的契机和机遇。
通过这些新技术，科学家们可以更加精确地观察、分析物质和现象，进而发现新的规律、发展新的科学或材料。
电子显微镜技术在羊口疮病毒研究中的应用进展
电子显微镜技术在羊口疮病毒研究中的应用进展陈元翠;张益;鲜思美;李鹏飞;钱林;张友【摘要】电子显微镜技术是一种可以用来观察病毒粒子形态、大小、结构等特征的技术.通过直接从感染组织、分泌液,或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作电子显微镜检查观察病毒粒子,根据病毒粒子的结构特征判断病原体,从而作出诊断,此外还可以观察病毒感染细胞的动态过程(形态发生过程).羊口疮病毒属于痘病毒科、副痘病毒属的成员,为有囊膜线性双股DNA病毒,病毒粒子呈砖形或椭圆形的线团样,病毒粒子表面呈特征性的管状条索斜形交叉,呈编织样外观.文章就电子显微镜的特点及使用电子显微镜观察羊口疮病毒的研究进展进行综述.【期刊名称】《贵州畜牧兽医》【年(卷),期】2018(042)002【总页数】6页(P30-35)【关键词】电子显微镜;羊口疮病毒;研究进展【作者】陈元翠;张益;鲜思美;李鹏飞;钱林;张友【作者单位】贵州大学动物科学学院,贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳 550025;贵州省动物疫病研究室,贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳 550025;贵州省动物疫病研究室,贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳 550025;贵州省动物疫病研究室,贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳 550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳 550025【正文语种】中文【中图分类】S852.651932年德国科学家Max Knoll和Ernst Ruska在电子光学发展的基础上发明了第1台电子显微镜(Electron Microscope，EM)(以下简称电镜)，1942年英国人M.Mullah发明了扫描电镜。
病毒是目前人类所知结构最为简单的生命基本单位，具有复杂的变异及进化过程、特定的结构特征和形态发生过程。
电镜对于人类发现和认识病毒产生了巨大作用，它赋予了人类对病毒超微结构特征以及形态发生的可视性[1，2]，这些作用对于未知病原体的诊断具有重大的意义。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
电子显微镜在植物病毒研究中的应用摘要：电子显微镜技术是目前植物病毒研究领域的一项重要技术，本文主要介绍了电子显微镜技术在植物病毒研究领域中的三个主要应用:负染色技术，超薄切片技术和免疫电镜技术，进一步说明了电子显微镜技术对于植物病毒研究的重要意义。
关键词：电子显微镜技术植物病毒负染色超薄切片免疫电镜纳米技术已成为现代科学的重要领域，而电子显微镜则是其必备的研究手段。
现代电镜的放大倍率已超过1000000 创倍。
其分辨能力已达到原子水平。
点分辨率小于3埃，线分辨率小于1.4埃。
较小的原子大小正好约3埃。
电镜的应用，为科学阐明包括病毒在内的，从低等动植物直至人类的有机与无机物质深处隐藏着的极有规则的分子水平的结构提供了依据。
它是目前将人的视力深入到微观世界里去的唯一工具。
植物病毒是具有遗传性和特异性的极微小的生命物质。
它侵染寄主并在寄主细胞内增殖，使寄主表现出病症，影响其正常生长发育，导致农作物受害减产。
因此，深入研究其特征特性和致病机理非常重要。
上世纪末，人们开始了解比细菌还小的病毒，本世纪30 年代后期，发明了电镜，才第一次直接观察到了病毒颗粒形态。
1939年，德国科学家Kuashce首次用简易电镜拍下了烟草花叶病毒(TMV)粒子的照片。
目前，电镜技术已成为病毒诊断，鉴定及其致病机制研究中通用的方法，不仅在原有金属投影方法的基础上发展了负染色技术和超薄切片技术，而且与血清学技术相结合发展了免疫电镜技术与同位素技术相结合，发展了放射自显影技术[l ,2]。
本文就植物病毒研究中常用的电镜技术作一简介。
1 负染色技术负染色又称阴性染色，是相对于普通染色(称正染色)而言的。
负染色首先由Hall在1955年提出。
Hall在病毒研究中用磷钨酸染色后，发现图像的背景很暗，而病毒象一个亮晶的"空洞"被清楚地显示出来。
在超薄切片的染色中，染色后的样品电子密度因染色而被加强，在图像中呈现黑色。
而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。
而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)"包埋"低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像"透明"地光亮。
两者之间的反差正好相反，故称为负染色。
对于负染色的机制目前还不十分了解。
对颗粒状的生物材料的研究而言，负染色技术与超薄切片方法相比具有分辨率高，简单快速等优点。
因此，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。
它可以显示生物大分子、细菌、病毒、分离的细胞器以及蛋白质晶体等样品的形状、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中，负染色技术成为不可取代的实验技术负染色是当代电镜生物样品制作中的一项应用普遍, 效率较高而又比较简便的技术, 它通过加强样品外围密度而使生物样品显示出负的反差。
用以增加反差的是称之为染液的重金属盐类溶液,如磷钨酸醋酸铀、铂酸铁等, 它们在生物样品外围形成均质的电子不透明环境。
负染色技术早在50 年代即应用于生物大分子的研究, 后被改良成常规方法, 广泛应用于病毒结构的研究, 对病毒学的发展起到了相当大的推动作用。
它不仅是病毒结构研究必不可少的优良方法, 而且已广泛应用于病毒诊断其突出优点是: ( 1) 大大提高了样品的反差和分辨力, ( 2 ) 简便易行, 不要求高纯度的样品制备技术; (3 ) 染色不改变生物样品的活性, 即不因染色而造成变形作为一般的病毒诊断和鉴别, 观察其形态特征, 只要采取浸出法即可。
在双蒸水或缓冲液中用刀片切碎感病组织或叶片等, 使病毒游离出来, 形成含有病毒粒子的病汁液, 然后将铜网膜( 电镜样品的支持膜主要有Fomvar 膜、火棉胶膜和碳膜等) 膜面朝下蘸取病汁液, 用滤纸吸去余液, 在铜网膜面不干不湿的情况下, 滴加染液1滴( 浓度为2% ) , 染1一2min, 再用滤纸吸净染液, 晾干后在透射电镜下观察。
对于提纯的病毒, 可稀释后直接用铜网蘸取、染色, 进行电镜观察。
2 超薄切片技术超薄切片技术是专为在透射电镜下观察和研究生物细胞亚显微结构与功能而实施的整套样品前处理方法，3它虽与光学显微镜下石蜡切片的制备技术相仿, 但更具有适合于电镜要求的特点:（1）由于电子束穿透能力弱, 样品必须做成超薄切片,厚度限定在50-100 n m, 这只有在超薄切片机上才能完成;(2)样品必须在电镜的高真空、电子束穿透和热辐射条件下保持稳定, 这就要求样品制备中选择适宜的包埋剂以起到骨架作用, 并需有支撑样品的具膜铜网; (3)样品必须能真实地、完整地保存其生活状态的微细结构, 在样品制备过程中严格遵循已成熟的操作方法植物超薄切片样品的常规制备程序如下。
2.1 取材取新鲜叶片或组织, 用锋利的刀片切成lmmX10mm小条或lmm3小块,尽快地(2一3s)投入冷的固定液中。
2.2 固定大部分植物材料都采用戊二醛一四氧化饿双固定法即先用2.5% 戊二醛溶液做预固定, 针筒抽气, 样品沉舜后置4 ℃冰箱2 4 h 至1 个月, 用缓冲液漂洗3 次, 每次15min, 用2% 四氧化饿溶液做后固定, 置4 ℃下2一6h, 再用缓冲液漂洗3次, 每15min。
2.3 脱水常用的脱水剂为乙醇,一般采用梯度脱水法,乙醇的浓度和脱水时间逐渐增大,即30%15min，50% 15min , 70%在4℃下过夜,80% 20min ,90% 30min,100% 60min,再100% 120min。
2.4 置换由于乙醇不易与包埋剂相混溶,在转入包埋剂前, 要用环氧丙烷过渡, 即用环氧丙烷逐步取代乙醇, 乙醇与环氧丙烷的比例及处理时间为1:1时25min ,o:1时15min ,再0:1时15min。
2.5 渗透将样品置入环氧丙烷和包埋剂混合物中逐步渗透, 环氧丙烷与包埋剂的比例及渗透时间为1:1时2h,1:3时4h,0:1时36一48h,使样品进入纯包埋剂中渗透。
2.6 包理用牙签从包埋剂中挑出样品, 放在药用胶囊的底部, 然后向囊中注满包埋剂包埋。
2.7 聚合将包埋好的材料置于恒温箱中,逐级升温聚合, 聚合时间为37 ℃ 24h，45 ℃24h,60℃24h。
2.8 修块用修块机将包埋块修成表面平齐的梯形样品头, 约0.2一0.5mm,以除去组织周围多余的包埋介质,利于切片。
2.9 切片用超薄切片机切出厚度为50一1O0nm的切片,漂浮于水槽液面上。
2.10 捞片用镊子夹住铜网边缘, 使膜面向下, 直接在液面上沾取切片。
2.11 染色通常使用醋酸铀、柠檬酸铅双染色先用2%醋酸铀染色30min,水洗5次,每次10s。
再用柠檬酸铅染色15min,水洗5次,每次1 0s。
然后将铜网放在干净的滤纸上, 自然干操后, 即可进行电镜观察。
3 免疫电镜技术应用免疫电子显微镜技术,对植物病毒进行诊断们鉴定等方面的研究, 近来毒学界颇受重视。
免疫电镜观察是一项很为迅速和灵敏的血清学电镜技术，此法除需要使用电子显微镜外,其他供试的植物病毒样本和同源抗血清等,所需均为微量,操作时间很短,准确性也很高,因此优点颇为突出。
免疫电镜的使用可概分为两类:第一类是从固定的超薄切片材料中观察病毒粒子的免疫反应; 第二类则是对微粒体材料的观察, 特另像对病毒粒体那样一些制备物的观察是很快速有效的。
此外如免疫细胞学方面组织解剖的免疫电镜技术,也是很灵敏的技术之一。
如将经标记的抗体像染色剂一样来应用,当与抗原吸附后则对细胞的观察有增效的效应。
最普通的标记物如铁蛋白也有使用酶标记的碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等。
植物病毒的免疫电镜是利用植物病毒特异性的抗体,使它诱捕或包被病毒的粒体,产生免疫吸附反应,将此程序制备的载网,放到电子显微镜中观察,选取反应良好的视野。
这种方法可以获得比一般电镜观察更为明显易于分辨的影像。
在载网上植物病毒粒体—抗体的复合作用,会产生一种凝集现象, 所用病毒悬浮液中,病毒粒体含量有时仅只106 ,这样的浓度是相当稀的,但已有很好的凝集反应。
当然免疫电镜虽是诊断鉴定病毒的新技术和重要手段之一, 但用于植物病毒测定的新技术以及基本方法还有很多,他们均各自具有其用途特点,在不同情况下仍然是需要的。
近来,国内外有关专业的教育和研究机构里, 电子显微镜的设置逐渐增多,开展免疫电镜诊断鉴定病毒粒体的条件愈来愈好。
科技发达的美,英, 德,日,法等国,很多植病教学和研究单位,大都设置了电镜有时为了仪器的充分利用,几个系或专业联合规定使用人和范围,充分沟通了仪器的合理刊用,促进了新技术的发展。
法国农科院凡尔赛农研中心, 曾多次举办全国植物病毒免疫电镜社术讲座及交流。
法国阿维农研究中心, 已运用免疫电镜诊断了洋葱病毒、马铃薯丫病毒黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草及疏菜上的烟草花叶病毒(TMV)等效果是很好的, 美国研究亦不少。
应用免疫电镜诊断苹果褪绿叶斑病和洋李痘疤病毒亦很有效。
有些木本植物的病毒粒体在电镜下观察也很困难, 但采用免疫电镜技术后,在载网的每个方格里, 都可看清被抗血清“装饰”得宽厚的病毒粒体。
利用免疫吸附电镜检视多种线虫传多面体病毒, 要比常规电镜观察灵敏约1000倍,当然比之接种指示植物的生物测定快速而灵敏。
Shukal等(1984)应用免疫电镜对甘蔗花叶病毒的4个澳洲株系和TMV株系, 能做出较好的区分和确定。
新疆哈密瓜病毒采用免疫电镜诊断,所用供试病叶小到2毫米2 大小,所用滴加于载网的抗血清仅需2微升容量, 捕捉病毒粒子的情况亦颇良好。
一些报道提出利用蛋白质A容易和抗体中r球蛋白吸附的特性,使抗体捕捉抗原的能力显著增强。
有时须鉴定的试材很少, 应用免疫电镜来检测和观察时,几乎只有1毫米2的病叶也仍然可以测定。
在免疫电镜检侧时, 通常使用一般的抗血清即可, 若用纯化的特异性强的抗血清自然效果会更好。
一般并不需要像在微皿板上进行酶联免疫吸附测定(ELSIA)那样, 需要使用酶标抗体标记。
免疫电镜的测定时间也短,一般只需一小时左右。
这里主要介绍抗原一抗体直接作用的电镜观察, 即悬浮态病毒粒子的免疫电镜方法,主要有凝集法捕获法、装饰法和免疫胶体金法等。
植物病毒研究中最常用的是捕获法和装饰法。
3.1 捕获法抗血清(抗体)包被铜网膜面朝下,浮于适度稀释(1:100或1：1000) 的抗血清液滴上,室温或37 ℃下30min ,用缓冲液20滴冲洗铜网,滤纸吸干。
铜网膜为均匀的一薄层抗体所包被。
病毒( 抗原) 孵育铜网膜面朝下浮于病毒榨汁或提纯液滴上,室温或37 ℃下30一60min，包被在铜网膜上的抗体就会有特异性地吸附大量病毒粒子, 随即用20滴缓冲液和30滴蒸馏水连续冲洗铜网,滤纸吸干。
负染色杆、线状病毒用2%磷钨酸,球状病毒用2 %醋酸铀染色2一3min滤纸吸干。